The authors thank Dr. M. Matrosovich for providing the parent MDCK and MDCK-SIAT1 cell lines and Roche Pharmaceuticals for supplying the oseltamivir carboxylate.We also appreciate Dr. Anne Weston for valuable suggestions on the manuscript. This study was dependent upon the valued collaboration of the WHO National Influenza Centres and the WHO CCs within the WHO GISRS, who provided the influenza viruses used. This work was funded by the Medical Research Council through Programme U117512723.

NOTA: Il livello di biosicurezza (BSL) per il seguente protocollo è BSL 2 per i virus dell&#39;influenza stagionale e BSL 3+ per i potenziali virus influenzali pandemici. titolazione virale è richiesto in anticipo di un esperimento di neutralizzazione per decidere la concentrazione virale del controllo virale (VC). 1. Virus Titolazione NOTA: A seconda del numero di virus e il numero di duplicati, una piastra ben può essere impostato con i seguenti flessibilità: (1) La diluizione virale può essere disposti sia lungo le righe o colonne (Figura 1). Ogni virus dovrebbe occupare una riga / colonna separata. (2) L&#39;incremento di diluizione virale è flessibile, ma dovrebbe iniziare con la più alta concentrazione virale nell&#39;angolo in alto a sinistra. (3) Non vi è alcun limite al numero di duplicati. NOTA: Madin Darby rene canino (MDCK) e MDCK-SIAT1 cellule (SIAT) sono stati gentilmente forniti dal Dr. M. Matrosovich, Marburg, Germolti 10. cellule SIAT sono cellule MDCK stabilmente trasfettate con il CMP-N-acetylneuraminate umana: gene beta-galattoside α-2,6-sialyltransferase per una maggiore espressione di acido sialico (SA) oligosaccaridi α2-6Gal-terminati. <ol><li> Cellule aliquote sufficienti MDCK o cellule MDCK-SIAT 8 in piastre da 96 pozzetti (200 pl / pozzetto). Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2 per 2 o 3 giorni per raggiungere la confluenza. Propagare le cellule in DMEM supplementato con 10% inattivato al calore siero fetale di vitello (FCS) e antibiotici (100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina). Incubare le cellule SIAT a 37 ° C con 5% di CO 2 e 1 mg / ml G418 solfato. NOTA: Il fattore di diluizione dipende esperienza e la linea cellulare utilizzato. Il monostrato cellulare deve essere confluenti (cioè, senza parete cellulare o lo schema visibili cellule MDCK e un layout fitto per le cellule MDCK-SIAT1) al momento dell&#39;inoculazione virus. Esempi di diluizioni basano susubcultura dei flaconi confluenti di cellule MDCK o MDCK-SIAT1 sono riportati nella tabella 1. </li><li> Lavare le cellule 3 volte con 200 ml di terreno di coltura dei virus (VGM) per pozzetto. Sterilizzare la rondella targa alveolare con il 70% EtOH per 30 minuti, e poi sciacquare in sterili PBS (PBS) o VGM prima del lavaggio. </li><li> Aspirare il VGM e subito aggiungere 50 ml di VGM in ogni pozzetto. </li><li> Aggiungere 900 pl di VGM a ciascuno dei 6 tubi sterili (o meno, a seconda del numero di virus di prova e duplicati). Dispensare 100 ml di virus nel primo tubo, mescolare bene, e in serie diluire, cambiando le punte tra ogni diluizione. Ripetere l&#39;operazione per ogni virus da titolare. NOTA: Questo darà diluizioni di virus di 10 -1 a 10 -6. </li><li> Aggiungere 50 ml di ciascuna diluizione virus, partendo dalla diluizione massima (1 x 10 -5 in figura 1), nei pozzetti duplicati (colonne 9 e 10 in figura 1) di un 96-pozzetti. </li><li> Posizionare la piastra a 37 ° C per 2-3 ore per consentire al virus di infettare le cellule. NOTA: A incubazione da 2 a 3 ore è necessario per assicurare che i virus del inoculo hanno abbastanza tempo per raggiungere il monostrato. </li><li> Preparare la sovrapposizione (10 ml / piastra) NOTA: La sovrapposizione è costituito da 5 ml di 2x DMEM, tripsina (2 mg / ml concentrazione finale), 20 ml di 1 mg / ml di borsa, e 5 ml di cascami di cotone di cellulosa (vedere l&#39;elenco dei materiali). </li><li> Rimuovere l&#39;inoculo. </li><li> Aggiungere la sovrapposizione (200 ml per ogni pozzetto). Incubare per una notte a 37 ° C, indisturbato. NOTA: Il germogliamento virus avviene dopo circa 4 ore, quindi è importante che la piastra non