Abbiamo ricevuto assistenza tecnica dalla Biopolymers Facility della Harvard Medical School per il bioanalizzatore. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di ricerca della National Multiple Sclerosis Society RG-1707-28516 (H.L.W. e S.L.).

Tutti i metodi che coinvolgono animali da ricerca qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.
Tutti i metodi che coinvolgono soggetti di ricerca umana qui descritti sono conformi alle linee guida stabilite dal Comitato di ricerca umana dei partner.
1. Raccolta di campioni fecali
<ol><li>Autoclavare o preparare una provetta da microcentrifuga sterile e priva di nucleasi da 2 ml con tappo a vite per ciascun soggetto animale in un esperimento.<ol><li>Per i soggetti umani, fornire un dispositivo di raccolta dei campioni di feci appropriato, privo di nucleasi e sterile per ciascun soggetto.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccogliere 25-100 mg (circa 1-4 pellet fecali per campioni fecali di topo) di campioni fecali da ciascun soggetto animale in un ambiente sterile. NOTA: Due o più pellet fecali (~ 50 mg o più pesanti) sono preferiti per ottenere RNA della massima purezza.<ol><li>Utilizzare tutti i dispositivi di protezione individuale (DPI) e i materiali necessari, ad esempio: un paio di guanti da laboratorio, uno spray disinfettante e un tovagliolo di carta sterile, per sterilizzare l'area di lavoro, dove è posizionato il soggetto di ricerca animale, per evitare la contaminazione del campione fecale.<ol><li>Per i soggetti umani, istruire ogni soggetto di ricerca / collezionista a raccogliere 100-200 mg di campioni di feci in un ambiente il più sterile possibile. Utilizzare il funzionamento sterile standard ed evitare la contaminazione del campione di feci.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Raccogliere campioni fecali da ciascun soggetto animale direttamente in una provetta da microcentrifuga da 2 ml con un tappo a vite senza toccare altre superfici per evitare la contaminazione.<ol><li>Per i soggetti umani, istruire ciascun soggetto a defecare direttamente in un dispositivo di raccolta applicabile fornito (ad esempio, un kit di raccolta di campioni di feci sterili) per evitare la contaminazione. NOTA: Istruire il soggetto ad evitare la contaminazione da superfici della toilette, acqua, urina o altre superfici/oggetti non sterili.</li>
	</ol></li>
	<li>Congelare immediatamente i campioni fecali raccolti in provette da microcentrifuga da 2 ml a -80 °C o metterli in un secchio di ghiaccio secco per una migliore quantità e qualità di RNA prima della risospensione delle feci, come descritto nei passaggi seguenti.<ol><li>Per i campioni di feci umane, aliquote ogni campione fresco di 200 mg in provette da microcentrifuga da 2 mL con tappi a vite e congelarle a -80 °C prima della risospensione delle feci come descritto di seguito.<ol><li>Per la conservazione di campioni di feci non in provette da microcentrifuga da 2 ml con tappi a vite, pesare e trasferire 100-200 mg ciascuno di campioni congelati in provette di microcentrifuga separate da 2 ml con tappi a vite prima della risospensione delle feci come descritto di seguito. NOTA: Per i campioni di feci umane, evitare di assumere più di 200 mg di campioni di feci per l'isolamento dell'RNA in quanto potrebbe causare difficoltà nei passaggi successivi. Con un campione sovraccarico in una provetta da microcentrifuga da 2 ml, la fase acquosa, la fase organica e l'interfase potrebbero non essere chiaramente formate e separate. La procedura può essere messa in pausa qui.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparazioni di soluzioni di lavaggio
<ol><li>Aggiungere 21 ml di etanolo al 100% di grado American Chemical Society (ACS) alla soluzione di lavaggio 1 fornita nel kit di isolamento miRNA (vedere Tabella dei materiali) per raggiungere il volume finale di 30 ml, come mostrato sul flacone. Vortice fino a quando tutto si dissolve nella bottiglia.</li>
	<li>Aggiungere 40 ml di etanolo ACS grado 100% alla soluzione di lavaggio 2/3 fornita per raggiungere il volume finale di 50 ml, come indicato sul flacone. Vortice per 5 s o fino a quando la miscela finale è ben amalgamata.</li>
</ol>3. Preparazione di attrezzature e materiali
<ol><li>Spruzzare l'area di lavoro e le attrezzature, ad esempio: il banco di laboratorio, l'area di lavoro nella cappa aspirante chimica e le rack dei tubi della microcentrifuga, con una soluzione di decontaminazione della ribonucleasi (RNasi) (ad esempio, soluzione di decontaminazione della RNasi disponibile in commercio). Per evitare la contaminazione, applicare con la soluzione di decontaminazione RNasi sulle superfici dove e quando ritenuto necessario.</li>
	<li>Indossare un camice da laboratorio pulito, indossare una maschera facciale e indossare guanti da laboratorio appropriati per proteggere l'RNA nei campioni fecali dalle nucleasi presenti sulla pelle umana. Spruzzare i guanti con una soluzione di decontaminazione RNasi e cambiare frequentemente i guanti per evitare la contaminazione.</li>
	<li>Preparare un secchio di ghiaccio secco per i campioni fecali conservati a -80 °C per evitare lo scongelamento prima della risospensione delle feci e un secchio di ghiaccio per i materiali, ad esempio: Acido-fenolo: cloroformio, per prolungare la durata di conservazione. NOTA: Assicurarsi che i materiali, inclusi i supporti utilizzati nel protocollo, siano sterili senza contaminazione delle nucleasi.</li>
