We are grateful for the support of the NREF foundation.

NOTA: Etica Dichiarazione: Tutte le procedure descritte in questo manoscritto sono in conformità con le linee guida NIH per la ricerca animale (Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio) e sono approvati dalla Scuola Medica Comitato IACUC Harvard. Preparazione 1. Pre-chirurgica <ol><li> Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici sono sterilizzati in autoclave sia o la pulizia con soluzione antisettica e / o etanolo, se necessario. Se possibile, utilizzare materiale monouso sterile come bisturi, aghi e siringhe. </li><li> Coprire il banco di lavoro con teli chirurgici e garantire che vi sia un rischio biologico di smaltimento disponibili. </li><li> Pesare il ratto e calcolare la dose di anestesia. Utilizzare un / Xilazina mix Ketamina (ketamina 75 mg / kg e Xilazina 10 mg / kg), per anestetizzare i topi. NOTA: Tra 200-250 g è il peso ottimale per il corretto fissaggio dell&#39;animale nel telaio stereotassico nonché per il targeting accurata della ATN. Isoflurane può essere utilizzato anche come agente anestetizzante. </li><li> Supporto e bloccare due elettrodi sterili (sterilizzato in autoclave o con ossido di etilene) sul supporto per elettrodi (Figura 2) di un telaio stereotassico chirurgica e con l&#39;aiuto di un microscopio (10-40X ingrandimenti), ispezionare le punte dell&#39;elettrodo per una corretta allineamento. Fissare i due elettrodi 3,0 millimetri di distanza. NOTA: Fare attenzione a non danneggiare l&#39;elettrodo toccando superfici dure. </li></ol> 2. DBS Chirurgia <ol><li> Iniettare la ketamina / Xilazina mix intraperitoneale all&#39;animale e confermare che l&#39;animale ha raggiunto un piano chirurgica di anestesia (controllando per la reflex toe-pizzico, la frequenza respiratoria e la profondità e la regolarità della respirazione). Rimuovere capelli dalla regione del cuoio capelluto che verrà incisa e disinfettare il cuoio capelluto con 3 scrub alternati ciascuno di betadine e alcole o soluzione fisiologica sterile. Sicuro e posizionare l&#39;animale sul fram stereotassicae. </li><li> Usa circolano pastiglie di acqua calda per mantenere la temperatura del corpo dell&#39;animale ad un livello ottimale. Applicare il lubrificante occhio agli occhi dell&#39;animale per proteggere dalla overdrying. </li><li> Utilizzare i seguenti coordinate stereotassica per mira il ATN (anteriore nucleo del talamo): anterioposterior -1.6 mm, mediolaterale 1,5 mm dorsoventrale 5,2 millimetri 1. NOTA: Le coordinate stereotassica si basano sulla Paxinos e Watson (6 ° edizione) Rat Brain atlas 36. </li><li> Fare un&#39;incisione nel cuoio capelluto sagittalmente per rivelare il cranio. Utilizzando un paio di divaricatori fissare il cuoio inciso per esporre il cranio. Utilizzare soluzione salina sterile per irrigare l&#39;incisione. Se incisione è troppo bagnato, usare tamponi di cotone sterili ad asciugare. Individuare il bregma e segnare con un pennarello nero. Per guidare la posizione dei fori di bave, rendono più due marchi in approssimativamente di 1,5 mm mediolaterally su entrambi i lati dalla sutura sagittale e 1,6 mm posteriormente al coronal sutura. </li><li> Utilizzare un trapano a mano per fare i buchi bave. Assicurarsi che la punta del foro bava è sterile mediante sterilizzazione con etanolo. Tenere il trapano a circa 45 ° rispetto alla superficie del cranio durante la foratura. Cambiare spesso tra i due fori bave per evitare eccessivo calore nella posizione di qualsiasi foro cranico. </li><li> Continuare fino a quando la perforazione dura è esposto. Utilizzando un ago con la punta piegata simile forma di &#39;L&#39;, rimuovere eventuali frammenti di osso che impedirebbero l&#39;inserimento dell&#39;elettrodo. Fare attenzione a non danneggiare la dura e / o cerebrale sottostante tessuto durante la rimozione di frammenti ossei utilizzando l&#39;ago piegato. NOTA: Utilizzando un ago smussato o pinza sottile contundenti è anche un&#39;opzione. </li><li> Fissare il gruppo doppio elettrodo al manico girevole del telaio stereotassico e fissare il manico con un angolo di 90 °. Utilizzando le regolazioni del telaio stereotassico, posizionare l&#39;elettrodo sinistra esattamente sopra il bregma. </li><li> Utilizzando lo stereorettifiche tattiche di posizionamento mediolaterale, muovono precisamente l&#39;elettrodo sinistra da 1,5 mm per il lato sinistro del bregma tale che vi sono due elettrodi perfettamente allineati lungo la sutura coronale ma distanziate a 1,5 millimetri mediolaterally dal bregma. </li><li> Utilizzando le regolazioni stereotassica anterioposterior, spostare gli elettrodi 1,6 millimetri posteriormente al sutura coronale. </li><li> Utilizzare le regolazioni dorsoventrale per abbassare gli elettrodi al primo controllo se i fori bave sono state effettuate nella posizione giusta in modo che gli elettrodi possono essere inseriti con