è disturbata dopo questo tempo. </li><li> Aspirare la sovrapposizione dai pozzi. </li><li> Aggiungere ghiacciata 4% paraformaldeide in PBS A (200 pl / pozzetto). Metterli a 4 ° C per 30 minuti oa temperatura ambiente per 20 min. NOTA: PBS A è naturale pH PBS con 10 gof NaCl, 0,25 g di KCl, 1.437 g di Na 2 HPO 4, 0,25 g di KH 2 PO 4 e 1 L di acqua distillata (vedere l&#39;elenco dei materiali). NOTA: Paraformaldeide è nocivo se inalato e può provocare ustioni in caso di ingestione. C&#39;è anche una limitata evidenza di effetti cancerogeni, e può causare sensibilizzazione dopo contatto con la pelle. </li><li> Aspirare il paraformaldeide e lavare due volte le piastre con PBS A (200 pl / pozzetto). </li><li> Conservare le piastre in PBS A a 4 ° C per un uso futuro, o continuare con i seguenti passaggi. </li><li> Aggiungere buffer di permeabilizzazione (100 l / pozzetto). Lasciare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Lavare piatto due volte con PBS A (200 pl / pozzetto). </li><li> Aggiungere 50 ml di il primo anticorpo, Mab topo contro l&#39;influenza di tipo A (1: 1.000 in ELISA buffer), per pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora (o 4 ° C durante la notte), con agitazione. </li><li> Lavare 3 volte in 100 ml di tampone di lavaggio (0,05% Tween 80 in PBS A, v / v) pER bene. Incubare a temperatura ambiente per 5 min tra un lavaggio. In alternativa, lavare 3 volte senza incubazione con 300 pl per pozzetto. </li><li> Aggiungere 50 ml di secondo anticorpo, capra anti-topo IgG (H + L) coniugato HRP (1: 1.000 in ELISA Buffer), per pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora, con agitazione. </li><li> Lavare 3 volte come descritto al punto 1.17. </li><li> Aggiungere il substrato (50 ul / pozzetto). Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti o fino a quando lo sviluppo di un colore blu è chiaramente visibile. </li><li> Per arrestare la reazione, lavare la piastra due volte con 200 ml di acqua distillata per pozzetto, incubare a temperatura ambiente per 2 -3 min tra i lavaggi. </li><li> Asciugare la piastra e conservarla in un luogo buio (ad esempio, avvolgerla in un foglio di alluminio). </li></ol> 2. Titolazione quantificazione <ol><li> Posizionare una piastra bene nella zona di scansione di uno scanner, come mostrato in Figura 2a. Utilizzare il limite di posizione a forma di L pergarantire una posizione ottimale e ripetibile imaging. NOTA: E &#39;possibile immagine di due pozzetti in una sola scansione. </li><li> Scansione di un&#39;immagine. NOTA: Le impostazioni sono riportate in Tabella 2. </li><li> Eseguire il software &quot;Wellplate Reader&quot; per calcolare la concentrazione di virus richiesta (Figura 3). <ol><li> Fare clic sul pulsante &quot;Carica immagine&quot; per caricare un&#39;immagine. Far scorrere la barra rossa nella istogramma della scheda &quot;soglia globale&quot; per regolare la soglia di campionamento. Fare clic sul pulsante &quot;Aggiorna&quot; per esaminare l&#39;effetto sull&#39;immagine. </li><li> Barrare la casella &quot;Calcola neutralizzazione / Titolazione&quot;. Fare clic sul pulsante &quot;Sampling&quot; per quantificare la ICP. Fare clic sul pulsante &quot;Salva&quot; per salvare i risultati del campionamento quando richiesto. NOTA: Dopo il processo di campionamento, una nuova finestra chiamata &quot;neutralizzazione e titolazione di calcolo&quot; viene visualizzato automaticamente se la casella &quot;Calcola neutralizzazione / titolazione&quot; sia selezionata. </li><li>Caricare o inserire la definizione della mappa ben piatto. Indicare la soglia (ad esempio, 30%) in &quot;Titolazione: Virus Popolazione Ottimale (%)&quot;. Selezionare la scheda &quot;titolazione di processo&quot; per calcolare i risultati di titolazione. Controllare i risultati della titolazione. Fare clic sul pulsante &quot;Salva e chiudi&quot; per salvare i risultati della titolazione. NOTA: Vedere supplementare S1 per istruzioni più dettagliate sul software. Una copia del software su misura è disponibile su richiesta. NOTA: In genere, il miglior diluizioni di virus per le placche di riduzione Tenore circa 50% (20-85%) ICP