</ol>4. Risospensione delle feci
<ol><li>Risospendere 25-100 mg di campioni fecali in 600 μL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato 1x Dulbecco (DPBS). ATTENZIONE: I campioni fecali devono essere trattati immediatamente quando scongelati da -80 °C senza nemmeno uno scongelamento parziale per ridurre al minimo il rilascio di RNasi e RNA cellulare poiché i cristalli di ghiaccio rompono i compartimenti cellulari interni ed esterni quando le cellule nel campione si scongelano.<ol><li>Aggiungere 600 μL di 1x DPBS alla provetta da 2 mL di microcentrifuga con un tappo a vite contenente campioni fecali a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Incubare la miscela di campioni fecali immersi in 600 μL di 1x DPBS nella provetta da microcentrifuga da 2 mL con tappo per 30 minuti a RT.</li>
		<li>Risospendere la miscela schiacciando con 1 mL di punta della pipetta e vortice bene con il tubo di microcentrifuga da 2 mL tappato. Per ottimizzare e aumentare la quantità e la qualità dell'RNA, risospendere la miscela con un omogeneizzatore con l'impostazione per un ciclo a S4000 (o 4000 rpm) e 45 s.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Estrazione organica
ATTENZIONE: Utilizzare la cappa aspirante chimica pericolosa per le seguenti fasi fino alla fase 6 con l'uso di acido-fenolo: cloroformio e etanolo ACS grado 100% a causa della loro tossicità e infiammabilità. Sostituire i DPI secondo necessità e seguire le precauzioni standard appropriate quando si tratta di materiali pericolosi.
<ol><li>Estrarre l'RNA con 600 μL di acido-fenolo: cloroformio (il volume di acido-fenolo: cloroformio richiesto è uguale al volume iniziale di 1x DPBS aggiunto nella fase 4.1).<ol><li>Aggiungere 600 μL di acido-fenolo: cloroformio alla sospensione del punto 4.1. NOTA: Prelevare acido-fenolo: cloroformio dalla fase inferiore del flacone mentre la fase superiore viene miscelata con un tampone acquoso. Se l'interfase tra queste due fasi è disturbata, attendere e prelevare acido-fenolo: cloroformio solo quando l'interfase si ristabilisce per evitare la contaminazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Vortice la miscela per 60 s per mescolare accuratamente. In alternativa, per ottimizzare e aumentare la quantità di RNA nella resa, mescolare utilizzando un omogeneizzatore con l'impostazione per un ciclo a S4000 e 45 s.</li>
	<li>Centrifugare per 15 minuti a 10.000 x g a RT per separare le fasi acquosa e organica con una microcentrifuga. Dopo la centrifugazione, l'interfase dovrebbe essere compatta. In caso contrario, ripetere la centrifugazione. NOTA: Se l'interfase non poteva essere compatta come desiderato probabilmente a causa del rapporto irregolare tra il volume iniziale e il volume di acido-fenolo aggiunto: cloroformio dopo diverse ripetizioni di centrifugazione, procedere al recupero della fase acquosa con maggiore attenzione per evitare la contaminazione.</li>
	<li>Recuperare la fase acquosa e trasferirla in una nuova provetta da microcentrifuga da 2 mL con tappo a cerniera (non fornita dal kit di isolamento miRNA).<ol><li>Rimuovere con attenzione la fase acquosa (o superiore) senza disturbare la fase inferiore e trasferirla in un nuovo tubo di microcentrifuga da 2 ml con tappo a cerniera. Notare il volume trasferito (ad esempio, ~500 μL). NOTA: Quando l'interfase è compatta e la fase superiore è chiaramente separata, ci sono probabilmente alcune minuscole particelle residue che galleggiano sulla parte superiore della fase acquosa. Pipettare con attenzione per evitare questi residui e recuperare solo la fase acquosa visibilmente e chiaramente separata per garantire una resa di RNA di qualità, anche se è possibile ottenere solo un piccolo volume della fase acquosa.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Isolamento finale dell'RNA
<ol><li>Aggiungere 1,25 volumi di etanolo al 100% di grado RT ACS alla fase acquosa nel tubo di microcentrifuga da 2 ml (ad esempio, aggiungere 625 μL di etanolo al 100% se si recuperano 500 μL di fase acquosa dal passaggio 5.4.). Vortice 3 s.</li>
	<li>Caricare la fase acquosa/miscela di etanolo attraverso la cartuccia filtrante fornita nel kit di isolamento dei miRNA.<ol><li>Per ogni campione, posizionare la cartuccia filtrante in una delle provette di raccolta fornite dal kit.<ol><li>Pipettare e caricare 600 μL della fase acquosa/miscela di etanolo nella cartuccia del filtro. NOTA: Vortice brevemente la miscela per miscelare accuratamente l'etanolo con la fase acquosa prima del pipettaggio. Non possono essere caricati più di 700 μL della fase acquosa/miscela di etanolo alla volta.</li>
		</ol></li>
		<li>Centrifugare a 10.000 x g per 90 s per filtrare attraverso la miscela. La rotazione a una velocità maggiore potrebbe danneggiare il filtro.</li>
		<li>Eliminare il filtrato e ripetere i punti da 6.2.1 a 6.2.2 fino a filtrare tutta la miscela attraverso la stessa membrana filtrante in applicazioni successive. Conservare e riutilizzare lo stesso tubo di raccolta per i passaggi di lavaggio sottostanti.</li>
		<li>Lavare il filtro con 700 μL di miRNA Wash Solution 1. ATTENZIONE: miRNA Wash Solution 1 contiene guanidina tiocianato che può causare irritazione cutanea e gravi danni agli occhi. Indossare i DPI necessari, ad esempio: guanti, visiera, camice protettivo da laboratorio. Cambiare frequentemente i guanti se necessario.<ol><li>Applicare 700 μL di miRNA Wash Solution 1, la soluzione di lavoro preparata con etanolo ACS 100%, nella cartuccia del filtro.</li>