facilità, senza toccare gli spigoli dei fori bave. Se è così, inserire gli elettrodi ad una profondità di 5,2 mm dalla superficie del cranio. </li><li> Collegare gli elettrodi tramite porta ad uno stimolatore fissato a 130 Hz, 2,5 V e 90 msec pulsewidth 1. </li><li> Invia stimolazione ad alta frequenza per un&#39;ora (o per un periodo di tempo desiderato secondo apparato sperimentale). Nel corso della stimolazione, ricordarsi di assicurare proper profondità dell&#39;anestesia regolarmente controllando l&#39;assenza di recesso piede in risposta ad una presa punta. Supplemento anestesia con circa metà della dose iniziale usato per indurre anestesia. Evitare la contaminazione dei tuoi guanti sterili durante il controllo profondità dell&#39;anestesia e modificarle, se necessario. Eseguire la stimolazione unilaterale o bilaterale in base alle esigenze sperimentali di uno. Includere controlli come la stimolazione a bassa frequenza (per es., 10 Hz) e gli animali non stimolate (inserimento elettrodi senza stimolazione successiva). </li><li> Dopo la stimolazione è fatto, rimuovere con attenzione gli elettrodi e suturare l&#39;incisione con 3-0 punti di sutura o con punti chirurgici sterili. </li><li> Somministrare buprenorfina (0,05 mg / kg) per via sottocutanea in analgesia. Monitorare l&#39;animale fino a tornare alla normale attività e poi tornare alla struttura alloggiativa. </li><li> Dopo un periodo di tempo sulla base del disegno sperimentale (per esempio, 0, 3, 6 o 12 ore dopo l&#39;intervento chirurgico DBS), Eutanasia l&#39;animale con overdose anestesia. Dopo aver confermato l&#39;assenza di segni vitali, decapitare il animali. </li><li> Sezionare il cervello prima di rimuovere la pelle con le forbici. Tagliare l&#39;osso lungo la sutura sagittale con le forbici dissezione. Effettuare altre due incisioni (circa un pollice ciascuna) attraverso l&#39;osso su entrambi i lati laterali. Utilizzando pinze, sollevare il pezzo di osso parzialmente reciso dalla sommità del cranio per esporre il cervello. </li><li> Utilizzando forbici o pinze sottili, staccare il cervello dal cranio e trasferire ad una capsula di Petri con PBS freddo sul ghiaccio. NOTA: Fare attenzione per evitare danni al cervello rendendo le incisioni attraverso l&#39;osso. </li></ol> 3. Hippocampus Isolation NOTA: Eseguire tutte le fasi successive di questa sezione sul ghiaccio. <ol><li> Posizionare il cervello su una matrice acrilica cerebrale pre-raffreddata in ghiaccio. Utilizzando una lama di rasoio, tagliare il cervello coronale a circa 7-8 mm dal antero-più edge del cervello. Fare un secondo taglio coronale e posteriore per il primo taglio in modo tale che una fetta cervello di circa 5 mm di spessore può essere rimosso. </li><li> Trasferire la fetta cervello di una capsula di Petri con PBS freddo. Utilizzando lama di rasoio, tagliare le due sezioni emisferiche e prendersi cura notare che emisfero corrisponde, rispettivamente, ai lati sinistro e destro. Questo è particolarmente importante durante l&#39;esecuzione stimolazioni unilaterali. </li><li> Utilizzando una pinza sottile e forbici rimuovere con attenzione l&#39;ippocampo. </li><li> Flash congelare il tessuto dell&#39;ippocampo in ghiaccio secco e conservare in freezer a -20 ° C fino al momento per le fasi di estrazione RNA successive. NOTA: Per la conservazione a lungo termine, si consiglia di conservare il tessuto in una -80 ° C freezer. </li></ol> 4. RNA Estrazione e PCR quantitativa <ol><li> Assicurarsi che il tessuto rimane congelato in ghiaccio secco fino al momento omogeneizzazione. </li><li> NOTA: Eseguire questo passaggio nella cappa. <ol><li> Aggiungere 1 ml di Tri reagente Hipptessuto ocampal in una provetta da centrifuga da 1,5 ml ed omogeneizzare dal primo pipettaggio più volte fino a quando il tessuto è rotto in pezzi più piccoli. Ulteriori omogeneizzare il tessuto passando attraverso una siringa con un ago 25 G fino a quando nessun tessuto ininterrotta visibile. Eseguire le operazioni di omogeneizzazione sul ghiaccio. </li><li> Dopo omogeneizzazione del tessuto, permette la sospensione cellulare a riposare a temperatura ambiente per 5 minuti per consentire la lisi cellulare. NOTA: Dopo questo punto la sospensione cellulare può essere veloce congelate e conservate a -70 ° C fino ad ulteriore lavorazione. </li></ol></li><li> Aggiungere 0,2 ml di cloroformio e mescolare nel vortex per 20 secondi e lasciare la soluzione riposo a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Centrifugare i campioni a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione i tubi senza disturbare i tre strati separati che saranno visibili. NOTA: La fase (rosso) in basso contiene proteine, mezzo fase nuvoloso contiene DNA e la fase superiore libero contiene RN / A. </li><li> Trasferire il top fase chiaro (RNA) in un nuovo 1,5 ml tubo da centrifuga (tipicamente 500 ml di RNA contenente fase si ottiene). Per questo aggiungere 