di cellule totali all&#39;interno di ogni ben 11. </li></ol></li></ol> 3. neutralizzazione del virus NOTA: Calcolare il numero di piastre necessarie per il saggio di neutralizzazione. Ogni piastra può ospitare un virus e un numero di antisieri. NOTA: A seconda del numero di antisieri e il numero di duplicati, una piastra ben può essere impostato con the seguente flessibilità: (1) La diluizione del siero possono essere disposti lungo riga o una colonna (Figura 4). Ogni siero deve occupare una riga o colonna separata. (2) L&#39;incremento di diluizione del siero è flessibile, ma dovrebbe iniziare con la più alta concentrazione sierica nell&#39;angolo superiore sinistro di una piastra. (3) Il numero di duplicati bilancia il numero di antisieri. Più duplicati possono aiutare a smussare le variazioni sperimentali. (4) Il numero di VC e il numero del controllo cellulare (CC) duplicati sono flessibili, ma devono anche essere in righe o colonne separate. Si prevede che il numero di duplicati VC è significativamente maggiore di quello degli antisieri. <ol><li> Preparare il monostrato cellulare, come nei passaggi 1.1-1.3, 2 o 3 giorni di anticipo. </li><li> Aggiungere 50 ml di VGM a ciascun pozzetto della piastra. </li><li> Utilizzare le colonne 11 e 12 per VC e CC, rispettivamente. Aggiungere 50 ml aliquote di 01:20 enzima recettore-distruzione (RDE) siero -treated alla prima riga (A) di Columns 1-10. NOTA: Per ogni combinazione di virus e siero, il test viene eseguito in duplicato, così uno piastra può, ad esempio, contenere un virus testato contro cinque antisieri. </li><li> Eseguire 2-diluizioni seriali con il trasferimento di 50 ml da Riga A remare H (Colonne 1-10 in figura 4) e scartando 50 ml da Riga H. </li><li> Aggiungere 50 ml di diluente in ciascun pozzetto della colonna CC (colonna 12 in figura 4). </li><li> Aggiungere 50 ml di virus in ciascun pozzetto della piastra, tranne per la colonna CC (Colonne 1-11, righe AH in figura 4). </li><li> Incubare a 37 ° C per 2-3 ore. Rimuovere l&#39;inoculo. Aggiungere la sovrapposizione (200 ml) in ciascun pozzetto. Incubare durante la notte a 37 ° C, indisturbato. Fissare e macchiare le piastre come per la titolazione del virus (passi 1,11-1,22). </li></ol> 4. neutralizzazione Quantificazione <ol><li> Posizionare una piastra bene nella zona di scansione di uno scanner, come mostrato in Figure 2a. Utilizzare il limite di posizione a forma di L per garantire una posizione ottimale e ripetibile imaging. NOTA: E &#39;possibile immagine di due pozzetti in una sola scansione. </li><li> Eseguire la scansione del piatto, come descritto al punto 2.2. </li><li> Eseguire il software &quot;Wellplate Reader&quot; per calcolare i titoli virali richiesti (Figura 3, punto 2.3). <ol><li> Fare clic sul pulsante &quot;Carica immagine&quot; per caricare un&#39;immagine. Far scorrere la barra rossa in &quot;soglia globale&quot; per regolare la soglia di campionamento. Fare clic sul pulsante &quot;Aggiorna&quot; per esaminare l&#39;effetto. </li><li> Barrare la casella &quot;Calcola neutralizzazione / Titolazione&quot;. Fare clic sul pulsante &quot;Sampling&quot; per quantificare la ICP. Fare clic sul pulsante &quot;Salva&quot; per salvare i risultati del campionamento quando richiesto. NOTA: Dopo il processo di campionamento, una nuova finestra chiamata &quot;neutralizzazione e titolazione di calcolo&quot; viene visualizzato automaticamente se la casella &quot;Calcola neutralizzazione / titolazione&quot; sia selezionata. </li><li> Carico o ingresso pozzo-pMappa in ritardo. Indicare la soglia (ad esempio, 50%) in &quot;Neutralizzazione: Infection deduzione (%).&quot; </li><li> Selezionare &quot;processo di neutralizzazione&quot; per calcolare i titoli. Controllare i titoli e fare clic sul pulsante &quot;Salva e chiudi&quot; per salvare i risultati di neutralizzazione. NOTA: neutralizzazione viene riportato come il reciproco della diluizione massima del siero con la riduzione predefinito ICP (ad esempio 50% o 80%) contro il VC (la media di colonna 11 in figura 4). Una riduzione ICP 50% è stato utilizzato negli Risultati rappresentativi. </li></ol></li></ol>

