Name: culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment
Uploaded: 2014-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of HealthGrants DK85035 e DK074797 (IH).

1. Ceppi Worm <ol><li> Ottenere C. elegans tipo selvatico ceppi Bristol N2 dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) e li mantengono su piastre NGM seminato con E. coli ceppo OP50 7. Nota: verme transgenico ceppi IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) utilizzati sono stati generati come descritto in precedenza 11. IQ6011 può essere richiesto all&#39;autore corrispondente. </li></ol> 2. Preparazione di Modified C. elegans Habitation e riproduzione Medium (mCeHR) Preparare mCeHR mezzi liquidi come descritto di seguito 12. Questo supporto liquido axenic permette ai vermi di crescere senza fonti di cibo supplementari. Eseguire tutte le manipolazioni di mezzi liquidi axeniche e worm axeniche utilizzando condizioni rigorosamente sterile come una cappa a flusso laminare. <ol><li> Ottenere il latte pastorizzato ultra senza grassi da un negozio di alimentari. Utilizzare il pro refrigeratodotto e non il prodotto temperatura ambiente. Prima di utilizzare in mCeHR mezzo, striscia il latte sul Brain Heart Infusion (BHI) piastre di agar ed incubare per 3 giorni a 30 ° C e 37 ° C per verificare la sterilità. Trasferire il latte a 50 ml provette sterili e conservare a -80 ° C </li><li> Preparare ciascuno dei seguenti componenti e combinare nell&#39;ordine e importi indicati per preparare 1 L di mCeHR (Tabella 1A): 10 ml di 2 mM colina diacido citrato, 10 ml di vitamina e fattore di crescita mix (vedi ricetta in Tabella 1B), 10 ml di 2,4 mM myo-inositolo, 10 ml di 2 mM cloruro emina, 250 ml di acqua deionizzata. Applicare l&#39;aspirazione e il filtro attraverso un gruppo filtro 0,22 micron. </li><li> Aggiungere 20 ml di miscela di acido nucleico (ricetta nella Tabella 1C), 100 ml di miscela di minerali (ricetta nella Tabella 1D), 20 ml di 170 mg / ml lattoalbumina idrolizzato, 20 ml di aminoacidi essenziali, 10 ml di aminoacidi non essenziali acidi, 20 ml di 450 mM KH 2 PO 4,50 ml di 1,45 M D-glucosio, 10 ml di 1 M HEPES, sale di sodio, 250 ml di acqua deionizzata. </li><li> Applicare aspirazione per filtrare sterilizzare i componenti. Rimuovere il filtro e aggiungere 1 ml di 5 mg / ml di colesterolo. Assicurarsi che il pH della media è di circa 6-6,5. Nota: questa soluzione può essere conservata a -80 ° C fino ad un anno. </li><li> Aggiungere 20% (v / v) ultra pastorizzato latte scremato organico al mezzo mCeHR prima dell&#39;uso. Usare una tecnica scrupolosamente sterile (ad esempio in una cappa a flusso laminare) all&#39;apertura e si dispensa il latte. Conservare il supporto a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparare C. elegans per la Cultura in axeniche mCeHR Liquid Media <ol><li> Crescere vermi dieci 60 millimetri piastre NGM finché ci sono molti vermi gravide e una quantità minima di OP50 E. coli sulle piastre. </li><li> Rimuovere le viti senza fine da ciascuna piastra da risciacquo con 5 ml di tampone M9 (ricetta in Tabella 1F), e combinare in una provetta conica da 50 ml. </li><li> Lasciare i vermi a settle lasciando il tubo riposare per 5 a 10 minuti poi rimuovere con attenzione il surnatante contenente la E. coli. </li><li> Ripetere i punti 3.2 e 3.3 2x per rimuovere la maggior quantità di batteri residui più possibile prima di continuare la procedura. </li><li> Risospendere i vermi in 0,1 N di NaCl in un volume che è un multiplo di tre, per esempio 1,5 ml, 3 ml o 6 ml in cui i singoli vermi può essere visto nel tubo. </li><li> Candeggiare i vermi aggiungendo NaOH 5 N e 5% soluzione di ipoclorito di sodio (candeggina) in un rapporto di 01:02:06 alla sospensione verme. Per esempio, 1 ml di NaOH 5 N: 2 ml 5% di ipoclorito di sodio: 6 ml della sospensione verme. Mescolare il NaOH