0,5 ml di isopropanolo e mescolare nel vortex. A questo si aggiunge 2-3 glicogeno microlitri (20 mg / ml) come vettore per l&#39;RNA. Lasciare il campione a riposo sul tavolo a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Centrifugare il campione a 12.000 xg per 1 ora a 4 ° C. Assicurarsi che il pellet di RNA è visibile nella parte inferiore del tubo. </li><li> Eliminare il surnatante e lavare il pellet di RNA aggiungendo 1 ml di etanolo al 75% (a base di acqua priva di nucleasi). Invertire le più volte campione finché il pellet dislodges dal fondo del tubo e galleggia nella soluzione. Centrifugare la soluzione a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C. NOTA: Il precipitato in 75% etanolo può essere conservato a -20 ° C fino ulteriori passi. </li><li> Consentire il pellet di RNA asciugare lasciando le provette aperte per 5 min a temperatura ambiente. Prendere precauzioni per evitare over essiccazione del pellet in quanto questo potrebbe compromettere la dissoluzione in acqua nel passaggio successivo. </li></ol> 5. Rimozione DNA dal RNA Preparazione <ol><li> Aggiungere 9 ml di acqua priva di nucleasi al pellet di RNA e assicurarsi che il pellet viene sciolto prima di procedere vortex delicatamente il tubo. Per questo aggiungere 1 ml di 10x DNasi I Buffer e 1 ml DNasi ricombinante (da DNase kit I), mescolare delicatamente sfogliando i tubi, brevemente girare i tubi e incubare a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua per 30 minuti. </li><li> Aggiungere 2 ml di reagente inattivazione DNasi (da DNasi kit I) al campione e incubare a temperatura ambiente per 2 minuti e mescolare spesso muovendo delicatamente il tubo. Centrifugare a 12.000 xg per 10 minuti e il trasferimento di circa 10 ml di surnatante limpido di un nuovo 1,5 ml provetta da centrifuga. </li><li> Misurare la concentrazione di RNA con un NanoDrop o spettrofotometro. </li></ol> 6. Fare cDNA da RNA <ol><li> Aggiungi th volumi richiestiin contiene 1 mg di RNA e portare il volume totale a 8 microlitri aggiungendo acqua priva di nucleasi. Per questo aggiungere dNTP 1 ml 10 mM mix e 1 ml di esameri casuali dal Kit Apice First Strand Synthesis. Mescolare delicatamente e incubare a 65 ° C per 5 minuti in una vasca di acqua o in un termociclatore pre-programmato. </li><li> Fare un premiscelato contenente i seguenti reagenti: 2 ml di 10x RT Buffer, 4 ml di 25 M MgCl 2, 2 ml di 0,1 M DTT e 1 ml di RNAsi OUT (40 U / ml). NOTA: I volumi indicati sono per reazione, l&#39;utente avrebbe bisogno di scalare fino in base alle proprie esigenze sperimentali. </li><li> Dopo aver rimosso l&#39;RNA contenente campioni da 65 ° C, impostare il tubo a temperatura ambiente per un minuto. Aggiungere la soluzione prediluita 9 ml e incubare a temperatura ambiente per 2 min. Aggiungere 1 ml di Superscript II enzima trascrittasi inversa (50 U / mL) e poi incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Incubare i campioni a 42 ° C per 50min per la trascrizione inversa a verificarsi. </li><li> Incubare i campioni a 70 ° C per 15 minuti per terminare la reazione. </li><li> Mettere i campioni in ghiaccio brevemente e aggiungere 1 ml RNaseH (2 U / ml) e incubare a 37 ° C per 20 min. </li><li> Brevemente centrifugare le provette a 3000 xg per centrifugare il liquido di condensa. NOTA: Questo è il cDNA che verrà utilizzato per la PCR quantitativa. cDNA può essere conservato in congelatore a -20 ° C finché configurazione PCR. cDNA può essere diluito con acqua priva di nucleasi prima di procedere alla PCR. </li></ol> 7. PCR quantitativa <ol><li> Fai un master mix contenente i seguenti reagenti (i volumi indicati sono per reazione): 6.3 ml di 2x Sybr verde Mix, 0,6 ml di Forward Primer (10 micron), 0,6 ml di Reverse Primer (10 micron) e 0,5 ml di acqua priva di nucleasi . NOTA: il design Primer è stato fatto con il &#39;pick Primer&#39; opzione nella pagina di sequenza nucleotidica del NCBI per il gene di interesse. </li><li> Aggiungere 10 microlitri mastermix a ciascun pozzetto di una piastra PCR 96 ben. Aggiungere 2,5 ml di cDNA fatte in precedenza per il pozzetto contenente il Mastermix. Assicurati di impostare reazioni PCR in triplicato per ogni campione. </li><li> Dopo aver completato l&#39;aggiunta di mastermix e cDNA, coprire la piastra PCR utilizzando un foglio adesivo ottico per sigillare i pozzetti. Spin brevemente la piastra per 5 minuti a 500 xg in una centrifuga da tavolo per risolvere tutto il liquido sul fondo del pozzo. </li><li> Caricare la piastra PCR su una macchina di RT-PCR pre-programmato. Utilizzare i parametri PCR di cui alla tabella 1. </li><li> Analisi dei dati: Utilizzare i valori C t dall&#39;uscita qPCR per ulteriori calcoli. Insieme con il gene di prova, impostare reazioni PCR per i geni di controllo interno, 18S rRNA (garantire parità di ingresso) e β-actina (controllo negativo). Calcola modifiche piega secondari di ΔΔCt 37. </li></ol>