<ol>
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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+micro-neutralization+assay+and+its+application+in+antigenic+characterization+of+influenza+viruses.">Optimization of a micro-neutralization assay and its application in antigenic characterization of influenza viruses.</a> Influenza Other Respir Viruses. 9, 331-340 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In questo studio, abbiamo descritto un test MN di imaging-based per quantificare i veri rapporti tra antigeniche dei virus. Rispetto ad altri saggi placca di riduzione, il metodo sottolinea misurando la ICP di un&#39;intera bene, garantendo la completa copertura della popolazione infettivo. L&#39;indipendenza di formazione della placca allarga anche l&#39;applicazione del test di virus che possono formare piccole placche prevalentemente invisibili o che può gestire solo infezione singola cellula. Pertanto, l&#39;analisi è in grado di esaminare più virus e gli effetti di una più ampia gamma di anticorpi diversi da HI, e aiuta a riflettere in modo più completo le somiglianze antigeniche o differenze tra virus 12. Ad esempio, quando oseltamivir carbossilato è incluso, il saggio MN è meno influenzata da NA-legame dipendente, riflettendo le differenze antigeniche più accurato. Durante lo sviluppo del test, grandi sforzi sono stati fatti per migliorare la consistenza esperimento, velocità e rilevamentosensibilità, anche a controllare i virus di ingresso attraverso la titolazione quantificato, immagini in alta produttività con uno scanner piano, e l&#39;implementazione di una piattaforma di elaborazione dei dati di facile utilizzo. I risultati sono stati generalmente in linea con e confermato quelli di HI. In particolare, i risultati hanno inoltre rivelato differenze antigeniche tra varianti deriva antigenica dei recenti virus di tipo A e di vaccini B, così come i cambiamenti antigenici causati da cambiamenti di cultura-selezionato o sporadici, come ad esempio la sostituzione G155E in HA1 di alcuni (H1N1) virus pdm09 A 12. Il protocollo ha trovato il tipo di virus o sottotipo con la selezione di linee cellulari che hanno dato l&#39;infezione più forte, che ha notevolmente migliorato il segnale di imaging. variazione sperimentale è stata lisciata con la progettazione di duplicati che bilanciato con il numero di antisieri testato. Incertezze possono anche venire dalla qualità delle immagini, che è principalmente influenzata dal dispositivo di imaging. Un colore flatbed scanner decente può significantly migliorare il contrasto dell&#39;immagine e ridurre il rumore. La quantità di virus in ingresso nella neutralizzazione deve essere determinata quantitativamente in anticipo dal corrispondente titolazione mentre i virus ancora mantengono uno stato simile. Durante la neutralizzazione, la risposta antisiero un&#39;infezione è normalizzata contro la differenza tra il virus di riferimento (VC) e il livello di fondo (CC). Misure accurate di VC e CC sono essenziali per un esperimento di neutralizzazione. Più duplicati sono raccomandati (otto duplicati sono stati utilizzati nelle Rappresentante dei risultati). Infine, la comprensione del software è di vitale importanza per il successo di un esperimento. Il software è stato testato per la caratterizzazione del virus di routine nella Influenza Centro OMS, Regno Unito per più di due anni. Istruzioni dettagliate per affrontare varie situazioni è previsto nella S1 supplementare. Questo test MN è adatta per applicazioni in cui i campioni coprono un extremely ampio campo di vista, ma solo richiedono Resolution Imaging moderata. Il basso costo e la configurazione semplice rendono il sistema facilmente disponibile alla maggior parte dei laboratori di virologia. La variazione misurazioni dello stesso campione era inferiore al 3%, che definisce circa l&#39;incertezza introdotta durante la scansione 11. Tale riproducibilità è sufficiente in molti studi virologici e può essere ulteriormente ridotto media immagini da più scansioni. In conclusione, questo studio dimostra un test MN robusto che può essere utilizzato di routine nello studio antigenica e per sostenere i dati HI in analisi dettagliate delle attualmente in circolazione virus influenzali, in particolare per la selezione biennale dei virus per l&#39;inclusione in vaccini antinfluenzali umani.

