Gli autori ringraziano il sostegno finanziario offerto dalla Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) attraverso il centro di ricerca in collaborazione SFB 578 &quot;dal gene al prodotto&quot; presso la Technische Universität Braunschweig, in Germania.

1. Reattore di installazione e avvio di coltivazione 4 coltivazioni bioreattore in totale sono condotte. <ol><li> Utilizzare un bioreattore 3 serbatoio L agitata con un volume di lavoro di 2,2 L per la coltura di A. niger SKAn1015. </li><li> Versare monoidrato 72,6 g di glucosio nel reattore e riempirlo con 1,9 L di acqua deionizzata. </li><li> Installare l&#39;apparecchiatura reattore 3, come diaframmi, a due a sei pale della girante della turbina del disco, un elettrodo di pH, un ingresso di gas con filtro aria, un dito di raffreddamento, un dispositivo di raffreddamento dell&#39;aria di scarico con filtro aria, un tubo di immersione per il campionamento sterile con filtro aria e tubi di carico per mezzo, inoculo, acidi e basi. </li><li> Autoclavare il reattore a 121 ° C per 20 min. </li><li> Collegare il reattore con l&#39;acido-base del serbatoio (2 M HCl, 2 M NaOH) e le pompe corrispondenti e impostare un valore del pH di 5,0 ± 0,05 con l&#39;unità di controllo del pH. </li><li> Collegare il reattore con l&#39;acqua di raffreddamento del sistema e mettere la camicia di riscaldamentoattorno al reattore. </li><li> Installare il sensore di temperatura con unità di controllo corrispondente e impostare una temperatura di 37 ± 0,1 ° C presso l&#39;unità di controllo della temperatura. </li><li> Montare il motore agitazione cima del reattore e portare in servizio con una velocità di agitazione di 200 min -1. </li><li> Aggiungere la sterile minima quantità di terreno di crescita 11 attraverso uno dei tubi di alimentazione sterili (250 mL). Per la preparazione mezzo tutti i componenti sono stati sterilizzati in autoclave a 121 ° C per 20 minuti e mescolati insieme. Per tre colture i componenti includono talco in polvere (3MgO • • 4SiO 2 H 2 O) nelle concentrazioni di 1 g / L (reattore 2), 3 g / L (reattore 3) e 10 g / L (reattore 4). Prima dell&#39;uso, risospendere le microparticelle in tampone sodio acetato 50 mM (pH 6,5) e aggiungere al mezzo sterile. In colture di controllo (senza particelle) sostituire la sospensione micro particelle di tampone di acetato di sodio 50 mM (pH 6,5). </li><li> Aggiungere la sospensione di spore (inoculo) as preparati in Wucherpfennig et. al (2011) 11 attraverso uno dei tubi di alimentazione sterili (50 mL) in modo che la concentrazione di spore pari a 1x10 6 mL -1. L&#39;inoculazione segna l&#39;inizio della coltivazione (h = 0 h). </li><li> Avviare l&#39;aerazione con un tasso di 1,0 L min -1. </li></ol> 2. Campionamento sterile dopo 24, 48 e 72 ore di coltivazione <ol><li> Prendere 50 ml di brodo di coltura sterile in un tubo flacone. </li><li> Utilizzare campione per la determinazione del peso biomassa secca, β-fructofuranosidase attività e analisi microscopica. </li></ol> 3. Determinazione del peso biomassa secca dopo 24, 48 e 72 ore di coltivazione <ol><li> I campioni di biomassa devono essere prelevati almeno in doppio. </li><li> Peso un filtro di cellulosa con una bilancia micro dopo l&#39;essiccazione in un essiccatore e posizionare il filtro in un imbuto Buchner con collegata a getto d&#39;acqua pompa da vuoto. </li><li> Filtrare un volume di campione definito (ad esempio 10 mL) and risciacquare il filtro con 10 mL di acqua deionizzata per rimuovere i composti medi dalla biomassa. </li><li> Wrinkle il filtro una volta al centro, collocarlo in un piatto di vetro Petri e metterla in un essiccatore vano fino a quando la costanza di peso (almeno 24 h). </li><li> Raffreddare il filtro in un essiccatore e misurare il peso. </li><li> Calcolare il peso secco biomassa come la differenza tra il peso del filtro con e senza biomassa essiccata diviso per il volume del campione utilizzato. </li></ol> 4. Determinazione dell&#39;attività enzimatica extracellulare del β-fructofuranosidase da GOD / POD-saggio dopo 24, 48 e 72 h di Coltivazione Conservare i campioni sul ghiaccio mentre si lavora costantemente con loro. <ol><li> Filtro 1,5 mL sospensione attraverso cultura un acetato di cellulosa filtro premendo la sospensione cultura con una siringa attraverso il filtro in un tubo di reazione. Conservare il tubo di reazione a -20 ° C fino utilizzo. </li><li> Per utilizzare la miscela di reazione 20microlitri del campione e aggiungere 200 pl di saccarosio 1,65 M sciolto in tampone fosfato 0,05 M (pH 5,4) per innescare la reazione di saccarosio al glucosio. Cary la reazione almeno in doppio. </li><li> Incubare la miscela di reazione a 40 ° C per 20 min in un blocco riscaldante. Arrestare la reazione mediante incubazione a 95 ° C per 10 min in un blocco riscaldante. Raffreddare il miscuglio di reazione mediante archiviazione su ghiaccio e centrifugare l&#39;acqua condensata per centrifugazione a 13,000 g per 10 min a 4 ° C. </li><li> Per tener conto del pH e scissione dipendente dalla temperatura di saccarosio in glucosio, effettuare un valore vuoto utilizzando 20 microlitri di acqua deionizzata, invece di campione di 20 microlitri. </li><li> Per tenere conto glucosio residuo nel brodo di coltura, effettuare un controllo negativo per ciascun campione. A tal fine uso 20 pl del campione e inattivare β-fructofuranosidase mediante riscaldamento a 95 ° C per 10 minuti prima di aggiungere il saccarosio e incubare come descritto al punto 4.3. </li><li> Diluire i campioni in modo tale che gli accordi multilaterali seguentirato adsorbimento è nell&#39;intervallo valore di taratura. </li><li> Eseguire tutti i test enzimatici in triplice copia. Applicare un campione di 2 pl diluito in un piatto titolo micro bene. Applicare una serie standard di calibrazione sulla piastra titolo micro da ciascuno utilizzando 2 microlitri di dieci soluzioni di glucosio con dieci concentrazioni conoscere diversi (da 1 mM a 15 mM) invece di 2 microlitri del campione. Per la calibrazione dello zero punto usare 2 microlitri di acqua deionizzata, invece di un campione di 2 pl. </li><li> Aggiungere 200 pl della soluzione reagente per ogni pozzetto usando una pipetta multipla. </li><li> Incubare la miscela per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> E conservare la piastrina micro titolo a 6 ° C fino alla misura (poche ore al massimo). </li><li> Misurare l&#39;assorbimento a 450 nm usando un 96 ben Alba lettore di piastre micro e il recupero dei dati software Magellan. Impostare il tempo di miscelazione fino a 5 sec. e il resto fino al 1 sec. </li><li> Aprire la tabella risultato con un foglio di calcolo e costruire una retta di taratura utilizzando la gamma standard: glucose concentrazione = a + b X assorbimento </li><li> Calcolare l&#39;attività: = attività (assorbimento fattore di diluizione X-valore vuoto) X a + b </li><li> Calcolare il β-fructofuranosidase attività calcolando la differenza tra le attività del campione e il controllo appropriato negativo. </li><li> Calcolare la produttività specifica per l&#39;utilizzo successivo, tenendo conto di peso biomassa secca e la β-fructofuranosidase attività 11. </li></ol> 5. Microscopia e analisi delle immagini automatico dopo 72 ore di coltivazione <ol><li> Luogo di circa 3 ml di