The authors have no disclosures.

Dopo il lavoro di riferimento per Benabid et al. Utilizzando la stimolazione cerebrale profonda per il trattamento di malattia di Parkinson e tremore essenziale, la tecnica chirurgica DBS è stata studiata con molto interesse negli ultimi dieci anni per il trattamento di molti disturbi neurologici 6,10,43. Studi DBS rivolti varie regioni neuro-anatomica del circuito cerebrale sono attualmente svolte da molti gruppi per affrontare le principali malattie neuronali e sono in varie fasi di sperimentazion...

La storia dietro lo sviluppo di stimolazione cerebrale profonda come tecnica neurochirurgica risale al 1870, quando è stata esplorata la possibilità di stimolare elettricamente il circuito cerebrale 2. L&#39;uso della stimolazione ad alta frequenza cronica come trattamento per disturbi neuronali iniziato nel 1960 3. Successivamente nel 1990 con l&#39;avvento di impiantazione cronica DBS elettrodi 4-6, il numero di disturbi neuronali che sono stati trattati con DBS continuato ad aumentare. Stimolazione cerebrale profonda è stato utilizzato negli Stati Uniti come trattamento per il tremore essenziale 6. Oggi l&#39;intervento è ampiamente utilizzato per il trattamento di disturbi neuronali che sono attualmente incurabili dall&#39;intervento farmacologico. DBS è attualmente utilizzato per il trattamento di disturbi del movimento del morbo di Parkinson e distonia 7-9. Alzheimer tipo di demenza, la malattia, l&#39;epilessia, il dolore e le malattie neuropsichiatriche come la depressione di Huntington, OCD, Tourette7; s sindrome e la dipendenza sono alcune delle condizioni suscettibili di trattamento con DBS 10-12. Mentre la chirurgia DBS è approvato dalla FDA per il trattamento del morbo di Parkinson, distonia e tremore essenziale, l&#39;utilizzo di DBS per il trattamento di altre condizioni di cui sopra sono in varie fasi di laboratorio e studi clinici che offrono molte promesse ai pazienti 13,14. Clinicamente, la chirurgia DBS viene eseguita in due fasi. La prima fase consiste chirurgicamente posizionamento degli elettrodi DBS nella posizione anatomica mirata utilizzando una combinazione di posizionamento radiologica, CT, MRI e letture di microelettrodi per una maggiore precisione. La seconda fase prevede l&#39;impianto di un generatore di impulsi nella parte superiore del torace del paziente e l&#39;estensione installazione conduce dal cuoio capelluto al generatore di impulsi. Sulla base della condizione neurologica, diversi schemi di programmazione per il generatore di impulsi sono stati standardizzati e vengono utilizzati per fornire la tensione desiderata. Il vol finaletage viene raggiunta in modo graduale in modo da ricevere la migliore risposta clinica con la minima tensione 15. Tuttavia, nei nostri studi, a differenza degli impianti croniche DBS usato in clinica, per semplicità, si è fatto ricorso a studiare una stimolazione ad alta frequenza di una volta (per 1 ora) nei nostri modelli animali. Parte della ricerca del nostro gruppo si concentra sullo studio l&#39;uso della chirurgia DBS per il trattamento-refrattaria epilessia. Approcci chirurgici stereotassica con stimolazione ad alta frequenza è stato esplorato da molti altri come un&#39;opzione efficace per il trattamento dell&#39;epilessia medico-refrattario che costituisce circa il 30% di tutti i casi di epilessia 10,16,17. Stimolazione cerebellare mira la superficie corticale, nonché i nuclei profondi del cervelletto sono stati utilizzati in passato come bersagli per il trattamento dell&#39;epilessia 10,18,19. Inoltre, la stimolazione ippocampo è stato anche provato ma con risultati alterni 20,21. Alcuni degli altri indagatiObiettivi DBS per l&#39;epilessia comprendono la corteccia cerebrale, nel talamo, nucleo subtalamico e nervo vago 8. Tuttavia, a seguito dei risultati di diversi studi negli ultimi anni, il nucleo del talamo anteriore (ATN) è emerso come la destinazione più comune DBS per il trattamento dell&#39;epilessia 10,22. Sulla base delle conoscenze su circuiti neuroanatomici e risultati di modelli animali, molti studi si sono concentrati sull&#39;effetto terapeutico di stimolazione cerebrale profonda del ATN nel trattamento dell&#39;epilessia 23-26. La ATN è parte del circuito limbico e si trova nella regione del cervello che colpisce frequenza delle crisi. Gli studi di Hamani et al., Hanno testato l&#39;efficacia di ATN-DBS in un pilocarpina indotta modello di epilessia e ha scoperto che la stimolazione bilaterale ATN latenze per convulsioni pilocarpina indotta e lo stato epilettico prolungato 24. Inoltre, la stimolazione ad alta frequenza della ATN è stato trovato per ridurre la frequenza delle crisi in un pentylenetetrazol (PTZ) il modello di epilepsy 25,27-29. Lee et al., Hanno riportato una riduzione media della frequenza delle crisi di circa il 75% al momento della stimolazione cerebrale profonda cronica della ATN nel trattamento epilessia parziale refrattaria 30. Un recente studio clinico sul trattamento dell&#39;epilessia refrattaria ha mostrato risultati promettenti dopo l&#39;intervento chirurgico DBS rivolte al nucleo talamico anteriore (ATN) 22. Uno studio clinico multicentrico randomizzato con 110 pazienti sottoposti a DBS bilaterale del ATN per il trattamento dell&#39;epilessia refrattaria (prova SANTE) ha indicato una diminuzione della frequenza delle crisi di circa il 40% 31. I risultati di questo studio ha anche accennato a un effetto anti-epilettico ottimale ritardo osservato 2-3 mesi dopo l&#39;intervento chirurgico. Ulteriori studi di Toda et al., Corroborate con questi risultati in cui hanno dimostrato neurogenesi accadendo in un momento post successivo DBS (giorni 3-5) in modelli animali 1. Inoltre, Encinas et al., Hanno riportato neurogena hippocampalsis nel topo adulto giro dentato dopo stimolazione ad alta frequenza della ATN 32. Precedenti studi hanno segnalato in calo 33-35 neurogenesi ippocampale in alcuni casi di epilessia come l&#39;epilessia del lobo temporale cronica e un&#39;associazione con deficit di apprendimento, disturbi della memoria e spontanee crisi motorie ricorrenti. Inoltre, c&#39;è stata una riduzione in fattori neurali progenitrici di cellule staminali, come FGF2 e IGF-1 nell&#39;ippocampo cronicamente epilettico in modelli animali 33. Considerando questo, strategie di intervento come la DBS che mostrano un aumento della neurogenesi nel giro dentato sono strade interessanti per la ricerca. Questi risultati ci hanno incoraggiato a esplorare ulteriormente in profondità nel meccanismo sottostante trattamento neurogenesi post-DBS per l&#39;epilessia. Abbiamo preso di mira il ATN sia unilateralmente (dati non riportati) e bilaterale (in risultati rappresentativi) e visto elevati neurotrofina (BDNF) espressione del giro dentato di ratto. Il nostro corrente ipotesi è che l&#39;espressione di BDNF avvia una cascata di espressione genica che culmina in neurogenesi che traduce l&#39;effetto anti-epilettico di chirurgia DBS. In questo articolo presentiamo i nostri metodi per la chirurgia DBS mira la ATN nei ratti seguita da analisi di espressione genica come approccio interessante per studiare il meccanismo alla base dei benefici di DBS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1211">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:236px;">Deep Brain Stimulation Surgery</td>