Micro-neutralizzazione (MN) saggi sono utilizzati in virologia per la determinazione quantitativa di anticorpi neutralizzanti e di attività antivirale. Come alternativa di inibizione emoagglutinazione (HI) saggi, saggi MN in grado di superare gli effetti non antigeniche influenzati dai cambiamenti di affinità di recettoriale in virus influenzali, che possono complicare l&#39;interpretazione dei risultati HI 1,2,3. Fino a poco tempo, la maggior parte dei saggi di MN sono stati basati su effetti citopatico (CPE) o metodica immunoenzimatica (ELISA) 4,5. Saggi MN basate sulla riduzione della messa a fuoco e la placca sono stati sviluppati nel 1990 6,7,8. saggi di riduzione delle placche si basano sul conteggio targhe visibili da quantificare infettività. Tuttavia, conta visive coprono solo grandi placche che sono risolvibile occhi umani, anche se la maggior parte delle placche sono piccole e invisibili per molti virus che circolano correnti. Questa copertura incompleta può causare variazioni significative tra gli esaminatori e tra gli esperimenti, che porta a Irisultati ncomparable. È anche possibile utilizzare il metodo quando alcuni virus mostrano infezione abortiva di singole cellule o molto piccole placche. La risoluzione poveri conteggio può essere migliorata con l&#39;introduzione di un protocollo di imaging basata. Con i progressi della tecnologia, la microscopia ottica e high-throughput lettori ben piastre in grado di fornire i mezzi precisi per contare le cellule infette 9. Sotto un microscopio trans-illuminato, cellule infettate taggati con alcuni marcatori possono essere visualizzati con il loro assorbimento o fluorescenza contrasto con risoluzione sub-cellulare. Un campione può essere quindi analizzato sullo schermo del computer. Sfortunatamente, a causa della limitazione del campo di vista, più di cento immagini affiancate necessari per coprire un singolo pozzo. Analizzando una piastra con 96 pozzetti richiederebbe l&#39;immagine e l&#39;elaborazione di circa diecimila immagini. Tale processo laborioso è lunga e costosa, e la risoluzione acquisita è nei generil inutili per la caratterizzazione di routine delle infezioni virali. Laboratori con un budget limitato possono trovare che l&#39;approccio costruito intorno uno scanner piano prevede un costo-efficacia, high-throughput alternativa. In questo articolo, descriviamo un test MN riduzione delle placche perfezionato che è adatto per la caratterizzazione antigenica di un gran numero di virus e per misurare quantitativamente attività antivirali e anticorpi di neutralizzazione. Il test ha diversi vantaggi: in primo luogo, si tratta di un test di imaging-based che è in grado di misurare infezioni da virus a livello cellulare, indipendentemente dalle dimensioni della placca. Contando la popolazione cellulare infettata totale (ICP) all&#39;interno di un pozzo aumenta notevolmente la sensibilità di rilevamento, rendendo possibile caratterizzare i virus a bassa infettività. In secondo luogo, una titolazione quantitativa più accurata è introdotto prima della neutralizzazione per determinare la quantità di virus in ingresso. Il virus di ingresso quantitativa riduce significativamente il variazione tra i diversi esperimenti e rende i risultati più comparabili tra laboratori. In terzo luogo, titoli di neutralizzazione possono essere determinati direttamente analizzando le immagini, rendendo la quantificazione rapida e user-friendly. Infine, il protocollo prevede un costo-efficacia e high-throughput alternativa con la risoluzione e la precisione richiesta. La quantificazione è basata su uno scanner piano e software di elaborazione dati libera. L&#39;intero setup ha un ingombro ridotto ed è implementabile nella maggior parte dei laboratori. Il protocollo presentato in questo documento si compone di quattro fasi principali, tra cui titolazione del virus, la titolazione quantificazione, neutralizzazione del virus, e la neutralizzazione quantificazione. Virus titolazione è un esperimento preparazione che determina la quantità di virus in ingresso da utilizzare in neutralizzazione. Durante una titolazione, un numero di concentrazioni virali sono applicati ai monostrati di cellule in una piastra da 96 pozzetti. Le cellule infette sono poi quantificati nella sezione 2. La diluizione viralezione che produce il 20% -85% ICP viene a sua volta applicato come virus di ingresso alla neutralizzazione corrispondente sezione 3. I titoli del protocollo di neutralizzazione vengono quantificati utilizzando la sezione 4. Gli esperimenti che hanno seguito i protocolli di cui sopra sono presentati nelle Rappresentante dei risultati. Il test è stato testato a fondo nel corso degli ultimi due anni con la maggior parte degli attuali virus influenzali circolanti, come A (H1N1) pdm09, A (H3N2), e virus B. I risultati della caratterizzazione virus dell&#39;influenza sono stati inclusi nelle relazioni per la riunione di consultazione dell&#39;OMS che ha dato dei consigli su vaccini antinfluenzali per l&#39;uso nel sud del mondo nel 2016 e nell&#39;emisfero settentrionale nel 2016-2017.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1115">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">VGM</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">D6429, P0781</td>
			<td style="width:383px;">500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">PBS A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl - 0.25 gm, Na2HPO4 - 1.437 gm, KH2PO4 &#8211; 0.25 .gm, and Dist. Water &#8211; 1 L.</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">Avicell</td>
			<td style="width:172px;">FMC</td>
			<td style="width:383px;">RC-581F</td>
			<td style="width:383px;">2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">2XDMEM</td>
			<td style="width:172px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:383px;">21935-028</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Trypsin</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">T1426</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:177px;">Overlay (10ml/plate):</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td style="width:383px;"></td>
			<td style="width:383px;">5ml 2X DMEM, Trypsin 2&#956;g/ml final conccentration,Avicell&#160; - 5ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Triton X- 100e</td>
			<td style="width:172px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:383px;">T8787</td>
			<td style="width:383px;">Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Tween 80</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">P5188</td>
			<td style="width:383px;">&#160;Wash Buffer: 0.05% Tween &#8211; 80 in PBS A (v/v)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:177px;">Horse serum</td>
			<td style="width:172px;">PAA Labs Ltd</td>
			<td style="width:383px;">B15-021</td>
			<td style="width:383px;">ELISA Buffer: 10%&#160; in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Mouse MAb against influenza type A</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">MCA 400</td>
			<td style="width:383px;">1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate</td>
			<td style="width:172px;">Biorad</td>
			<td style="width:383px;">172-1011</td>
			<td style="width:383px;">2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">True Blu peroxidase substrate</td>
			<td style="width:172px;">KPL&#160;</td>
			<td style="width:383px;">50-78-02</td>
			<td style="width:383px;">Substrate:&#160; True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution)</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">96-well flat-bottom microtitre plates</td>
			<td style="width:172px;">Costar&#160;</td>
			<td style="width:383px;">3596</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:177px;">8 channel multiwall-plate washer and manifold</td>
			<td style="width:172px;">Sigma</td>
			<td style="width:383px;">M2656</td>
			<td style="width:383px;"></td>
		</tr>
		<tr height="104">
			<td height="104" style="height:104px;width:177px;">Perfection Plate Scanner</td>
			<td style="width:172px;">Epson</td>
			<td style="width:383px;">V750 Pro</td>
			<td style="width:383px;"><a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp;infoType=Downloads.">The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&#38;infoType=Downloads.</a></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:177px;">Software operational environment: LabVIEW</td>
			<td style="width:172px;">National Instruments Corporation</td>
			<td style="width:383px;">Window based with NI Vision builder</td>
			<td style="width:383px;">Version: LabVIEW2012 or above</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of a quantitative micro-neutralization assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