coltura in sospensione in un piatto di plastica e Petridiluire con soluzione fisiologica di cloruro di sodio fino a quando le strutture morfologiche sono separati. </li><li> Collocare il piatto Petri al microscopio, che dispone di una fotocamera integrata o collegata. Acquisire e salvare circa 100 immagini (Figura 2) di strutture morfologiche per campione. Prestare attenzione che su ogni immagine almeno un oggetto è completamente dipinto. </li><li> Aprire tutte le immagini dello stesso campione con il programma di elaborazione delle immagini ImageJ 12. Convertire le immagini in bianco e nero utilizzando lo strumento processo di &quot;Make Binary&quot; (Figura 2). Per applicare il comando a tutta la serie di immagini utilizza un codice macro come segue. run (,, Make Binary &quot;) </li><li> Aprire le immagini binarie trasformati con ImageJ di nuovo. Calcolare il diametro della forma fattori Feret, area proiettata, perimetro, circolarità, aspect ratio, und solidità rotondità per ogni immagine con l&#39;analizzare &quot;Measurement Set&quot; strumento. Per applicare il comando per un serioes di immagini utilizza un codice macro come segue. eseguire (&quot;8-bit&quot;); eseguire (&quot;Make Binary&quot;); eseguire (&quot;Scale Set ...&quot; &quot;X = distanza conosciuta = 1000 pixel = 1 micron = unità globale&quot;,); eseguire (&quot;Misure Set ...&quot;, &quot;limite di visualizzazione zona perimetrale forma Feret di redirect = decimale None = 3&quot;); eseguire (&quot;analizzare particelle ...&quot;, &quot;size = 10000-Infinity circolarità = 0,00-1,00 show = Contorni display&quot;); Determinare X come il numero di pixel che è correlato a 1000 um creando una linea retta attraverso una barra di scala. Correlare il numero di pixel della linea retta con la lunghezza della barra in scala micron. </li><li> Aprire la tabella contenente i valori risultato fattore di forma per ogni immagine con un foglio di calcolo. Calcolare un numero morfologia come segue per ciascuna immagine. <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023eq1.jpg" /></li><li> Calcolare il valore medio e deviazione standard per il numero di Morfologia tenendo conto di tutte le immagini di un campione. </li&gt; <li> Utilizzare un programma di grafica e di analisi dei dati per la correlazione statistica del numero Morfologia con la produttività specifica e determinare la relazione matematica con la regressione matematica. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Mediante aggiunta di talco micro particelle A. niger Skan 1015 morfologia è cambiata da una morfologia vera pellet ad una morfologia disperse o micelio. Considerando morfologia pellet viene esposto a condizioni standard una morfologia micelio viene creato supplementazione di terreno con 10 g / L di talco micro particelle (Figura 4.). Allo stesso tempo l&#39;attività di β-fructofuranosidase aumenta di circa 3 volte 3-5. Una supplementazione di 1 o 3 g / L di polvere di talco porta ad una morfologia disperso, con una attività fructofuranosidase raddoppiato (Figura 4.). La morfologia delle particelle micro dipendente può essere ampiamente descritto dal Mormorfologia numero che può essere calcolato utilizzando parametri determinati mediante analisi di immagine automatica. Pellets perfettamente tondeggianti e lisce sarà in immagini al microscopio appaiono come cerchi perfetti. Per tali particelle il numero Morfologia ha un valore di 1. Il piccolo frammento di morfologia micelio può essere semplificato come linea unidimensionale producendo un numero morfologia di 0. Tutte le forme intermedie morfologiche come pellet irregolari allungati o grumi pertanto hanno valori compresi tra 0 e 1. Grandi particelle comporta un elevato, fungine particelle con una grande superficie o particelle allungate, in un numero morfologia piuttosto basso 11. In condizioni normali la morfologia nel reattore numero 1 presenta una morfologia circa 0,8. La morfologia in reattore 4 con 10 g / L talco in polvere presenta un Mn di circa 0,1. Il numero Morfologia per reattori 2 e 3, con concentrazioni di polvere di talco 1 e 3 g / L, compreso tra questi due estremi, dimostrando un disperso morfologia. Poiché morfologia delle particelle micro dipendente è strettamente correlata con il β-fructofuranosidase produttività, una correlazione matematica di numero Morfologia e produttività simile alla Figura 5 si ottiene. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig1.jpg" /> Figura 1. Schema generale del disegno sperimentale e la procedura analitica. A. niger è coltivato (con o senza micro particelle) in uno L 3 agitata bioreattore serbatoio per 72 h. Dopo 24, 48 e 72 ha campione viene prelevato per la determinazione del peso biomassa secca e β-fructofuranosidase attività, che vengono nuovamente usati per il calcolo della produttività specifica. Dopo 48 h la morfologia fungina è esaminata al microscopio e caratterizzati mediante analisi di immagine digitale. Relativi parametri di analisi di immagine sono combinati a un numero morfologia, che è correlata con la matematica produttività specifica. <imgalt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4023/4023fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Fasi di elaborazione delle immagini al microscopio per immagini generate al di strutture morfologiche da A. niger. Fase 1: acquisizione di immagini al microscopio. Fase 2: il miglioramento dell&#39;immagine, se necessario. Fase 3: binarizzazione immagini, in bianco e nero (binario) immagine generata in ImageJ. Fase 4: l&#39;immagine binaria viene elaborata da e oggetto indesiderato vengono cancellati. Fase 5: analisi morfologica è condotta con la funzione &quot;Analizza le particelle&quot; del programma ImageJ open source. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig3.jpg" /> Figura 3. Differenti forme morfologiche di A. dipendente dalla concentrazione di particelle aggiunto micro niger. Con la crescente concentrazione di micro particelle aggiunto la dimensione del pellet può essere ridotta con precisione fino a piccoli core-shell pellets, greggi di piccole dimensioni e il micelio, anche liberamente dispersi. Morfologia engineering di Aspergillus niger SKAn1015 dalla supplementazione di micro particelle in coltura sommersa. Senza microparticelle (A), 10 mg / L (B), 0,1 g / L (C), 0,2 g / L (D), 0,3 g / L (E), 0,6 g / L (F), 1,0 g / L (G), 1,5 g / L (H), 2,0 g / L (I), 2,5 g / L (J), 3,0 g / L (K), 3,5 g / L (L), 4,0 g / L (M ), 4,5 g / L (N), 5,0 g / L (O), 10 g / L (P), 15 g / L (Q), 20 g / L (R), 30 g / L (S) e 40-50 g / L (T). Le immagini sono state prese al microscopio ottico dopo 72 ore di coltivazione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig4.jpg" /> Figura 4. Attività Fructofuranosidase in dipendenza della concentrazione di particelle di talco micro 1 g / L (reattore 2), 3 g / L (reattore 3) e 10 g / L (reattore 4). Reattore 1 non è integrato con micro particelle, qui la coltivazione è condotta in condizioni standard. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4023/4023fig5.jpg" /> Figura 5. Rappresentativa buona correlazione (R 2 = 0,91) del Morfologiail numero e la produttività specifica. Il numero Morfologia è tracciata (ascissa) contro la produttività specifica (ordinate). Regressione lineare produce la correlazione esponenziale.