			<td style="width:229px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:604px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent/Equipment</td>
			<td>Vendor Name</td>
			<td>Catalog No.&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereotactic frame</td>
			<td>Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Drill&#160;</td>
			<td>Dremmel</td>
			<td>7700, 7.2 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scalpel</td>
			<td>BD</td>
			<td>372610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketamine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637</td>
			<td>Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xylazine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-808-1947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenorphine</td>
			<td>Patterson Veterinary</td>
			<td>07-850-2280</td>
			<td>Schedule III Controlled Substance, procurement, use and storage according to institutional rules</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical staples</td>
			<td>ConMed Corporation</td>
			<td>8035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sutures (3-0)&#160;</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>72-3333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (1 ml, 29 1/2 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>329464</td>
			<td>Sterile, use for Anesthesia administration intraperitoneally</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (3 ml, 25 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309570</td>
			<td>Sterile, use for Analgesia administration subcutaneously</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305761</td>
			<td>Sterile, use for clearing broken bone pieces from the burr holes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25309B</td>
			<td>Use for general sterilization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Eye Lubricant</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-898-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stimulator</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>Model 3628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DBS electrodes</td>
			<td>Rhodes Medical Instruments, CA</td>
			<td>SNEX100x-100mm</td>
			<td>Electrodes are platinum, concentric and bipolar</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Betadine (Povidone-Iodine)&#160;</td>
			<td>PDI</td>
			<td>S23125</td>
			<td>Single use swabsticks, use for sterilizing the scalp before making incision&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="2" height="25" style="height:25px;">&#160;Brain Dissection and Hippocampal tissue isolation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent/Equipment</td>
			<td>Vendor Name</td>
			<td>Catalog No.&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acrylic Rodent Brain Matrix</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>175-300</td>
			<td>www.emsdiasum.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Razor Blade</td>
			<td>V W R</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Guillotine Scissors</td>
			<td>Clauss</td>
			<td>18039</td>
			<td>For decapitation, make sure these scissors are maintained in clean and working condition</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td>Codman Classic</td>
			<td>34-4098</td>
			<td>Use for removing the brain from the skull</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72957-06</td>
			<td>Use for removing the brain from the skull and for handling during dissection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline&#160;</td>
			<td>Boston Bioproducts</td>
			<td>BM-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td colspan="2" height="25" style="height:25px;">&#160;RNA Extraction and cDNA Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent/Equipment</td>
			<td>Vendor Name</td>
			<td>Catalog No.&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tri Reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9424</td>
			<td>Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe (3 ml, 25 G)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309570</td>
			<td>Use for tissue homogenization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1145-1</td>
			<td>Always use in a fume hood and wear protective goggles while handling; avoid contact with skin</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycogen</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dnase I Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superscript First Strand Synthesis Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11904-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tabletop Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">&#160;Quantitative PCR</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Reagent/Equipment</td>
			<td>Vendor Name</td>
			<td>Catalog No.&#160;</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYBR Green PCR Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>204143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Custom Oligos</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10668051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PCR Plates (96 wells)</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>C18080-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Optical Adhesive Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease free Water</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SH30538-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Real Time PCR Machine</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>7500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus

Stimolazione cerebrale profonda (DBS) Chirurgia, mira diverse regioni del cervello, come i gangli basali, talamo, e le regioni subtalamico, è un trattamento efficace per diversi disturbi del movimento che non sono riusciti a rispondere ai farmaci. I recenti progressi nel campo della chirurgia DBS ha iniziato a estendere l&#39;applicazione di questa tecnica chirurgica per altre condizioni diverse come obesità patologica, depressione e disturbo ossessivo compulsivo. Nonostante queste indicazioni in espansione, si sa ancora poco sui meccanismi fisiologici di base che facilitano gli effetti benefici della chirurgia DBS. Un approccio a questa domanda è quello di eseguire analisi di espressione genica nei neuroni che ricevono la stimolazione elettrica. Precedenti studi hanno dimostrato che la neurogenesi nel giro dentato di ratto è suscitato in DBS mira del nucleo anteriore del talamo 1. Chirurgia DBS mira il ATN è ampiamente utilizzato per il trattamento di epilessia refrattaria. E &#39;quindi di molto interest per noi per esplorare i cambiamenti trascrizionali indotte stimolando elettricamente il ATN. In questo manoscritto, descriviamo le nostre metodologie per la chirurgia DBS stereotassica guidata mira la ATN in adulti ratti maschi Wistar. Discutiamo anche i passi successivi per la dissezione dei tessuti, l&#39;isolamento di RNA, la preparazione cDNA e RT-PCR quantitativa per misurare i cambiamenti di espressione genica. Questo metodo può essere applicato e modificate per stimolare i gangli basali e altre regioni del cervello comunemente clinicamente mirata. Lo studio dell&#39;espressione genica descritto qui assume un approccio del gene bersaglio candidato per scoprire attori molecolari che potrebbero essere dirigere il meccanismo di DBS.