e candeggina prima di aggiungere alla sospensione verme. </li><li> Vortex la soluzione energicamente fino vermi gravide vengono sciolti e solo uova sono visibili all&#39;interno della sospensione (circa 5 a 10 min). Monitorare il processo utilizzando un microscopio a contrasto di fase con un obiettivo 10X. </li><li> Dopo che i vermi hanno completamente sciolto, pellet immediatamente l&#39;uova a 800 xg per 45 secondi a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet due volte con 10 ml di acqua sterile per centrifugazione il pellet a 800 xg per 45 sec a 4 ° C. </li><li> Dopo lo sbiancamento, trasferire il pellet uovo ad un tessuto beuta da 25 cm 2 di coltura contenente 10 ml di media mCeHR integrato con 100 pg / ml di tetraciclina. Effettuare questa procedura utilizzando tecniche sterili. Se lo si desidera, aggiungere ulteriori antibiotici, di cui 250 mg / ml di acido nalidixico, per prevenire la crescita batterica nelle colture liquide axeniche. </li><li> Incubare le colture liquide a 20 ° C in un incubatore agitazione a circa 70 rpm. </li><li> Controllare i vermi ogni giorno per notare la fase di sviluppo e il tasso di crescita. Nota: Worms inizialmente crescere lentamente e richiedono 7 a 10 giorni per diventare gravida. Tuttavia, come i vermi acclimatarsi al mezzo liquido il tempo di generazione diminuisce di circa 4 giorni per tipo selvatico (N2) vermi. </li><li> Dopo i vermi hanno svipato alla fase gravido in mezzi liquidi, trasferire la cultura verme in una provetta conica e agglomerare le vermi a 800 xg per 5 minuti a 4 ° C utilizzando un rotore oscillante. </li><li> Rimuovere il surnatante e delicatamente risospendere il pellet verme in un volume uguale di 0,1 M NaCl. Ad esempio, utilizzare 10 ml di 0,1 M NaCl per i vermi coltivate in 10 ml di mCeHR. Lasciare i vermi di stabilirsi per 5 minuti in ghiaccio. </li><li> Effettuare la procedura di sbiancamento come sopra descritto nei passaggi 3,5-3,8, e permettere ai vermi di crescere per una seconda generazione nei mezzi liquidi axeniche. Se necessario, aggiungere di nuovo l&#39;antibiotico per inibire la crescita batterica. </li><li> Anche in questo caso consentono ai vermi di diventare gravida poi pellet e risospendere i vermi in 0.1 M NaCl come descritto nei punti 3.12 e 3.13, poi candeggiare nuovo come descritto nei passaggi 3,5-3,8, per produrre una popolazione sincronizzato. Crescere i vermi larve L1 in mezzi liquidi senza antibiotici da ora in poi. </li></ol> 4. Sincronizzazione Worms da LiquidCultura <ol><li> Pellet e risospendere i vermi a 0,1 M NaCl come sopra descritto nei passaggi 3.12 e 3.13. Bleach come sopra descritto nei passaggi 3,5-3,8. </li><li> Risospendere il pellet uovo in 10 ml di tampone M9 e permettere alle larve di schiudono O / N a 20 ° C su una piattaforma agitatore rotante. Nota: Le uova si schiudono in larve L1, ma non si svilupperanno ulteriormente, sincronizzando i vermi nella fase L1. </li><li> Per mantenere e vermi sottocultura, pellet L1 larve a 800 xg per 5 minuti, poi risospendere le larve in 10 ml di mCeHR e il trasferimento ad un pallone 25 centimetri 2. Lasciare i vermi di crescere a 20 ° C su una piattaforma rotante. Mantenere una densità massima di 3.000 ml / worm / cm 2 per assicurare una nutrizione adeguata per i vermi. Nota: In questa fase, gli antibiotici non sono tenuti a mantenere condizioni axeniche quando le procedure siano effettuate con tecniche sterili in una cappa a flusso laminare. Worms devono essere controllate quotidianamente per monitorare la crescita. </li></ol> 5. Liberozing e scongelamento Worms per colture axeniche medie <ol><li> Congelare le culture verme asincroni axeniche o sincronizzato larve L1 in azoto liquido. Worm pellet a 800 xg per 5 minuti poi risospendere in tampone di S (6,45 KHPO mm 4, 43.55 KHPO mm 4, 146,25 mM NaCl) con 0,5 ml per ogni flacone. Aggiungere