<ol>
	<li>Wucherpfennig, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Applied Microbiology. 72, 89-136 (2010).</li><li>Driouch, H., H&#228;nsch, R., Wucherpfennig, T., Krull, R., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+enzyme+production+by+bio-pellets+of+Aspergillus+niger:+Targeted+morphology+engineering+using+titanate+microparticles.">Improved enzyme production by bio-pellets of Aspergillus niger: Targeted morphology engineering using titanate microparticles.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 462-471 (2012).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+bioprocess+for+production+of+fructofuranosidase+by+recombinant+Aspergillus+niger.">Optimized bioprocess for production of fructofuranosidase by recombinant Aspergillus niger.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 87, 2011-2024 (2010).</li><li>Driouch, H., Roth, A., Dersch, P., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+fungi+in+good+shape:+Microparticles+for+tailor-made+fungal+morphology+and+enhanced+enzyme+production.">Filamentous fungi in good shape: Microparticles for tailor-made fungal morphology and enhanced enzyme production.</a> Bioengineered Bugs. 2, 100-104 (2011).</li><li>Driouch, H., Sommer, B., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+of+Aspergillus+niger+for+improved+enzyme+production.">Morphology engineering of Aspergillus niger for improved enzyme production.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 1058-1068 (2010).</li><li>Kaup, B. -. A., Ehrich, K., Pescheck, M., Schrader, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticle-enhanced+cultivation+of+filamentous+microorganisms:+Increased+chloroperoxidase+formation+by+Caldariomyces+fumago+as+an+example.">Microparticle-enhanced cultivation of filamentous microorganisms: Increased chloroperoxidase formation by Caldariomyces fumago as an example.</a> Biotechnology and Bioengineering. 99, 491-498 (2008).</li><li>Hirayama, M., Sumi, N., Hidaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+fructooligosaccharide-producing+beta-fructofuranosidase+from+Aspergillus+niger+ATCC+20611.">Purification and characterization of a fructooligosaccharide-producing beta-fructofuranosidase from Aspergillus niger ATCC 20611.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 53, 667-673 (2006).</li><li>Rajoka, M. I., Yasmeen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+productivity+of+beta-fructofuranosidase+by+a+derepressed+mutant+of+Aspergillus+niger+form+conventional+and+non-conventional+substrates.">Improved productivity of beta-fructofuranosidase by a derepressed mutant of Aspergillus niger form conventional and non-conventional substrates.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 21, 471-478 (2005).</li><li>Zuccaro, A., G&#195;&#182;tze, S., Kneip, S., Dersch, P., Seibel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailor-made+fructooligosaccharides+by+a+combination+of+substrate+and+genetic+engineering.">Tailor-made fructooligosaccharides by a combination of substrate and genetic engineering.</a> ChemBioChem. 9, 143-149 (2008).</li><li>Huggett, A. S. G., Nixon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+glucose+oxidase,+peroxidase,+and+o-dianisidin+in+determination+of+blood+and+urinary+glucose.">Use of glucose oxidase, peroxidase, and o-dianisidin in determination of blood and urinary glucose.</a> The Lancet. , 270-368 (1957).</li><li>Wucherpfenning, T., Hestler, T., Krull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+engineering+-+Osmolality+and+its+effect+on+Aspergillus+niger+morphology+and+productivity.">Morphology engineering - Osmolality and its effect on Aspergillus niger morphology and productivity.</a> Microb. Cell Fact. 10, (2011).</li><li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (1997).</li><li>Papagianni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+fractal+nature+of+mycelial+aggregation+in+Aspergillus+niger+submerged+cultures.">Quantification of the fractal nature of mycelial aggregation in Aspergillus niger submerged cultures.</a> Microbial Cell Factories. 5, 5 (2006).</li></ol>