			<li>Centrifugare per 60 s per filtrare la miRNA Wash Solution 1 attraverso la cartuccia filtrante.</li>
			<li>Eliminare il filtrato dal tubo di raccolta e posizionare la stessa cartuccia filtrante nello stesso tubo di raccolta.</li>
		</ol></li>
		<li>Lavare il filtro con Wash Solution 2/3 una volta ciascuno con volumi di 700 μL, 500 μL e 250 μL consecutivi.<ol><li>Applicare 700 μL di Wash Solution 2/3, la soluzione di lavoro preparata con etanolo ACS 100%, nella cartuccia del filtro.<ol><li>Centrifugare a 10.000 x g per 1 min.</li>
				<li>Eliminare il filtrato dal tubo di raccolta e posizionare la stessa cartuccia filtrante nello stesso tubo di raccolta.</li>
			</ol></li>
			<li>Applicare 500 μL di soluzione di lavaggio 2/3 nella cartuccia del filtro.<ol><li>Centrifugare a 10.000 x g per 1 min.</li>
				<li>Eliminare il filtrato dal tubo di raccolta e posizionare la stessa cartuccia filtrante nello stesso tubo di raccolta.</li>
			</ol></li>
			<li>Applicare 250 μL di soluzione di lavaggio 2/3 nella cartuccia del filtro.<ol><li>Centrifugare a 10.000 x g per 1 min.</li>
				<li>Eliminare il filtrato dalla provetta di raccolta.</li>
			</ol></li>
			<li>Trasferire la cartuccia del filtro in un nuovo tubo di raccolta e ruotare il gruppo per 5 minuti per rimuovere il fluido residuo dal filtro.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. Eluire l'RNA con 50 μL di acqua priva di nucleasi
<ol><li>Trasferire la cartuccia filtrante in un nuovo tubo di raccolta. Pipettare 50 μL di acqua priva di nucleasi al centro del filtro e tappare il tubo di raccolta.<ol><li>Incubare a RT per 10 min.</li>
		<li>Centrifugare per 5 minuti a 8.000 x g per recuperare l'RNA nella nuova provetta di raccolta.</li>
		<li>Determinare la concentrazione e la purezza dell'RNA fecale recuperato utilizzando un fluorometro. L'RNA fecale recuperato può essere conservato a -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+RNA+communication+consortium:+Establishing+foundational+knowledge+and+technologies+for+extracellular+RNA+research.">The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research.</a> Cell. 177 (2), 231-242 (2019).</li><li>Ahmed, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+microRNA+markers+for+screening+sporadic+human+colon+cancer+and+active+ulcerative+colitis+in+stool+and+tissue.">Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue.</a> Cancer Genomics &amp; Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+shapes+the+gut+microbiota+via+fecal+microRNA.">The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).</li><li>Viennois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+fecal+microRNAs+can+indicate+gut+microbiota+healthiness+and+ability+to+induce+inflammation.">Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation.</a> Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+miR-30d+from+feces+of+MS+patients+suppresses+MS-like+symptoms+in+mice+by+expanding+Akkermansia+muciniphila.">Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).</li><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+small+non-coding+RNAs+allows+an+accurate+comparison+of+miRNA+expression+profiles.">Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2009, 659028 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+win+the+battle+with+RNase.">How to win the battle with RNase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).</li><li>Franzosa, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+the+metatranscriptome+and+metagenome+of+the+human+gut.">Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).</li><li>Wohnhaas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecal+microRNAs+show+promise+as+noninvasive+Crohn's+disease+biomarkers.">Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers.</a> Crohn's &amp; Colitis. 2 (1), 003 (2020).</li><li>Tomkovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+mucosal+biofilms+and+murine+host+communicate+via+altered+mRNA+and+microRNA+expression+during+cancer.">Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer.</a> mSystems. 5 (1), (2020).</li><li>Tarallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+fecal+small+RNA+profiles+in+colorectal+cancer+reflect+gut+microbiome+composition+in+stool+samples.">Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples.</a> mSystems. 4 (5), 70 (2019).</li><li>Xing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breed+differences+in+the+expression+levels+of+gga-miR-222a+in+laying+hens+influenced+H2S+production+by+regulating+methionine+synthase+genes+in+gut+bacteria.">Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria.</a> Research Square. , (2020).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+exosomal+microRNAs+shape+the+gut+microbiota.">Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).</li><li>Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+microRNAs:+indicators+of+imbalance+at+the+host-microbe+interface.">Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface.</a> Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).</li><li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes.">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).</li></ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari rilevanti o materiali correlati al metodo di ricerca descritto in questo documento protocollare.