Le figure 1A e 1B mostrano la relativa espressione di BDNF e GABRD rispetto al gene di controllo β-actina. BDNF, una neurotrofina è spesso associata a effetti neuroprotettivi in molte malattie neuronali 38-41. È quindi interessante analizzare il profilo di espressione di BDNF in risposta alla stimolazione della ATN che produce benefici terapeutici per pazienti epilettici. Nella figura 1A che mostra il profilo di espressione genica del BDNF attraverso i pun...

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Analysis of Gene Expression Changes in the Rat Hippocampus After Deep Brain Stimulation of the Anterior Thalamic Nucleus

The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

Analisi delle variazioni di espressione genica nel Rat Hippocampus Dopo stimolazione cerebrale profonda del nucleo anteriore talamiche

Deep brain stimulation (DBS) surgery, targeting various regions of the brain such as the basal ganglia, thalamus, and subthalamic regions, is an effective ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.8K Views.  Brigham & Women's Hospital, Harvard Medical School. The mechanism underlying the therapeutic effects of Deep Brain Stimulation (DBS) surgery needs investigation. The methods presented in this manuscript describe an experimental approach to examine the cellular events triggered by DBS by analyzing the gene expression profile of candidate genes that can facilitate neurogenesis post DBS surgery.

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TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS display abnormalities in the expression of FMR1 - a protein required for typical, healthy neural development.3 Recent data has suggested that the loss of this protein can cause the cortex to be hyperexcitable thereby affecting overall patterns of neural plasticity.4,5
In addition, Fragile X shows a strong comorbidity with autism: in fact, 30% of children with FXS are diagnosed with autism, and 2 - 5% of autistic children suffer from FXS.6
Transcranial Magnetic Stimulation (a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses 7,8) represents a unique method of exploring plasticity and the manifestations of FXS within affected individuals. More specifically, Theta-Burst Stimulation (TBS), a specific stimulatory protocol shown to modulate cortical plasticity for a duration up to 30 minutes after stimulation cessation in healthy populations, has already proven an efficacious tool in the exploration of abnormal plasticity.9,10 
Recent studies have shown the effects of TBS last considerably longer in individuals on the autistic spectrum - up to 90 minutes.11 This extended effect-duration suggests an underlying abnormality in the brain's natural plasticity state in autistic individuals - similar to the hyperexcitability induced by Fragile X Syndrome.
In this experiment, utilizing single-pulse motor-evoked potentials (MEPs) as our benchmark, we will explore the effects of both intermittent and continuous TBS on cortical plasticity in individuals suffering from FXS and individuals on the Autistic Spectrum.

In this article, we examine the effects of Theta-Burst TMS stimulation on cortical plasticity in individuals suffering from Fragile X syndrome and individuals on the autistic spectrum.

TMS: Utilizzo del Theta Burst protocollo Esplora Mechasnism di plasticità in individui con Sindrome X Fragile e autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Ricerca

Neuroscienze

The NeuroStar TMS Device: Conducting the FDA Approved Protocol for Treatment of Depression

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic fields. These rapidly alternating fields induce electrical currents within localized, targeted regions of the cortex which are associated with various physiological and functional brain changes.1,2,3
In 2007, O'Reardon et al., utilizing the NeuroStar device, published the results of an industry-sponsored, multisite, randomized, sham-stimulation controlled clinical trial in which 301 patients with major depression, who had previously failed to respond to at least one adequate antidepressant treatment trial, underwent either active or sham TMS over the left dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). The patients, who were medication-free at the time of the study, received TMS five times per week over 4-6 weeks.4
The results demonstrated that a sub-population of patients (those who were relatively less resistant to medication, having failed not more than two good pharmacologic trials) showed a statistically significant improvement on the Montgomery-Asberg Depression Scale (MADRS), the Hamilton Depression Rating Scale (HAMD), and various other outcome measures. In October 2008, supported by these and other similar results5,6,7, Neuronetics obtained the first and only Food and Drug Administration (FDA) approval for the clinical treatment of a specific form of medication-refractory depression using a TMS Therapy device (FDA approval K061053).
In this paper, we will explore the specified FDA approved NeuroStar depression treatment protocol (to be administered only under prescription and by a licensed medical profession in either an in- or outpatient setting).

In this article, we examine the methodology and considerations relevant to the FDA approved depression treatment protocol using the Neuronetics NeuroStar TMS device.

Il dispositivo TMS NeuroStar: Condurre la FDA ha approvato protocollo per il trattamento della depressione

The Neuronetics NeuroStar Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) System is a class II medical device that produces brief duration, pulsed magnetic ...

Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate a method to fabricate suction electrodes that are used to examine CPG activity, or fictive locomotion, in dissected rodent spinal cords. The rodent spinal cords are placed in artificial cerebrospinal fluid and the ventral roots are drawn into the suction electrode. The electrode is constructed by modifying a commercially available suction electrode. A heavier silver wire is used instead of the standard wire given by the commercially available electrode. The glass tip on the commercial electrode is replaced with a plastic tip for increased durability. We prepare hand drawn electrodes and electrodes made from specific sizes of tubing, allowing consistency and reproducibility. Data is collected using an amplifier and neurogram acquisition software. Recordings are performed on an air table within a Faraday cage to prevent mechanical and electrical interference, respectively.

