Questo lavoro è stato supportato ya CIRM comunione predoctoral (CDPE), Investigator Award NARSAD Young (DK) e il premio NIMH BRAINS (R01MH087495) (DK).

Anestesia e analgesia: Trenta minuti prima dell&#39;anestesia, iniettare il topo con 0,05 mg / kg per via sottocutanea buprenorfina per l&#39;analgesia. Iniziato anestesia con 30-40 mg / kg intraperitoneale di sodio pentobarbital. A questo punto, anche iniettare atropina per prevenire insufficienza respiratoria (0,4 mg / kg, sottocutanea) e meloxicam come analgesico ulteriormente (2 mg / kg per via sottocutanea). Se dopo 5 minuti, il ratto è ancora mobile o sensibile al pinch punta, somministrare successive dosi di sodio pentobarbital a 5 mg / kg (intraperitoneale) finché il ratto è insensibile al dolore. Prima di eseguire la prima incisione, iniettare lidocaina (5 mg / kg, intradermica) presso il sito di incisione per l&#39;anestesia locale. Da sei a otto ore dopo l&#39;iniezione iniziale, iniettare il ratto con 0,05 mg / kg per via sottocutanea buprenorfina per l&#39;analgesia. La buprenorfina può essere iniettata ogni 6-8 ore successive, se necessario, anche se questo genere non è necessario. È importante notare che altre forme di c anestesiauno interferire con lesioni eccitotossiche. Ad esempio, sebbene ketamina è una forma comunemente usata di anestesia nei roditori, può interferire con lesioni indotte con NMDA perché è un antagonista del recettore NMDA. È importante selezionare un metodo di indurre anestesia che non ridurre la dimensione della lesione. Se l&#39;anestesia gas si desidera, dispositivi più stereotassiche comprese quelle descritte qui in grado di ospitare schede di maschera antigas. Nota: I materiali sono descritti più approfonditamente nella tabella di reagenti e attrezzature specifiche di seguito. 1. Preparazione della pompa e Stereotax <ol><li> Riempire una siringa da 10 microlitri Hamilton con acqua sterile e montarlo nel caddy di una pompa siringa 6 programmabile. Fissare la estremità dello stantuffo della siringa nel supporto fissato sulla pompa. </li><li> Prefill gas-sterilizzato PE20 tubi con acqua sterile usando un ago e la siringa da 1 ml. Inserire l&#39;estremità aperta del tubo al siringa Hamilton, essendo curautile per evitare di creare eventuali bolle d&#39;aria nel tubo. </li><li> Fissare la 30ga, piatta-cut, 1 pollice estremità dell&#39;ago infusione del tubo al braccio di un dispositivo stereotassico utilizzando un barile stile manipolatore elettrodo. Inserire l&#39;ago di infusione tra il morsetto e la canna rigata. Fissare la pinza su un pezzo di tubo contenente ago metallico al suo interno per evitare l&#39;appiattimento del tubo e limitando il flusso di fluido. </li><li> Regolare la velocità della pompa di&gt; 5 microlitri / min e accendere la pompa. Una goccia d&#39;acqua dovrebbe apparire sulla punta dell&#39;ago infusione. Controllare la lunghezza del tubo e delle sue articolazioni per assicurarsi che non vi siano perdite. </li><li> Eliminare l&#39;acqua tallone con un tampone sterile e impostare la pompa a ritirarsi. Aspirare a 2 microlitri bolla d&#39;aria. La parte superiore della bolla deve essere visibile nel tubo. </li><li> Immergere la punta dell&#39;ago in infusione a 20 mg / ml soluzione di NMDA in 0,1 M PBS sterile e ritirare ul 4-5. Una bolla d&#39;aria deve essere visibile tra l&#39;acqua sterile e la soluzione NMDAnella punta. È importante notare che NMDA è un potente neurotossina e cautela devono essere usati nella preparazione e all&#39;uso di questa soluzione. Guanti e protezioni per gli occhi si consiglia in ogni momento. </li></ol> 2. Montare il Rat nel dispositivo stereotassico <ol><li> La Figura 1 illustra le parti fondamentali del dispositivo stereotassico. Dopo rasatura testa del ratto dalla linea degli occhi per le orecchie, caricare denti frontali del topo sulla barra morso, con il corpo del ratto che poggia su una piastra elettrica impostato su terreno. La lingua dovrebbe appendere sotto la barra del morso, con la mascella inferiore. Se disponibile, un feedback pad temperatura di