È importante utilizzare una tecnica priva di RNasi per prevenire la contaminazione da RNasi durante l'isolamento7. Dopo la centrifugazione e la formazione di un'interfase compatta, è fondamentale evitare l'interfase, la fase inferiore e il contaminante particellare che galleggia sulla parte superiore della fase acquosa durante il recupero della fase acquosa. Inoltre, vengono aggiunte due fasi di lavaggio con 500 μL e 250 μL Wash Solution 2/3 per eliminare i contaminanti nella membrana del filt...

L'RNA extracellulare viene riconosciuto come un fattore significativo che media molti processi biologici1. L'RNA extracellulare nelle feci è stato segnalato per la prima volta nel 2008 come marker per il cancro del colon e la colite ulcerosa attiva2, ed è stato recentemente rivelato come un componente normale del lume intestinale e delle feci e media le comunicazioni ospite-microbo 3,4,5. Lo scopo di questo protocollo di isolamento dell'RNA è quello di estrarre RNA extracellulare di alta qualità da campioni fecali raccolti da soggetti animali e umani. Il protocollo è stato adattato da un kit commerciale di isolamento miRNA. L'RNA acquisito viene utilizzato per analisi a valle come il sequenziamento dell'RNA, RT-PCR e micro-array. Il protocollo include diversi suggerimenti importanti e utili per massimizzare la quantità e la qualità dell'RNA presente nelle feci di animali e umani. La ragione per sviluppare e ottimizzare questo metodo di isolamento dell'RNA (incluso il microRNA) è diminuire l'RNA microbico nelle feci, limitare le variabili negli studi di ricerca e analizzare la composizione dell'RNA nell'intestino senza tenere conto di vari fattori confondenti e fonti di contaminazione. Da notare, questo isolamento dell'RNA riduce al minimo il rilascio di RNA dalle cellule viventi e dai microbi viventi (RNA cellulare). Si concentra sugli RNA extracellulari che sono stati rilasciati dalle cellule intestinali o sono stati acquisiti attraverso l'assunzione di cibo. Principalmente, questo metodo non è adatto per studi in cui viene studiato il trascrittoma microbico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM1561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fecal (micro) rna isolation