Seguendo le procedure di cui sopra, vi presentiamo alcuni risultati di recenti esperimenti caratterizzazione antigenica. La messa a punto di titolazione è stato progettato per esaminare otto virus in ingresso, con doppi duplicati per ogni diluizione. Le diluizioni virali sono stati testati tra 1,0 x 10 -1 e 1,0 x 1,0 -6 per coprire le variazioni tra i virus. I virus di prova erano dal sottotipo H3N2, tra cui A / Camerun / 15V-3538/2015, A / Vladivostok / 36/2015, A / Mosca / 103/2015, A / Tomsk / 5/2015 /, A / Mosca / 101 / 2015, A / Mosca / 100/2015, A / Mosca / 133/2015, e A / Bratislava / 437/2015. I risultati della titolazione sono illustrati nella Figura 5. Figura 5d mostra la diminuzione del PIC con l&#39;aumento della diluizione virus. Le curve sono state normalizzate contro i PIC dello stesso virus che ha dato infezioni in tutte le celle all&#39;interno di un pozzetto 12 (definiti come ICP saturazione). Se la ICP non ha raggiunto la saturazione con l&#39;hiconcentrazione di virus Ghest, la media ICP da duplicati corrispondenti è stato utilizzato invece (A / Mosca / 103/2015 figura 5d). Le diluizioni di virus che hanno prodotto il 30% di saturazione ICP sono stati scelti come la diluizione del virus ingresso per la neutralizzazione (Tabella 3). La neutralizzazione l&#39;obiettivo di avere un ingresso di virus contro cinque antisieri, con doppio duplicati su ogni piatto. Il virus di riferimento indicato è H3N2 A / Stoccolma / 63/2015. I cinque antisieri sono A / HK 4801/14 Egg F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Sud Africa r2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / Swiss 9.715.923 tredicesimi SIAT NIBF F18 / 15, e A / olandese 525/14 SIAT F23 / 15. I risultati di neutralizzazione vengono illustrati nella Figura 6. Figura 6d mostra il progresso dell&#39;infezione con l&#39;aumento della diluizione del siero. Nella frazione normalizzata positiva sull&#39;asse verticale rappresenta il rapporto PIC dalla risposta antisieri corrispondenti contro la media ICPdel virus di riferimento 12. Lo sfondo ICP dai controlli di cellule non infette è stata sottratta durante la normalizzazione. I titoli di neutralizzazione sono stati determinati come reciproci dei diluizione di antisiero corrispondenti alla riduzione ICP% 50 (Tabella 4). L&#39;interpolazione lineare è stato utilizzato per stimare i titoli rientranti tra due diluizioni di siero adiacenti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> Figura 1: Esempio di una configurazione ben piatto in un esperimento di virus titolazione. virus di prova vengono assegnati a righe separate (da A a H). Le colonne sono progettati per diverse diluizioni virali (1 a 12). Due colonne sono stati usati come duplicati per ogni diluizione virale. Barra di scala = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 2: Schema di un sistema di scansione del campione. (A) Una piastra a 96 pozzetti sulla posizione di imaging di uno scanner piano (ripubblicato da riferimento 11 con il permesso di Elsevier), e (b) dimensioni del limite di posizione L-forma mostrata in (a). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> Figura 3: Schema desktop del software quantificazione &quot;Wellplate Reader&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> Figura 4: Esempio di una configurazione a micropiastre in un esperimento di neutralizzazione. Ogni antisiero è assegnato a due colonne con i duplicati (da 1 a 10). Le righe sono progettati per diverse diluizioni di siero (da A a H). Il controllo del virus prende Colonna 11, con otto duplicati (A11 a H11). Il controllo cella è nella colonna 12, con otto duplicati (A12 a H12). Barra di scala = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> Figura 5: risultati di un esperimento di titolazione. (A) Il setup ben piatto, (b) la scansione ben piatto di immagine, (c) Illustrazionedel, quantificato, popolazione di cellule infettate da virus-colore-codificati, e (d) normalizzati popolazioni di cellule infettate da virus contro diluizioni di virus. 