riscaldamento sarebbe preferibile. Monitoraggio della temperatura rettale sarebbe anche l&#39;ideale. </li><li> Tenendo il collo del ratto con il pollice e l&#39;indice, spostare il canale orecchio destro sulla barra orizzontale orecchio destro. La barra dovrebbe sentire come si poggia su una solida, non come affonda molto nella testa. Tenendo il lato destro della testa ferma, far scorrere l&#39;orecchio sinistrobar nel canale sinistro del ratto orecchio in posizione orizzontale. Si deve sentire come si poggia su una solida. La pinna dovrebbe essere simmetrica e dovrebbe comparire a sdraiarsi sulle barre di auricolari. Svasatura verso l&#39;alto dei padiglioni auricolari indica la distribuzione impropria delle barre di auricolari. La testa non deve oscillare in risposta alla pressione a livello del collo. </li><li> Avvitare la barra naso. Sii gentile. Le ossa del naso sono delicati e la barra naso non deve essere stretto. Controllare che il ratto è ancora anestetizzato prima di procedere. </li></ol> 3. Preparazione del Rat di Chirurgia <ol><li> Utilizzando un tampone sterile, delicatamente mettere una piccola quantità di pomata oftalmica lubrificante veterinaria in ogni degli occhi del topo di proteggerli da essiccazione e detriti. </li><li> Concentricamente dal sito incisione prevista al bordo della regione rasata, pulire cuoio capelluto del ratto con soluzione di clorexidina 2% seguita etanolo al 70% tre volte. Scrub clorexidina può anche essere utilizzato se disinfettante più efficace si desidera.Termina pulendo con una soluzione di iodio povidone al 10%. Il cuoio capelluto è ora preparato sterile e deve essere toccato con materiali sterili. </li><li> Don guanti sterili per ulteriori passi, perché vi verrà ora affrontare il sito preparato chirurgico. </li><li> Posizionare un telino sterile in modo che la fenestrazione espone il sito chirurgico. </li></ol> 4. Creare il Window chirurgico <ol><li> Utilizzando una lama di bisturi # 10, effettuare un&#39;incisione (circa 2 cm di lunghezza) lungo la linea mediana longitudinale del cuoio capelluto. L&#39;incisione dovrebbe iniziare posteriore alla linea degli occhi. Con il pollice e l&#39;indice della mano non dominante, tenere il cuoio capelluto in tensione perpendicolare alla direzione della incisione. </li><li> Tirare la fascia sovrastante la superficie del cranio ai bordi del sito chirurgico sterili utilizzando cotone punte. Ci vorrà una certa forza per cancellare il cranio in modo che possa essere visualizzato. </li><li> Utilizzare quattro curve, hemostats sterili per creare una finestra chirurgica. Morsetto fascia (NON pelle) su EAch lato delle superfici anteriore e posteriore della incisione e poi fissare i morsetti a fianco l&#39;animale, così tirando l&#39;incisione aperta e completamente esporre il cranio. </li></ol> 5. Livellamento della Skull and Creazione del foro pilota <ol><li> Individuare bregma, il punto anteriore in cui le tre piastre principali del cranio incontrano, come illustrato in Figura 2. Spostare l&#39;ago di infusione in modo che la punta dell&#39;ago a contatto con il cranio al bregma. Si noti il dorso-ventrale coordinate. Figura 3 viene illustrato come leggere le coordinate su un dispositivo Stoelting stereotassico. Si noti, a questo punto, guanti non sono più sterile e non toccare il sito chirurgico sterile direttamente. Nota: Dopo aver toccato il dispositivo sterile stereotassica, il chirurgo non è più sterile e non deve toccare il sito chirurgico né parti delle apparecchiature che toccare il sito chirurgico. </li><li> Individuare lambda, il punto posteriore dove i tre piatti principali del cranio si incontrano, come depicted in Figura 2. Sollevare l&#39;ago di infusione leggermente e spostarlo subito al lambda. Abbassare l&#39;ago sia a contatto con il cranio a lambda. Leggi il dorso-ventrale coordinate. Se il livello è cranio, sarà di 0,1 mm del bregma lettura. Se è più lontano di questo, spostare l&#39;ago verso l&#39;alto (fuori strada), allentare la barra di naso, o alzare o abbassare la piattaforma bar morso, a seconda di