Sta diventando chiaro che l'RNA esiste nel lume intestinale e nelle feci negli animali e negli esseri umani. Il protocollo descritto di seguito isola l'RNA totale, compresi i microRNA, da campioni fecali di soggetti animali e umani. L'obiettivo è quello di isolare l'RNA totale con elevata purezza e quantità per analisi a valle come il sequenziamento dell'RNA, RT-PCR e micro-array. I vantaggi di questo protocollo ottimizzato nell'isolamento dei miRNA sono la capacità di isolare prodotti di RNA altamente purificati con ulteriori fasi di lavaggio descritte, una maggiore quantità di RNA ottenuta con un metodo migliorato nella risospensione del campione e importanti suggerimenti di decontaminazione. Una limitazione è l'incapacità di elaborare e purificare campioni più grandi di oltre 200 mg in quanto queste dimensioni del campione causerebbero una difficoltà nella chiara formazione dell'interfase. Di conseguenza, le grandi dimensioni del campione possono contaminare la fase acquosa da estrarre come descritto nel protocollo con sostanze organiche che influenzano la qualità dell'RNA isolato alla fine. Tuttavia, gli isolati di RNA da un campione fino a 200 mg sono sufficienti per la maggior parte delle analisi a valle.

Gli RNA rappresentativi sono stati isolati rispettivamente da campioni fecali di topo da 50 mg (2 pellet fecali di topo) e campioni di feci umane da 100 mg ed eluiti in acqua priva di nucleasi da 50 μL. L'analisi spettrofotometrica della concentrazione suggerisce che una quantità totale di 49 μg e 16 μg di RNA sono stati isolati rispettivamente (Tabella 1). La purezza dell'RNA era elevata, come indicato da un rapporto A260/A280 di ~2,0 e un rapporto A260/A230 di ~1,8 (Tabella 1). Com...

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Fecal micro RNA Isolation

Questo protocollo isola l'RNA totale di alta qualità da campioni fecali di soggetti animali e umani. Un kit commerciale di isolamento dei miRNA viene utilizzato con un adattamento significativo per isolare l'RNA puro con quantità e qualità ottimizzate. Gli isolati di RNA sono buoni per la maggior parte dei saggi di RNA a valle come sequenziamento, micro-array e RT-PCR.