A demonstration of the fabrication and use of an extracellular suction electrode used to measure electrophysiological recordings of neonatal rodent spinal cords in vitro

Spinal Cord Elettrofisiologia II: extracellulare fabbricazione di elettrodi di aspirazione

Development of neural circuitries and locomotion can be studied using neonatal rodent spinal cord central pattern generator (CPG) behavior. We demonstrate ...

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

Ottimizzato Analisi della metilazione del DNA e l&#39;espressione genica da piccole aree anatomicamente definiti del cervello

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Laser Microdissezione Cattura di popolazioni Arricchito di neuroni singoli neuroni o per analisi di espressione genica dopo trauma cranico

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Micromanipolazione di espressione genica in Zebrafish adulti cervello con microiniezione Cerebroventricular di Morpholino oligonucleotidi

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

La stimolazione cerebrale profonda con simultanea fMRI in Roditori

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Usando fluorescenza cellulare attivo Ordinamento per esaminare Cell-Type-specifica espressione genica nel cervello di ratto tessuto

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Stereotaxic Infusion of Oligomeric Amyloid-beta into the Mouse Hippocampus

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the over-production of amyloid-beta and the deposition of amyloid-beta plaques in brain regions of the afflicted individuals. Throughout the years scientists have generated numerous Alzheimer&#8217;s disease mouse models that attempt to replicate the amyloid-beta pathology. Unfortunately, the mouse models only selectively mimic the disease features. Neuronal death, a prominent effect in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients, is noticeably lacking in these mice. Hence, we and others have employed a method of directly infusing soluble oligomeric species of amyloid-beta - forms of amyloid-beta that have been proven to be most toxic to neurons - stereotaxically into the brain. In this report we utilize male C57BL/6J mice to document this surgical technique of increasing amyloid-beta levels in a select brain region. The infusion target is the dentate gyrus of the hippocampus because this brain structure, along with the basal forebrain that is connected by the cholinergic circuit, represents one of the areas of degeneration in the disease. The results of elevating amyloid-beta in the dentate gyrus via stereotaxic infusion reveal increases in neuron loss in the dentate gyrus within 1 week, while there is a concomitant increase in cell death and cholinergic neuron loss in the vertical limb of the diagonal band of Broca of the basal forebrain. These effects are observed up to 2 weeks. Our data suggests that the current amyloid-beta infusion model provides an alternative mouse model to address region specific neuron death in a short-term basis. The advantage of this model is that amyloid-beta can be elevated in a spatial and temporal manner.

Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.

Infuso stereotassico di Oligomeric amiloide-beta nelle Hippocampus mouse

Alzheimer&#8217;s disease is a neurodegenerative disease affecting the aging population. A key neuropathological feature of the disease is the ...

Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, dystonia or tremor. DBS is based on the delivery of electrical stimuli to specific deep anatomic structures of the central nervous system. However, the mechanisms underlying the effect of DBS remain enigmatic. This has led to an interest in investigating the impact of DBS in animal models, especially in rats. As DBS is a long-term therapy, research should be focused on molecular-genetic changes of neural circuits that occur several weeks after DBS. Long-term DBS in rats is challenging because the rats move around in their cage, which causes problems in keeping in place the wire leading from the head of the animal to the stimulator. Furthermore, target structures for stimulation in the rat brain are small and therefore electrodes cannot easily be placed at the required position. Thus, a set-up for long-lasting stimulation of rats using platinum/iridium electrodes with an impedance of about 1 M&#937; was developed for this study. An electrode with these specifications allows for not only adequate stimulation but also recording of deep brain structures to identify the target area for DBS. In our set-up, an electrode with a plug for the wire was embedded in dental cement with four anchoring screws secured onto the skull. The wire from the plug to the stimulator was protected by a stainless-steel spring. A swivel was connected to the circuit to prevent the wire from becoming tangled. Overall, this stimulation set-up offers a high degree of free mobility for the rat and enables the head plug, as well as the wire connection between the plug and the stimulator, to retain long-lasting strength.

A method for implanting electrodes into the subthalamic nucleus (STN) of rats is described. Better localization of the STN was achieved by using a microrecording system. Furthermore, a stimulation set-up is presented that is characterized by long-lasting connections between the head of the animal and the stimulator.

Microelettrodo guidata impianto di elettrodi nel subtalamico Nucleo di Ratti per lungo termine stimolazione cerebrale profonda

Deep brain stimulation (DBS) is a widely used and effective therapy for several neurologic disorders, such as idiopathic Parkinson&#8217;s disease, ...