Non ho nulla da rivelare.

La modifica della morfologia fungina è stata di interesse nel settore delle biotecnologie in quanto molti decenni. Diversi studi hanno cercato di variare i parametri di processo selezionati come valore di pH, ingresso alimentazione, temperatura, concentrazione di nutrienti medio o inoculo 1, ma soffrono di controllo piuttosto imprecisa e incompleta della morfologia, gli alti costi energetici, effetti di inibizione o instabilità del prodotto, al contrario, l&#39;integrazione di micro particelle permette una progettazione precisa della morfologia fungina messo a punto variazione di dimensione delle particelle e la concentrazione. Questo apre nuove possibilità di utilizzare micro particelle per l&#39;ottimizzazione e per la progettazione su misura di alta morfologia produce in produzione biotecnologica con A. niger e altri microrganismi filamentosi. L&#39;analisi di immagine digitale è un metodo facilmente riproducibile per caratterizzare la morfologia fungina macro. Tuttavia, la varietà di parametri per caratteristiche dimensioni, forma e superficieter delle strutture morfologiche descritte in letteratura fa una rapida valutazione della morfologia fungina complicato. Il numero Morfologia presentato come una combinazione di parametri relativi, evita tale carenza e può essere utilizzato non solo per la caratterizzazione completa di strutture morfologiche, ma anche per diretta correlazione matematica con produttività. Questo rende ancora una volta una stima della produttività dato dalla morfologia e quindi una personalizzazione della morfologia per il processo ha bisogno di possibile. Utilizzando il numero di morfologia, è possibile distinguere tra i vari pellet e morfologie ciuffo 4,5. Per lo sviluppo ulteriore del numero di Morfologia la considerazione della dimensione frattale sembra essere promettente. Una dimensione frattale dà una misura della complessità e massa di riempimento proprietà di un oggetto 13 ed è quindi predestinato per la caratterizzazione olistica di morfologia micelio. Il creation di un alto morfologia del micelio che produce, tuttavia, potrebbe portare a problemi con le prestazioni dei processi in particolare nella coltivazione su larga scala, perché la forma crescita del micelio è stato precedentemente dimostrato che mostra molto maggiore viscosità brodo di coltura 2. Questo porta a problemi di trasferimento di calore e di massa e la formazione di zone stagnanti non misti, che richiedono un ingresso di potenza superiore e rendere la coltivazione più costose da gestire 1. Pertanto il rapporto tra morfologia funghi e brodo di viscosità cultura dovrebbe essere considerato quando si cambia la morfologia e essere incorporate in altri modelli.