Isolamento fecale (micro) RNA

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

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Fecal (micro) RNA Isolation

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4.5K Views.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. Questo protocollo isola l'RNA totale di alta qualità da campioni fecali di soggetti animali e umani. Un kit commerciale di isolamento dei miRNA viene utilizzato con un adattamento significativo per isolare l'RNA puro con quantità e qualità ottimizzate. Gli isolati di RNA sono buoni per la maggior parte dei saggi di RNA a valle come sequenziamento, micro-array e RT-PCR.

Video: Fecal micro RNA Isolation

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors of human diseases1 and the most important vectors affecting cattle industry worldwide2. Ticks are classified in the subclass Acari, order Parasitiformes, suborder Ixodida and are distributed worldwide from Arctic to tropical regions3. Despite efforts to control tick infestations, these ectoparasites remain a serious problem for human and animal health4,5.
RNA interference (RNAi)6 is a nucleic acid-based reverse genetic approach that involves disruption of gene expression in order to determine gene function or its effect on a metabolic pathway. Small interfering RNAs (siRNAs) are the effector molecules of the RNAi pathway that is initiated by double-stranded RNA (dsRNA) and results in a potent sequence-specific degradation of cytoplasmic mRNAs containing the same sequence as the dsRNA trigger7-9. Post-transcriptional gene silencing mechanisms initiated by dsRNA have been discovered in all eukaryotes studied thus far, and RNAi has been rapidly developed in a variety of organisms as a tool for functional genomics studies and other applications10.
RNAi has become the most widely used gene-silencing technique in ticks and other organisms where alternative approaches for genetic manipulation are not available or are unreliable5,11. The genetic characterization of ticks has been limited until the recent application of RNAi12,13. In the short time that RNAi has been available, it has proved to be a valuable tool for studying tick gene function, the characterization of the tick-pathogen interface and the screening and characterization of tick protective antigens14. Herein, a method for RNAi through injection of dsRNA into unfed ticks is described. It is likely that the knowledge gained from this experimental approach will contribute markedly to the understanding of basic biological systems and the development of vaccines to control tick infestations and prevent transmission of tick-borne pathogens15-19.

A method for RNA interference (RNAi) by injection of dsRNA into unfed ticks is described. RNAi is the most widely used gene-silencing technique in ticks where the use of other methods of genetic manipulation has been limited.

RNA interferenza nelle zecche

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolamento di varianti di virus RNA Fidelity e caratterizzazione di frequenza Virus Mutation

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering (si)RNAs to inhibit the expression of complementary RNA transcripts is being exploited as a new class of therapeutics for a variety of diseases including HIV. Many previous reports have shown that novel RNAi-based anti-HIV/AIDS therapeutic strategies have considerable promise; however, a key obstacle to the successful therapeutic application and clinical translation of siRNAs is efficient delivery. Particularly, considering the safety and efficacy of RNAi-based therapeutics, it is highly desirable to develop a targeted intracellular siRNA delivery approach to specific cell populations or tissues. The HIV-1 gp120 protein, a glycoprotein envelope on the surface of HIV-1, plays an important role in viral entry into CD4 cells. The interaction of gp120 and CD4 that triggers HIV-1 entry and initiates cell fusion has been validated as a clinically relevant anti-viral strategy for drug discovery. 
Herein, we firstly discuss the selection and identification of 2'-F modified anti-HIV gp120 RNA aptamers. Using a conventional nitrocellulose filter SELEX method, several new aptamers with nanomolar affinity were isolated from a 50 random nt RNA library. In order to successfully obtain bound species with higher affinity, the selection stringency is carefully controlled by adjusting the conditions. The selected aptamers can specifically bind and be rapidly internalized into cells expressing the HIV-1 envelope protein. Additionally, the aptamers alone can neutralize HIV-1 infectivity. Based upon the best aptamer A-1, we also create a novel dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera in which both the aptamer and the siRNA portions have potent anti-HIV activities. Further, we utilize the gp120 aptamer-siRNA chimeras for cell-type specific delivery of the siRNA into HIV-1 infected cells. This dual function chimera shows considerable potential for combining various nucleic acid therapeutic agents (aptamer and siRNA) in suppressing HIV-1 infection, making the aptamer-siRNA chimeras attractive therapeutic candidates for patients failing highly active antiretroviral therapy (HAART).