quale lato della testa è troppo alto, e poi ri-misura. </li><li> Spostare l&#39;ago infusione bregma e registrare le coordinate antero-posteriore e medio-laterale. Calcolare in cui l&#39;ago deve essere spostato in base alle coordinate della zona del cervello di interesse secondo un cervello atlante 12. Per il BLA, sottrarre 2,8 millimetri dal antero-posteriore coordinate e aggiungere o sottrarre 5,1 millimetri da / per l&#39;mediale-laterale coordinate a seconda se si vuole indirizzare verso sinistra o destra. Spostare l&#39;ago di infusione alla posizione calcolata. </li><li> Spostare la needle di mezzo, avendo cura di tenere traccia di dove si trovava e poi praticare un foro di circa 2 mm di diametro in quella posizione con un Dremel moto-tool con un po &#39;sterile fresa attaccata. Praticare con attenzione come quando si rompe il trapano attraverso il cranio, tenderà ad abbattere e danneggiare il tessuto cerebrale e dura sotto. Alesare il foro per ingrandirla. </li><li> Assorbire il sangue con un tampone di cotone sterile. </li></ol> 6. L&#39;infusione di Neurotossina <ol><li> Spostare l&#39;ago in posizione. Abbassare l&#39;ago fino a toccare la superficie del cervello. Registrare la dorso-ventrale coordinate. Questo è il livello di dura. Sottrarre il valore appropriato per raggiungere la regione del cervello di interesse. Per l&#39;amigdala basolaterale, sottrarre 6,7 millimetri. </li><li> Abbassare l&#39;ago di infusione al livello calcolato lentamente. Poi sollevare il backup, ben al di sopra del cranio. Utilizzare un filo siringa Hamilton pulizia per sbloccare la punta dell&#39;ago di infusione, facendo attenzione a non tOuch l&#39;estremità del filo che viene in contatto con l&#39;ago di infusione con guanti non sterili. </li><li> Funzionare la pompa a&gt; 5 microlitri / min e assicurarsi di vedere una goccia di liquido uscire l&#39;ago di infusione. In caso contrario, sbloccare con il filo e riprovare. </li><li> Abbassare l&#39;ago di infusione alla desiderata dorsale / ventrale livello lentamente. </li><li> Impostare la velocità della pompa di infusione a 0,1 microlitri / min e iniziare l&#39;infusione. Lasciare in infusione per 2 min. </li><li> Una volta che l&#39;infusione è iniziata, contrassegnare le due estremità della bolla d&#39;aria nel tubo con un pennarello nero. Se entrambe le estremità non si muovono, l&#39;ago è ostruito. Interrompere l&#39;infusione, sollevare l&#39;ago, sbloccare con il filo, verificare la presenza di flusso con una portata elevata, ri-abbassare l&#39;ago e riprovare. </li><li> Una volta che l&#39;infusione è completa, fermare la pompa e attendere 5 minuti per il NMDA a diffondere lontano dalla punta dell&#39;ago. </li><li> Sollevare l&#39;ago di 0,5 millimetri, e infondere di nuovo per 1 min. Attendere 2,5 minuti per il NMDA a diffondere lontano dalla punta dell&#39;ago. Questa infusione supplementare haLPS garantire tutto il BLA è coperta dalla infusione. Se questo sia necessario per altre regioni del cervello deve determinare sperimentalmente. </li><li> Sollevare l&#39;ago del cervello lentamente e ruotare il braccio stereotassico di mezzo. </li></ol> 7. Chiusura del Incision <ol><li> Don nuovi guanti sterili per chiudere l&#39;incisione. </li><li> Togliere ogni eccesso di sangue sul cranio con punte sterili di cotone e rimuovere le pinze dalla fascia. </li><li> Utilizzando pinze Londra, spingere i due lati della incisione insieme. I bordi interni della pelle deve soddisfare e il bordo esterno della pelle non dovrebbe essere consentito di arricciarsi nell&#39;incisione. Tenendo premuto il ferita chiusa, applicare clip ferita per chiudere la sporgenza con fermezza. Continuare a spingere la pelle ed fiocco lungo la lunghezza dell&#39;incisione. Questo richiede di solito 3-5 clip ferita. </li><li> Dopo aver collocato tutti i clip ferita, usare le pinze per pizzicare i punti ancora una volta, assicurandosi che siano sicuri. Il t più sicuroegli clip, meno è probabile un topo li tirare fuori prima che l&#39;incisione è guarita. </li><li> Swab l&#39;incisione pinzati