Table of Equipment:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Equipment</td>
			<td>
			Company</td>
			<td>
			Catalogue Number/model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			autoclave</td>
			<td>
			Systec</td>
			<td>
			V150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			B&uuml;chner funnel (plastic)</td>
			<td>
			VWR</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose filter (for biomass dry weight)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Filter Discs Grade 389</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for air filtration at reactor)</td>
			<td>
			Sartorius stedim biotech</td>
			<td>
			Midisart 200 PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			cellulose acetate filter (for enzyme activity)</td>
			<td>
			Sartorius Stedim Biotech</td>
			<td>
			Midisart NML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Centrifuge 5415R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Biofuge fresco</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			centrifuge</td>
			<td>
			Heraeus sepatech</td>
			<td>
			Varifuge 3.0R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			compartment dryer (105 &deg;C)</td>
			<td>
			Heraeus</td>
			<td>
			Kelvitran t</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (temperature)</td>
			<td>
			Jumo</td>
			<td>
			Jumo iTron 08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			control unit (pH-value)</td>
			<td>
			meredos</td>
			<td>
			pH Control 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			desiccator</td>
			<td>
			Duran</td>
			<td>
			Vacuum stable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Falcon tubes</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			FALC352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 40 &deg;C</td>
			<td>
			Biometra</td>
			<td>
			TB1 Thermoblock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			heating block 95 &deg;C</td>
			<td>
			HLC</td>
			<td>
			HBT 130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro plate reader</td>
			<td>
			Tecan</td>
			<td>
			Sunrise-Microplate-Reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro scales</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 225</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			microscope (digital inverted)</td>
			<td>
			AMG</td>
			<td>
			EVOS xl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro pipettes and tips (different sizes)</td>
			<td>
			Omnilab</td>
			<td>
			5283303
			5283298 
			5283299 
			5283300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			micro titer plate</td>
			<td>
			Nunc</td>
			<td>
			MaxiSorp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			multi pipette and tips</td>
			<td>
			Eppendorf/ Omnilab</td>
			<td>
			5283611/ 5283611</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			pH-electrode</td>
			<td>
			Schott</td>
			<td>
			pH-Meter CG840</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reaction tubes</td>
			<td>
			Roth</td>
			<td>
			E518.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			scale</td>
			<td>
			Sartorius</td>
			<td>
			CP 3202 S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			stirred tank bioreactor with equipment</td>
			<td>
			Applikon Biotechnology</td>
			<td>
			2L Bioreactor set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			syringe</td>
			<td>
			Eppendorf</td>
			<td>
			Combitips Plus 5 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Reagents:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Name of the reagent</td>
			<td>
			Company </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Acetic acid</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose monohydrate, (&alpha;-D-)</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose oxidase (Typ II from Aspergillus niger)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrochloride acid (37 % w/v)</td>
			<td>
			Fiedel-de Ha&euml;n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Hydrous magnesium silicate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Monopotassium phosphate</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			o-dianoisidine dihydrochloride</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Peroxidase (Typ II from horseradish)</td>
			<td>
			Sigma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium acetate</td>
			<td>
			Roth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sodium hydroxide</td>
			<td>
			Merck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Sucrose, D-(+)</td>
			<td>
			Fluka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Water (deionized)</td>
			<td>
			-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table of Solutions and Medium Composition:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>
			Solution</td>
			<td>
			Components</td>
			<td>
			Amount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			50 mM sodium acetate buffer (pH 6.5)</td>
			<td>
			Sodium acetate
			Bring to volume with deionized water
			Adjust at pH 6.5 with acetic acid</td>
			<td>
			4.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			Monopotassium phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			6.805 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>
			Disodium hydrogen phosphate
			Bring to volume with deionized water</td>
			<td>
			7.1 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 7.0)</td>
			<td>
			0.05 M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			61.2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			0.05 M phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			0.05M disodium hydrogen phosphate solution
			Bring to volume with 0.05 M monopotassium phosphate solution</td>
			<td>
			3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			1.65 M sucrose solution</td>
			<td>
			D-(+)-sucrose
			Bring to volume with phosphate buffer (pH 5.4)</td>
			<td>
			564.8 g L-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			reagent solution</td>
			<td>
			o-Dianisidin-Dihydrochlorid
			Ethanol (95%)</td>
			<td>
			25 mg
			10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>
			Glucose reagent solution</td>
			<td>
			Glucose oxidase
			Peroxidase
			Phosphate buffer (pH 7.0)
			reagent solution</td>
			<td>
			10.5 mg
			3 mg
			90 mL
			10 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

customization of aspergillus niger morphology through addition of talc micro particles