30% ICP è stato usato come soglia. Le barre di errore in (d), sono deviazioni standard (SD) delle duplicazioni del campione (± 1 SD). Barre di scala in (b) e (c) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> Figura 6: I risultati di un esperimento di neutralizzazione. (A) Il setup ben piatto, (b) immagine ben piatto, (c) illustrazione della, popolazione di cellule infette da virus quantificato, e (d) normalizzata popolazione cellulare infettato da virus contro la diluizione del siero digitalizzata. Il VI di ingressorus (VC) è A / Stoccolma / 63/2015. 50% ICP stato utilizzato per calcolare i titoli. Le barre di errore in (d), sono deviazioni standard (SD) delle duplicazioni del campione (± 1 SD). Barre di scala in (b) e (c) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> S1 supplementare: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> diluizione tipica </td></tr><tr><td></td><td> cellule MDCK </td><td> Cellule MDCK-SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 giorni </td><td> 1: 5 (1 + 4) </td><td> 1:10 (1 + 9) </td></tr><tr><td> 3 giorni </td&gt; <td> 1:10 (1 + 9) </td><td> 1:20 (1 + 19) </td></tr><tr><td colspan="3"> Numero tipico di cellule per ml </td></tr><tr><td></td><td> cellule MDCK </td><td> Cellule MDCK-SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 giorni </td><td> 2 x 10 5 </td><td> 1 x 10 5 </td></tr><tr><td> 3 giorni </td><td> 1 x 10 5 </td><td> 5 x 10 4 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: diluizioni tipici di una subcultura di fiaschi confluenti di cellule MDCK o MDCK-SIAT1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Modalità </td><td> Modo professionale </td></tr><tr><td> tipo di documento </td><td> Film (con Film Guide Turistiche) </td></tr><tr><td> Tipo Esposizione automatica </td><td> Foto </td></tr><tr><td> SonoTipo di età </td><td> 24-bit di colore </td></tr><tr><td> Risoluzione </td><td> 1.200 dpi </td></tr><tr><td> Formato immagine salvata </td><td> TIFF </td></tr></tbody></table> Tabella 2: configurazione tipica di uno scanner piano. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Riga </td><td> Virus </td><td> diluizione raccomandata </td></tr><tr><td> UN </td><td> A / Cameron / 15V-3538/2016 </td><td> 1,0 x 10 -2 </td></tr><tr><td> B </td><td> A / Vladivostok / 36/2015 </td><td> 1,0 x 10 -3 </td></tr><tr><td> C </td><td> A / Mosca / 103/2015 </td><td> 1,1 x 10 -1 </td></tr><tr><td> D </td><td> A / Tomsk / 5/2015 </td><td> 5.9 x 10 -1 </td></tr><tr><td> E </td><td> A / Mosca / 101/2015 </td><td> 8,3 x 10 -1 </td></tr><tr><td> F </td><td> A / Mosca / 100/2015 </td><td> 1,4 x 10 -2 </td></tr><tr><td> sol </td><td> A / Mosca / 133/2015 </td><td> 1,3 x 10 -2 </td></tr><tr><td> H </td><td> A / Bratislava / 437/2015 </td><td> 1,3 x 10 -4 </td></tr></tbody></table> Tabella 3: diluizioni virali calcolati da una popolazione pari al 30% ICP. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Colonna </td><td> Antisera </td><td> titolo consigliato </td></tr><tr><td> 1 - 2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 3 - 4 </td><td> A / HK7295 / 2014 </td><td> 213.3 </td></tr><tr><td&gt; 5 - 6 </td><td> A / Sud Africa / r2665 / 2015 </td><td> 2.155,8 </td></tr><tr><td> 7 - 8 </td><td> A / Svizzera / 9715293/2013 </td><td> 89.4 </td></tr><tr><td> 9 - 10 </td><td> A / Netherlands / 525/2014 </td><td> 78.6 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: I titoli a 50% ICP di A / Stoccolma / 63/2015 contro antisieri.