Several 2&#x2019;-Fluoro RNA aptamers against HIV-1Ba-L gp120 with nanomole affinity are isolated from a RNA library by in vitro SELEX procedure. A new dual inhibitory function anti-gp120 aptamer-siRNA chimera is created and shows considerable promise for systemic anti-HIV therapy.

Sviluppo di Cell-tipo specifico anti-HIV gp120 aptameri per la consegna di siRNA

The global epidemic of infection by HIV has created an urgent need for new classes of antiretroviral agents. The potent ability of small interfering ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Rilevamento di nanoparticelle fluorescenti Interazioni con Primaria immunitario sottopopolazioni cellulari mediante citometria di flusso

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

Nucleocapside Ricottura-Mediated elettroforesi (NAME) Assay permette la rapida identificazione del virus HIV-1 nucleocapside Inibitori

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

Ottimizzazione di un Quantitative Micro-neutralizzazione Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant prion protein (PrP) substrate using prion seeds as a template for the conversion. RT-QuIC is a novel high-throughput technique which is analogous to real-time polymerase chain reaction (PCR). Detection of amyloid fibril growth is based on the dye Thioflavin T, which fluoresces upon specific interaction with &#7526;-sheet rich proteins. Thus, amyloid formation can be detected in real time. We attempted to develop a reliable non-invasive screening test to detect chronic wasting disease (CWD) prions in fecal extract. Here, we have specifically adapted the RT-QuIC technique to reveal PrPSc seeding activity in feces of CWD infected cervids. Initially, the seeding activity of the fecal extracts we prepared was relatively low in RT-QuIC, possibly due to potential assay inhibitors in the fecal material. To improve seeding activity of feces extracts and remove potential assay inhibitors, we homogenized the fecal samples in a buffer containing detergents and protease inhibitors. We also submitted the samples to different methodologies to concentrate PrPSc on the basis of protein precipitation using sodium phosphotungstic acid, and centrifugal force. Finally, the feces extracts were tested by optimized RT-QuIC which included substrate replacement in the protocol to improve the sensitivity of detection. Thus, we established a protocol for sensitive detection of CWD prion seeding activity in feces of pre-clinical and clinical cervids by RT-QuIC, which can be a practical tool for non-invasive CWD diagnosis.

Here, we present a protocol to describe a simple, fast and efficient prion amplification technique, the real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) method.

In tempo reale tremare-indotta conversione analisi per rilevazione di CWD prioni nel materiale fecale

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

Formazione immagine confocal di RNA Double-Stranded e Pattern Recognition Receptors in infezione Virus RNA negativo

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are needed to decipher the utilization of microbiome modulators for human health benefits. However, the large-scale screening and optimization of modulators to validate microbiome modulation and predict related health benefits may be practically difficult due to the need for large number of animals and/or human subjects. To this end, in vitro or ex vivo models can facilitate preliminary screening of microbiome modulators. Herein, it is optimized and demonstrated an ex vivo fecal microbiota culture system that can be used for examining the effects of various interventions of gut microbiome modulators including probiotics, prebiotics and other food ingredients, aside from nutraceuticals and drugs, on the diversity and composition of the human gut microbiota. Inulin, one of the most widely studied prebiotic compounds and microbiome modulators, is used as an example here to examine its effect on the healthy fecal microbiota composition and its metabolic activities, such as fecal pH and the fecal levels of organic acids including lactate and short-chain fatty acids (SCFAs). The protocol may be useful for studies aimed at estimating the effects of different interventions of modulators on fecal microbiota profiles and at predicting their health impacts.

This protocol describes an in vitro batch-culture fermentation system of human fecal microbiota, using inulin (a well-known prebiotic and one of the most widely studied microbiota modulators) to demonstrate the use of this system in estimating effects of specific interventions on fecal microbiota composition and metabolic activities.

Un modello di coltura batch in vitro per stimare gli effetti dei regimi interventistici sul microbiota fecale umano

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...