Il fungo filamentoso A. niger è un ceppo ampiamente utilizzato in una vasta gamma di processi industriali, dal cibo all&#39;industria farmaceutica. Una delle caratteristiche più intriganti e spesso incontrollabili di questo organismo filamentoso è la sua complessa morfologia. Si va da fitte palline sferiche di viscosa miceli (Figura 1). Vari parametri di processo e gli ingredienti sono noti influenzare la morfologia fungina 1. Poiché la produttività ottimale è strettamente correlato con un modulo specifico morfologica, la morfologia fungina rappresenta spesso il collo di bottiglia della produttività nella produzione industriale. Un approccio semplice ed elegante per controllare con precisione la forma morfologica è l&#39;aggiunta di particelle inorganiche insolubili micro (come silicato di magnesio idrato, ossido di alluminio o di ossido di titanio silicato) al mezzo di coltura che contribuiscono alla produzione enzimatica aumentata 2-6. Poiché vi è un obvious correlazione tra la morfologia delle particelle micro dipendente e la produzione di enzimi che è opportuno collegare matematicamente la produttività e l&#39;aspetto morfologico. Quindi una precisa descrizione quantitativa e olistica morfologica si rivolge. Così, presentiamo un metodo per generare e caratterizzare micro particelle strutture dipendenti morfologiche e di correlare morfologia fungina con produttività (figura 1) che contribuisce eventualmente ad una migliore comprensione della morfogenesi di microrganismi filamentosi. Il ceppo ricombinante A. niger SKAn1015 è coltivato per 72 ore in una L 3 mosse bioreattore serbatoio. In aggiunta di talco micro particelle in concentrazioni di 1 g / L, 3 g / L e 10 g / L prima dell&#39;inoculo una varietà di strutture morfologiche viene generato riproducibile. I campioni sterili sono presi dopo le ore 24, 48 e 72 per la determinazione del progresso crescita e l&#39;attività dell&#39;enzima prodotto. Ilprodotto formato è ad alto valore dell&#39;enzima β-fructofuranosidase, uno biocatalizzatore importante per la neo-formazione di zuccheri negli alimenti o nell&#39;industria farmaceutica, che catalizza la reazione tra gli altri di saccarosio in glucosio 7-9. Pertanto, la quantificazione del glucosio dopo l&#39;aggiunta di saccarosio implica la quantità di prodotto β-fructofuranosidase. Quantificazione glucosio viene effettuata da un GOD / POD-test 10, che viene modificato per analisi ad alta produttività in 96-well micro piastre titolo anticorpale. Morfologia fungina dopo 72 ore viene esaminato al microscopio e caratterizzata da analisi di immagine digitale. In tal modo, i fattori di forma di particelle per la morfologia macro fungine come diametro Feret, area proiettata, perimetro, circolarità, aspect ratio, und solidità rotondità sono calcolati con l&#39;open source del programma di elaborazione delle immagini ImageJ. Parametri rilevanti sono combinati ad un numero adimensionale morfologia (Mn) 11, che consente una caratterizzazione completamorfologia fungina. La stretta correlazione del numero di Morfologia e la produttività sono evidenziati con la regressione matematica.

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Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

Un metodo per generare con precisione e caratterizzare completo morfologia di fungo filamentoso<em&gt; Aspergillus niger</em&gt; È descritto, che consente la correlazione matematica di aspetto morfologico e della produttività.

Personalizzazione di Aspergillus niger Morfologia attraverso l&#39;aggiunta di talco micro particelle

The filamentous fungus A. niger is a widely used strain in a broad range of industrial processes from food to pharmaceutical industry. One of the most ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Customization of Aspergillus niger Morphology Through Addition of Talc Micro Particles

18.8K Views.  Technische Universität Braunschweig. Un metodo per generare con precisione e caratterizzare completo morfologia di fungo filamentoso Aspergillus niger È descritto, che consente la correlazione matematica di aspetto morfologico e della produttività.

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Packaging HIV- or FIV-based Lentivector Expression Constructs &amp; Transduction of VSV-G Pseudotyped Viral Particles