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Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Questo studio descrive un di imaging basata su test di micro-neutralizzazione per analizzare le relazioni antigeniche tra virus. Il protocollo impiega uno scanner piano ed ha quattro fasi, tra cui la titolazione, la titolazione quantificazione, neutralizzazione, e la neutralizzazione quantificazione. Il test funziona bene con corrente circolante pdm09 influenza A (H1N1), A (H3N2), e virus B.

Ottimizzazione di un Quantitative Micro-neutralizzazione Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

20.9K Views.  The Francis Crick Institute.  Questo studio descrive un di imaging basata su test di micro-neutralizzazione per analizzare le relazioni antigeniche tra virus. Il protocollo impiega uno scanner piano ed ha quattro fasi, tra cui la titolazione, la titolazione quantificazione, neutralizzazione, e la neutralizzazione quantificazione. Il test funziona bene con corrente circolante pdm09 influenza A (H1N1), A (H3N2), e virus B. 

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Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtitolazione Dish Biofilm saggio Formazione

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

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Immunologia e infezioni

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Una valutazione quantitativa della migrazione cellulare con il Test Phagokinetic motilità Traccia

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Misurazione quantitativa della risposta immunitaria e nel sonno<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

La valutazione quantitativa della migrazione dei neutrofili Umana Attraverso una coltivate vescica Epitelio

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Visualizzazione del carbone Agar resazurina Assay per semi-quantitativa, medio-throughput enumerazione dei micobatteri

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...