con la soluzione di povidone 10% di iodio e tornare il ratto alla sua gabbia di casa e monitor fino a quando viene ripristinata la mobilità (di solito 1-2 ore dopo l&#39;anestesia, la chirurgia tempo totale di induzione alla chiusura essere 30-45 min). A questo punto, il ratto può essere restituito al camera colonia. Dopo una settimana, estrarre punti con un utensile di rimozione fiocco sotto anestesia con isoflurano. </li><li> Utilizzare uno sterilizzatore a caldo tallone per sterilizzare le superfici di punta di tutti gli strumenti prima dell&#39;uso sul ratto successiva. Gli strumenti devono essere immersi nelle perle per non più di 15 secondi, o possono diventare troppo caldo per gestire. Gli strumenti devono essere completamente raffreddata prima utilizzata su un altro animale. </li></ol> 8. Recupero <ol><li> E &#39;possibile che i ratti esporrà l&#39;attività convulsiva nei giorni successivi la lesione. A seconda della regione del cervello danneggiate, altri comportamenti quali il consumo alimentare o grooming può essere influenzata. E &#39;importante che gli animali essere monitorati su base giornaliera per assicurare che essi rimangano sani durante il recupero. La terapia di supporto, come il cibo liquido, ad alto contenuto calorico degli alimenti, o analgesia supplementare può essere richiesto. La mortalità a causa di anestesia avviene in una bassa percentuale di ratti, solitamente meno del 5%. La mortalità dovuta ad altre cause (infezioni, emorragie) è estremamente rara. Eventuali segni di sofferenza dopo il recupero di anestesia può essere motivo di esclusione da studi futuri, ma sono estremamente rare. Figura 4 rappresenta la perdita di peso durante i primi giorni dopo l&#39;intervento chirurgico come dovrebbe essere previsto. Il peso corporeo dovrebbe rimbalzare entro 1 settimana. </li></ol> 9. Risultati rappresentativi Una settimana o più dopo l&#39;infusione NMDA, la lesione può essere visualizzato usando un cresile-viola di contrasto e di microscopia a campo chiaro. Brains deve essere perfusi con paraformaldeide ghiacciata del 4%, equilibrata nel 30% di saccarosio in PBS 0,1 M e Spinacien. Essi devono poi essere tagliati a 30-60 um, in una serie di 1:06-1:12 e montato su di gelatina rivestite vetrini prima di subire una serie di contrasto violetto cresolo. La lesione deve corrispondere a una &quot;zona calva&quot; o una zona di ridotta violetto cresolo macchia dovuta alla morte delle cellule a seguito di lesione. Figure 5A e B mostrano una lesione rappresentante del BLA e CEA. Questa immagine è stata ottenuta utilizzando uno scanner piano con una scansione ad alta risoluzione (1200 dpi). Per visualizzare la lesione, aiuta a di contrasto di una serie di sezioni per gran parte del tessuto circostante l&#39;area bersaglio così una lesione fuori posto può essere localizzato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig1.jpg" /> Figura 1. Installazione stereotassico. Questa figura mostra la stereotassica topo con parti rilevanti etichettati. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig2.jpg" /> Figura 2. Bregma e lambda sul sku rattoll. Questa illustrazione mostra le posizioni dei bregma e lambda. Tutte le coordinate sono misurate rispetto al bregma. Lambda viene utilizzato per garantire che il cranio è livello. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig3.jpg" /> Figura 3. Lettura coordinate stereotassiche. Questo disegno illustra una lettura standard di stereotassico. Per ottenere le cifre a sinistra della posizione decimale, utilizzare i marcatori sul lato destro. La cifra etichetta corrisponde al luogo decine (cioè 1 = 10, 2 = 20). I segni di hash tra le cifre etichettati corrispondono alle singole unità (1-9). La linea dello zero indica a che l&#39;intero stereotax è impostato. Qui, la linea di zero è tra il 10 e 11 marcatori, indicando che la lettura sia tra 10 e 11. Per determinare i numeri a destra della posizione decimale, utilizzare i marcatori sul lato sinistro. I segni hash a sinistra sono numerati da 0 a 10, con ogni hash senza etichetta che rappresenta una differenza unità dacoloro che accanto ad essa. Qualunque sia dei marchi hash sulle linee di sinistra fino al meglio con i trattini sulla destra indica la prima cifra decimale della lettura coordinata. Qui, il cancelletto sulla sinistra, corrispondente al numero 9 si allinea al meglio con i marchi di hash sul lato destro in modo che la cifra decimale è 9. La lettura finale è pari a 10,9 mm. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig4.jpg" /> Figura 4. Cambiamento di peso dopo l&#39;intervento chirurgico. Questo grafico mostra la media (± SEM) peso di ratti sottoposti a chirurgia stereotassica (n = 17) o non ha avuto la chirurgia (n = 6). Day 0 è il giorno dell&#39;intervento. Dopo l&#39;intervento chirurgico, il peso di ratti diminuito per 2-3 giorni dopo l&#39;intervento e quindi aumentata di circa 5-6 giorni. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4079/4079fig5.jpg" /> Figura 5. Esempio lesione eccitotossico. A) Questa immagine mostra un violetto cresolo di contrasto su una fetta 30 micron coronale con il &quot;calvospot &quot;da NMDA lesione dell&#39;amigdala basolaterale. Le frecce bianche delineano la lesione. Esso può essere paragonato al lato controlaterale della fetta cervello che non ha alcuna lesione. B) Una lesione simile del nucleo centrale dell&#39;amigdala.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Il metodo qui presentato permette stereotassico per lesione eccitotossico su specifiche aree cerebrali tramite infusione di NMDA. I metodi di base stereotassiche può essere adattato per infondere una varietà di agenti farmacologici e biologici in un sito-specifica. Si possono anche essere adattate per indirizzare una varietà di aree cerebrali, definito dalle rispettive coordinate stereotassiche in un cervello atlante 12. Adattamento ad altre specie come i topi possono essere realizzati con dispositivi simi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> N-metil-D-aspartico 98% </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC32919-0500 </td><td></td></tr><tr><td> Doppio Lab standard stereotassico w/45 gradi. Ear Bars </td><td> Stoelting </td><td> 51653 </td><td> Alternative venditore: Kopf * nota di cautela: assicurare la compatibilità degli accessori stereotassiche se acquisti da fornitori diversi </td></tr><tr><td> 10 pl SYR SPECIALE (* / * / *) </td><td> Hamilton </td><td> 701SN </td><td></td></tr><tr><td> Dremel Moto-Tool </td><td> Stoelting </td><td> 58600 </td><td> Alternative venditore: Kopf </td></tr><tr><td> Frese in metallo duro, manipolo HP, taglia 2 </td><td> Schein Dental </td><td> 2284578 </td><td></td></tr><tr><td> Stoelting 6 Program siringapompa programmabile </td><td> Stoelting </td><td> 53140 </td><td> Alternative venditore: Kopf </td></tr><tr><td> Acciaio 316 Hypodermic Regular parete Tubing 30 Gauge 0,0123 &quot;OD x 0,00625&quot; ID x 0,003 &quot;Wall (ago infusione) </td><td> Parti piccole </td><td> HTXX-30R-06-05 </td><td></td></tr><tr><td> Intramedic PE 20 tubo (tubo di infusione) </td><td> VWR </td><td> 63019-025 </td><td></td></tr><tr><td> Clips Reflex, 9mm, non sterili </td><td> Kent Scientific Corp. </td><td> INS500346 </td><td> Alternative venditore: strumenti per le scienze Belle </td></tr><tr><td> Clip Applier Reflex per i clip 9mm </td><td> Kent Scientific Corp. </td><td> 12031-09 </td><td> Alternative venditore: strumenti per le scienze Belle </td></tr><tr><td> Curvo Hartman emostato </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 13003-10 </td><td></td></tr><tr><td> London pinza </td><td> Strumenti Sceince Belle </td><td> 11080-02 </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Clorexidina soluzione al 2% </td><td> Allivet </td><td> 30159 </td><td> Alternative venditore: PetSolutions </td></tr><tr><td> 10% di soluzione di iodio povidone </td><td> CVS </td><td> SKU # 739575 </td><td></td></tr><tr><td> Hot tallone sterilizzatore </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 610183 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Tabella di reagenti e attrezzature specifiche.

stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat

Molte funzioni comportamentali nei mammiferi, compresi roditori ed esseri umani, sono mediate principalmente da regioni cerebrali distinte. Un metodo comune per discernere la funzione di regioni cerebrali diverse per comportamenti o altri risultati sperimentali è quello di attuare una ablazione localizzata di funzione. Negli esseri umani, popolazioni di pazienti con lesioni cerebrali localizzate sono spesso studiati per deficit, nella speranza di rivelare la funzione di base della zona danneggiata. Nei roditori, si può indurre sperimentalmente lesioni di regioni specifiche del cervello. Lesione può essere realizzato in diversi modi. Lesioni elettrolitiche possono causare danni localizzati, ma per evitare di danneggiare una varietà di tipi di cellule così come attraversano le fibre provenienti da altre regioni del cervello che capita di essere vicino al sito della lesione. Inducibile tecniche genetiche utilizzando promotori specifici delle cellule di tipo può anche consentire site-specific targeting. Queste tecniche sono complessi e non sempre pratici a seconda della zona bersaglio del cervello. Excitotlesione ossico utilizzando chirurgia stereotassica, invece, è uno dei metodi più affidabili e pratici di neuroni eccitatori la lesione senza danneggiare locali cellule gliali o movimento fibre. Qui, presentiamo un protocollo per infusione stereotassico del eccitotossina, N-metil-D-aspartato (NMDA), nel complesso basolaterale amigdala. Utilizzando le indicazioni anatomiche, si applica coordinate stereotassiche per determinare la posizione della nostra regione di destinazione cervello e abbassare un ago per iniezioni sul posto appena sopra il bersaglio. Abbiamo poi infondere alla nostra eccitotossina nel cervello, con conseguente morte delle neuroni vicini. Mentre il nostro soggetto sperimentale di scelta è un topo, gli stessi metodi possono essere applicati ad altri mammiferi, con gli opportuni adattamenti in attrezzature e coordinate. Questo metodo può essere utilizzato in una varietà di regioni del cervello, compreso il basolaterale amigdala 1-6, altri nuclei amigdala 6, 7, 8 ippocampo, entorhinal corteccia prefrontale della corteccia 9 e 10. Può anche essere usate per somministrare composti biologici come vettori virali 1, 11. La tecnica di base stereotassico potrebbe anche essere adattato per l&#39;impianto di più pompe osmotiche permanenti, consentendo più prolungata esposizione ad un composto di interesse.