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient expression of effectors. Packaging lentiviral expression constructs into pseudoviral particles, however, enables up to 100% transduction, even with difficult-to-transfect cells, such as primary, stem, and differentiated cells. Moreover, the lentiviral delivery does not produce the specific cellular responses typically associated with chemical transfections, such as cell death resulting from toxicity of the transfection reagent 1, 2. When transduced into target cells, the lentiviral construct integrates into genomic DNA and provides stable expression of the small hairpin RNA (shRNA), cDNA, microRNA or reporter gene 3, 4. Target cells stably expressing the effector molecule can be isolated using a selectable marker contained in the expression vector construct such as puromycin or GFP. After pseudoviral particles infect target cells, they cannot replicate within target cells because the viral structural genes are absent and the long terminal repeats (LTRs) are designed to be self-inactivating upon transduction 5, 6.
There are three main components necessary for efficient lentiviral packaging 1, 5, 6, 7. 
1. The lentiviral expression vector that contains some of the genetic elements required for packaging, stable integration of the viral expression construct into genomic DNA, and expression of the effector or reporter. 
2. The lentiviral packaging plasmids that provide the proteins essential for transcription and packaging of an RNA copy of the expression construct into recombinant pseudoviral particles. This protocol uses the pPACK plasmids (SBI) that encode for gag, pol, and rev from the HIV or FIV genome and Vesicular Stomatitis Virus g protein (VSV-G) for the viral coat protein. 
3. 293TN producer cells (derived from HEK293 cells) that express the SV40 large T antigen, which is required for high-titer lentiviral production and a neomycin resistance gene, useful for reselecting the cells for maintenance.
An overview of the viral production protocol can be seen in Figure 1. Viral production starts by co-transfecting 293TN producer cells with the lentiviral expression vector and the packaging plasmids. Viral particles are secreted into the media. After 48-72 hours the cell culture media is harvested. Cellular debris is removed from the cell culture media, and the viral particles are precipitated by centrifugation with PEG-it for concentration. Produced lentiviral particles are then titered and can be used to transduce target cells. Details of viral titering are not included in this protocol, but can be found at:
<a href="http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf" target="_blank">http://www.systembio.com/downloads/global_titer_kit_web_090710.pdf</a> 8.
This protocol has been optimized using the specific products indicated. Other reagents may be substituted, but the same results cannot be guaranteed.

Lentiviral expression vectors are the most effective vehicles for stably expressing different effector molecules or reporter constructs in dividing and non-dividing mammalian cells and whole organisms. Here we provide a protocol on how to package lentivector expression constructs in pseudoviral particles and to transduce target cells using the pseudoviral particles.

Packaging HIV o FIV-based Lentivector costrutti di espressione e di trasduzione del VSV-G Pseudotyped particelle virali

As with standard plasmid vectors, it is possible to transfect lentivectors in plasmid form into cells with low-to-medium efficiency to obtain transient ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Ottimizzazione di un Quantitative Micro-neutralizzazione Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Produzione di particelle pseudotipizzate per studiare la patogenicità coronavirus in un ambiente di livello 2 di biosicurezza

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are cleared from the human lung alveoli by being phagocytosed by innate monocytes and/or neutrophils. This protocol offers a fast and reliable measurement of phagocytosis by flow cytometry using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled conidia for co-incubation with human leukocytes and subsequent counterstaining with an anti-FITC antibody to allow discrimination of internalized and cell-adherent conidia. Major advantages of this protocol are its rapidness, the possibility to combine the assay with cytometric analysis of other cell markers of interest, the simultaneous analysis of monocytes and neutrophils from a single sample and its applicability to other cell wall-bearing fungi or bacteria. Determination of percentages of phagocytosing leukocytes provides a means to microbiologists for evaluating virulence of a pathogen or for comparing pathogen wildtypes and mutants as well as to immunologists for investigating human leukocyte capabilities to combat pathogens.

Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry

This protocol provides a fast and reliable method to quantitatively measure phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by human primary phagocytes using flow cytometry and to discriminate phagocytosis of conidia from mere adhesion to leukocytes.

Misurare la fagocitosi di Aspergillus fumigatus Conidia da parte dei Leucociti Umani utilizzando Flow Cytometry

Invasive pulmonary infection by the mold Aspergillus fumigatus poses a great threat to immunocompromised patients. Inhaled fungal conidia (spores) are ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infezione delle larve di zebrafish con spore di Aspergillus per l'analisi delle interazioni ospite-patogeno

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular deoxyribonucleic acid (ecDNA) is released during different forms of cell death including apoptosis, necrosis, necroptosis, neutrophil extracellular traps (NETs) and pyroptosis. Measurement of this cell death is time consuming with several different biomarkers required to identify the different biochemical forms of cell death. Measurement of ecDNA is generally conducted in serum and urine as a surrogate for renal damage, not in the actual target organ where the pathological injury occurs. The current difficulty in investigating ecDNA in the kidney is the lack of methods for formalin fixed paraffin embedded tissue (FFPE) both experimentally and in archived human kidney biopsies. This protocol provides a summary of the steps required to stain for ecDNA in FFPE tissue (both human and murine), quench autofluorescence and measure the ecDNA in the resulting images using a machine learning tool from the publicly available open source ImageJ plugin trainable Weka segmentation. Trainable Weka segmentation is applied to ecDNA within the glomeruli where the program learns to classify ecDNA. This classifier is applied to subsequent acquired kidney images, reducing the need for manual annotations of each individual image. The adaptability of the trainable Weka segmentation is demonstrated further in kidney tissue from experimental murine anti-MPO glomerulonephritis (GN), to identify NETs and ecMPO, common pathological contributors to anti-MPO GN. This method provides objective analysis of ecDNA in kidney tissue that demonstrates clearly the efficacy in which the trainable Weka segmentation program can distinguish ecDNA between healthy normal kidney tissue and diseased kidney tissue. This protocol can easily be adapted to identify ecDNA, NETs and ecMPO in other organs.

Extracellular DNA (ecDNA) released during cell death is proinflammatory and contributes to inflammation. Measurement of ecDNA at the site of injury can determine the efficacy of therapeutic treatment in the target organ. This protocol describes the use of a machine learning tool to automate measurement of ecDNA in kidney tissue.