un volume uguale di tampone S con il 30% v / v glicerolo ad ogni flacone e trasferire i vermi a -80 ° C prima della conservazione a lungo termine in N 2 liquido. Congelare circa 1 x 10 6 vermi per ml in ogni fiala. </li><li> Scongelare vermi incubando le fiale a 37 ° C per circa 2 min fino a quasi tutto il ghiaccio è fuso. In una cappa a flusso laminare, trasferire i vermi in un pallone sterile contenente mCeHR e metterli a 20 ° C. </li></ol> 6. Determinare l&#39;effetto di Hemin concentrazione sulla crescita e la riproduzione in mCeHR <ol><li> Utilizzare supporti mCeHR axeniche per saggiare la crescita dipende nutrienti di C. elegans. Per determinare l&#39;effetto of emina concentrazione sulla crescita senza fine e lo sviluppo, l&#39;uso sincronizzato vermi N2 axeniche o di altri ceppi di interesse. Sincronizzare L1 larve come descritto sopra nella sezione 4. </li><li> Il giorno successivo, pellet e contare sincronizzato larve L1 e portare ad 1 verme per ogni ml di mezzi axeniche. Effettuare 10 mM cloruro emina in 0,3 M NH 4 OH e regolare a pH 8 mediante HCl concentrato. </li><li> Aggiungere 800 microlitri di media mCeHR ad una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere 100 vermi per ciascun pozzetto in 100 microlitri di media. Aggiungere cloruro di emina a ciascun pozzetto in concentrazioni comprese tra 0 mM, 1,5 mM a 1.000 pM in triplice copia. Assicurarsi che tutti i pozzetti contengono la stessa concentrazione di 0,3 M NH 4 OH. Risospeso delicatamente i worm prima il pipettaggio per garantire che il 100 L1 larve sono aggiunti a ciascun pozzetto. </li><li> Esaminare i vermi ogni giorno e notare la crescita di ciascuna concentrazione in ciascun pozzetto. Contare il numero di vermi dopo 9 giorni di incubazione e tracciare il numero di worm / ml corrispondenti a ciascuna emeconcentrazione (Figura 1). </li></ol> 7. Effetto della Hemin concentrazione su eme Worms sensori <ol><li> Incubare sincronizzati L1 vermi sensore eme (Phrg-1 :: GFP) in mCeHR contenente 4 micron, 8 micron, 10 micron e 20 micron emina. </li><li> Immagine worm utilizzando la microscopia confocale a fluorescenza, 48 ore dopo incubazione (Figura 2). </li></ol> 8. Utilizzando mCeHR per generare transgenici C. elegans Utilizzo di microparticelle Bombardamento Nota: la procedura per la generazione e la realizzazione di microparticelle bombardamento con vermi coltivate in mCeHR unc-119 (ED3) è illustrato nella figura 3 13. <ol><li> Worm Preparazione <ol><li> Trasferire circa 1 x 10 6 asincroni unc-119 (ED3 vermi) in 90 ml di mezzi mCeHR in A 175 cm 2 matraccio una settimana prima del bombardamento. Lasciare i vermi di crescere a 20 ° C ona piattaforma di agitazione a ~ 70 rpm (Figura 3-1). Nota: Una settimana più tardi, la densità verme dovrebbe essere significativamente maggiore con molti adulti vermi gravide. Circa 3 x 10 7 vermi saranno necessari per microparticelle bombardamento. </li><li> Freddo JM109 E. coli testa di serie 10 piatti cm NGM sul ghiaccio. </li><li> Trasferire i vermi axeniche a due tubi da 50 ml coniche e centrifugare i vermi a 800 xg per 2 minuti. Aspirare il surnatante e sospendere nuovamente le viti senza fine in ciascun tubo in 50 ml di tampone M9 (Figura 3-2). </li><li> Lasciare i vermi adulti a pellet per gravità per 10-15 minuti sul ghiaccio. Nota: Il pellet 2 ml deve contenere ora&gt; 90% vermi adulti. Questo pellet 2 ml dovrebbe avere circa 5 x 10 6 vermi ed è sufficiente per un bombardamento microparticelle. </li><li> Rivestire l&#39;intera superficie del refrigerata JM109 seminato piastra NGM con il pellet 2 ml di vermi. Che il liquido sia completamente assorbito poi lasciare la piastraper 30 min in ghiaccio prima di proseguire (Figura 3-3). </li></ol></li><li> Preparazione di particelle d&#39;oro <ol><li> Pesare 30 mg di particelle d&#39;oro in una provetta siliconato. Aggiungere 1 ml