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Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Ablazione mirata della regione specifica del cervello (s) mediante infusione di uno eccitotossina utilizzando le coordinate stereotassico descritto. Questa tecnica può anche essere adattato per l&#39;infusione di altre sostanze chimiche nel cervello di ratto.

La chirurgia stereotassica della lesione eccitotossico di specifiche aree cerebrali nel ratto adulto

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

35.2K Views.  University of California Berkeley. Ablazione mirata della regione specifica del cervello (s) mediante infusione di uno eccitotossina utilizzando le coordinate stereotassico descritto. Questa tecnica può anche essere adattato per l'infusione di altre sostanze chimiche nel cervello di ratto.

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Rodent Stereotaxic Surgery and Animal Welfare Outcome Improvements for Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to investigate the effects of locally manipulated neurotransmitter and signaling pathways in awake, behaving animals. Moreover, the stereotaxic implantation of electrodes for electrophysiological stimulation and recording studies has been instrumental to our current understanding of neuroplasticity and brain networks in behaving animals. Ever-increasing knowledge about optimizing surgical techniques in rodents1-4, public awareness concerning animal welfare issues and stringent legislation (e.g., the 2010 European Union Directive on the use of laboratory animals5) prompted us to refine these surgical procedures, particularly with respect to implementing new procedures for oxygen supplementation and the continuous monitoring of blood oxygenation and heart rate levels during the surgery as well as introducing a standardized protocol for post-surgical care. Our observations indicate that these modifications resulted in an increased survival rate and an improvement in the general condition of the animals after surgery (e.g. less weight loss and a more active animal). This video presentation will show the general procedures involved in this type of stereotaxic surgery with special attention to our several modifications. We will illustrate these surgical procedures in rats, but it is also possible to perform this type of surgery in mice or other small laboratory animals by using special adaptors for the stereotaxic apparatus6.

Stereotaxic surgery on rodents allows for targeted administration of drugs or electrical stimulation and recordings in awake, behaving animals. In this video presentation we will demonstrate recent procedural refinements to this long-standing procedure that successfully improved survival rate and reduced post-surgical weight loss.

Chirurgia Stereotassica roditori e animali Miglioramenti Esito di assistenza sociale per Behavioral Neuroscience

Stereotaxic surgery for the implantation of cannulae into specific brain regions has for many decades been a very successful experimental technique to ...

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Neuroscienze

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Ampliamento della embrionali e cellule staminali neurali adulte per<em&gt; In Utero</em&gt; Elettroporazione o Viral iniezione stereotassica

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Micromanipolazione di espressione genica in Zebrafish adulti cervello con microiniezione Cerebroventricular di Morpholino oligonucleotidi

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Slice Cervello biotinilazione: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio alla Misura Regione-specifica proteina Tratta plasma membrana in neuroni adulti

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Usando fluorescenza cellulare attivo Ordinamento per esaminare Cell-Type-specifica espressione genica nel cervello di ratto tessuto