Apprendimento automatico supervisionato per la semi-quantificazione del DNA extracellulare in Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Fecal (micro) RNA Isolation

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs from fecal samples of animal and human subjects. The aim is to isolate total RNA with high purity and quantity for downstream analyses such as RNA sequencing, RT-PCR, and micro-array. The advantages of this optimized protocol in the miRNA isolation are capabilities of isolating highly purified RNA products with additional washing steps described, increased quantity of RNA obtained with an improved method in the resuspension of sample, and important tips of decontamination. One limitation is the inability to process and purify larger sample of more than 200 mg as these sample sizes would cause a difficulty in the clear formation of the interphase. Consequently, the large sample size may contaminate the aqueous phase to be extracted as described in the protocol with organic matters that affect the quality of RNA isolated in the end. However, RNA isolates from a sample of up to 200 mg are sufficient for most of downstream analyses.

Fecal micro RNA Isolation

This protocol isolates high quality total RNA from fecal samples of animal and human subjects. A commercial miRNA isolation kit is used with significant adaption to isolate pure RNA with optimized quantity and quality. The RNA isolates are good for most downstream RNA assays such as sequencing, micro-array, and RT-PCR.

Isolamento fecale (micro) RNA

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and immunological tolerance, while in immunocompromised patients, conidia can colonize airways and cause severe invasive respiratory disorders. Various cells in different airway compartments are involved in the immune response that prevents fungal invasion; however, the spatio-temporal aspects of pathogen elimination are still not completely understood. Three-dimensional (3D) imaging of optically cleared whole-mount organs, particularly the lungs of experimental mice, permits detection of fluorescently labeled pathogens in the airways at different time points after infection. In the present study, we describe an experimental setup to perform a quantitative analysis of A. fumigatus conidia distribution in the airways. Using fluorescent confocal laser scanning microscopy (CLSM), we traced the location of fluorescently labeled&#160;conidia in the bronchial branches and the alveolar compartment 6 hours after oropharyngeal application to mice. The approach described here was previously used for detection of the precise pathogen location and identification of the pathogen-interacting cells at different phases of the immune response. The experimental setup can be used to estimate the kinetics of the pathogen elimination in different pathological conditions.

Confocal Laser Scanning Microscopy-Based Quantitative Analysis of Aspergillus fumigatus Conidia Distribution in Whole-Mount Optically Cleared Mouse Lung

We describe the method for quantitative analysis of the distribution of Aspergillus fumigatus conidia (3 &#181;m in size) in the airways of mice. The method also can be used for the analysis of microparticles and nanoparticle agglomerate distribution in the airways in various pathological condition models.

Analisi quantitativa basata su microscopia a scansione laser confocale della distribuzione di conidi di Aspergillus fumigatus nel polmone di topo a montaggio intero otticamente cancellato

Aspergillus fumigatus conidia are airborne pathogens that can penetrate human airways. Immunocompetent people without allergies exhibit resistance and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Analisi di SARS-CoV-2 utilizzando la tecnologia dual-reporter e multiplex

Profiling of Surface Protein Epitopes on Viral Particles by Multiplex Dual-Reporter Strategy

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of viral particles to host cells, host-virus interactions, and disease pathogenesis. Furthermore, viral membrane proteins on virus particles and presented on host cell surfaces have proven to be excellent targets for antivirals and vaccines. Here, we describe a protocol to investigate surface proteins on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) particles using the dual-reporter flow cytometric system. The assay exploits multiplex technology to obtain a triple detection of viral particles by three independent affinity reactions. Magnetic beads conjugated to recombinant human angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) were used to capture viral particles from the supernatant of cells infected with SARS-CoV-2. Then, two detection reagents labeled with R-phycoerythrin (PE) or Brilliant Violet 421 (BV421) were applied simultaneously. As a proof-of-concept, antibody fragments targeting different epitopes of the SARS-CoV-2 surface protein Spike (S1) were used. The detection of viral particles by three independent affinity reactions provides strong specificity and confirms the capture of intact virus particles. Dose-dependency curves of SARS-CoV-2 infected cell supernatant were generated with replicate coefficient variances (mean/SD) &#706;14%. Good assay performance in both channels confirmed that two virus surface target protein epitopes are detectable in parallel. The protocol described here could be applied for (i) high-multiplex, high-throughput profiling of surface proteins expressed on enveloped viruses; ii) detection of active intact viral particles; and (iii) assessment of specificity and affinity of antibodies and antiviral drugs for surface epitopes of viral antigens.The application can be potentially extended to any type of extracellular vesicles and bioparticles, exposing surface antigens in body fluids or other liquid matrices.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Avanzamento delle strategie antivirali attraverso nuove tecniche di immunocattura e spettrometria di massa

Here, we describe a newly developed multiplex fluorescent immunoassay that uses a dual-reporter flow cytometric system to concurrently detect two unique spike protein epitopes on intact severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) viral particles that had been captured by angiotensin-converting enzyme-2-coupled magnetic microspheres.

Profilazione degli epitopi proteici di superficie su particelle virali mediante la strategia multiplex dual-reporter

Membrane proteins on enveloped viruses play an important role in many biological functions involving virus attachment to target cell receptors, fusion of ...