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, they may function to regulate the developmental process and/or physiological function in neonatal brains. To investigate neurobiological functions of specific genes in the brain, it is essential to inactivate genes in the brain. Here, we describe a simple stereotaxic method to inactivate gene expression in the striatum of transgenic mice at neonatal time windows. AAV-eGFP-Cre viruses were microinjected into the striatum of Ai14 reporter gene mice at postnatal day (P) 2 by stereotaxic brain surgery. The tdTomato reporter gene expression was detected in P14 striatum, suggesting a successful Cre-loxP mediated DNA recombination in AAV-transduced striatal cells. We further validated this technique by microinjecting AAV-eGFP-Cre viruses into P2Foxp2fl/fl mice. Double labeling of GFP and Foxp2 showed that GFP-positive cells lacked Foxp2 immunoreactivity in P9 striatum, suggesting the loss of Foxp2 protein in AAV-eGFP-Cre transduced striatal cells. Taken together, these results demonstrate an effective genetic deletion by stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre viruses in specific neuronal populations in the neonatal brains of floxed transgenic mice. In conclusion, our stereotaxic technique provides an easy and simple platform for genetic manipulation in neonatal mouse brains. The technique can not only be used to delete genes in specific regions of neonatal brains, but it also can be used to inject pharmacological drugs, neuronal tracers, genetically modified optogenetics and chemogenetics proteins, neuronal activity indicators and other reagents into the striatum of neonatal mouse brains.

We describe a protocol of stereotaxic surgery with a homemade head-fixed device for microinjecting reagents into the striatum of neonatal mouse brains. This technique allows genetic manipulation in neuronal cells of specific regions of neonatal mouse brains.

Chirurgia stereotassica per la manipolazione genetica in cellule striatali di cervelli di topo neonatale

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional investigation of long-range connections requires targeted recordings of single neurons combined with the specific stimulation of identified distant inputs. This is often difficult to achieve with conventional and electrical stimulation techniques, because axons from converging upstream brain areas may intermingle in the target region. The stereotaxic targeting of a specific brain region for virus-mediated expression of light-sensitive ion channels allows selective stimulation of axons originating from that region with light. Intracerebral stereotaxic injections can be used in well-delimited structures, such as the anterior thalamic nuclei, in addition to other subcortical or cortical areas throughout the brain.
Described here is a set of techniques for precise stereotaxic injection of viral vectors expressing channelrhodopsin in the mouse brain, followed by photostimulation of axon terminals in the brain slice preparation. These protocols are simple and widely applicable. In combination with whole-cell patch clamp recording from a postsynaptically connected neuron, photostimulation of axons allows the detection of functional synaptic connections, pharmacological characterization, and evaluation of their strength. In addition, biocytin filling of the recorded neuron can be used for post-hoc morphological identification of the postsynaptic neuron.

This protocol describes a set of methods to identify the cell-type specific functional connectivity of long-range inputs from distant brain regions using optogenetic stimulations in ex vivo brain slices.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Valutazione dell'induzione della depressione a lungo termine nelle fette di cerebellar adulto

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset (Callithrix jacchus)

Marmosets (Callithrix jacchus) are small non-human primates that are gaining popularity in biomedical and preclinical research, including the neurosciences. Phylogenetically, these animals are much closer to humans than rodents. They also display complex behaviors, including a wide range of vocalizations and social interactions. Here, an effective stereotaxic neurosurgical procedure for implantation of recording electrode arrays in the common marmoset is described. This protocol also details the pre- and postoperative steps of animal care that are required to successfully perform such a surgery. Finally, this protocol shows an example of local field potential and spike activity recordings in a freely behaving marmoset 1 week after the surgical procedure. Overall, this method provides an opportunity to study the brain function in awake and freely behaving marmosets. The same protocol can be readily used by researchers working with other small primates. In addition, it can be easily modified to allow other studies requiring implants, such as stimulating electrodes, microinjections, implantation of optrodes or guide cannulas, or ablation of discrete tissue regions.

Stereotaxic Surgery for Implantation of Microelectrode Arrays in the Common Marmoset Callithrix jacchus

This work presents a protocol to perform a stereotaxic, neurosurgical implantation of&#160;microelectrode arrays in the common marmoset. This method specifically enables electrophysiological recordings in freely behaving animals but can be easily adapted to any other similar neurosurgical intervention in this species (e.g., cannula for drug administration or electrodes for brain stimulation).