di etanolo al 70% e agitare la provetta per 5 min. </li><li> Lasciare che il tubo a sedere per 15 minuti, poi centrifugare a 6.000 xg per 10 secondi per far sedimentare le particelle d&#39;oro. Rimuovere il surnatante utilizzando un puntale cautamente la punta verso il lato opposto del tubo di particelle d&#39;oro. </li><li> Lavare le particelle d&#39;oro con 1 ml di acqua sterile, vortex per 1 min e centrifugare brevemente la provetta a 6.000 xg per 10 sec. Ripetere la fase di lavaggio due volte, poi risospendere le particelle d&#39;oro in 0,5 ml di soluzione sterile 50% glicerolo. Nota: La concentrazione finale delle particelle d&#39;oro sarà di 60 mg / ml e può essere conservato per 1-2 mesi a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparare la miscela di particelle di DNA-oro <ol><li> Combinare 10 pg di DNA plasmidico desiderato con 10 &amp;# 956; g del unc-119 di salvataggio plasmide in un siliconato 1,5 ml provetta. Aggiungere 50 ml di acqua deionizzata e 100 ml di ben risospeso soluzione di particelle d&#39;oro poi vortex per 1 min. </li><li> Aggiungere 150 ml di 2,5 M CaCl 2 e agitare nuovamente la soluzione per 1 min. A questa soluzione, aggiungere 60 ml di 0,1 M spermidina e vortex per 3-5 min. </li><li> Pulse centrifugare la soluzione a 6.000 xg per 10 secondi, rimuovere il surnatante e aggiungere 300 ml di etanolo al 70%. Vortex bene per 1 min, impulso centrifugare a 6000 xg, rimuovere il supernatante e risospendere in 170 ml di etanolo al 100%. Vigorosamente agitare la soluzione per 5-10 minuti poi pulsano centrifugare e rimuovere il surnatante. </li></ol></li><li> Bombardamento (Figura 3-3) Nota: Questo protocollo è eseguita con il sistema di erogazione di particelle specificato nella tabella dei materiali / Attrezzatura. Seguire le istruzioni per lo strumento consegna particella disponibili. <ol> &lt;li&gt; Inserire un foglio di carta velina in un piatto di 15 centimetri. Usando le pinzette, immergere sette macrocarriers singolarmente in 100% di etanolo e stenderli sul tessuto ad asciugare. </li><li> Pulire accuratamente la camera di biolistic, titolare macrocarrier e piastra bersaglio con etanolo al 70%. Pulire e sterilizzare gli schermi di arresto prima di ogni procedura di bombardamento. </li><li> Caricare i macrocarrriers nel supporto utilizzando pinzette e premere nel supporto utilizzando lo strumento dei posti a sedere. </li><li> Distribuire uniformemente 20 ml del DNA rivestiti particelle d&#39;oro nel centro di ogni macrocarrier e poi lasciare che la soluzione si asciughi completamente. </li><li> Pulire le due parti del divisore pressione con etanolo e assemblare con etanolo puliti dischi di rottura. Avvitare il divisore a pressione montate e dischi di rottura nella camera di bombardamento. </li><li> Montare uno schermo arresto autoclave con il titolare macrocarrier e posizionare l&#39;apparecchio al scaffale di metallo richiesto e bloccare in posizione. </li><li> Inserire il MACR assemblataocarrier apparecchio nella camera biolistic nello slot assegnato sotto del divisore pressione e allinearsi con il divisore pressione. </li><li> Nastro il piatto NGM aperto con i vermi sul ripiano piastra bersaglio e chiudere la porta della camera. </li><li> Per bombardare worm, regolare la pressione a quella necessaria per rompere i dischi di rottura. Accendere il vuoto a 28 pollici di pressione Hg, quindi premere il pulsante di fuoco fino a quando i dischi di rottura. </li><li> Rilasciare il vuoto e rimuovere la piastra NGM dall&#39;apparecchio. Lavare i vermi dalla piastra e ridistribuire in venti 10 piatti cm NGM seminato con JM109 E. coli (Figura 3-4). </li><li> Lasciare i vermi di crescere per 10 a 14 giorni a 25 ° C e morire di fame i piatti. Worms salvati dal difetto unc-119 avranno il movimento normale e possono essere identificate in questo momento. Scegli almeno 10 &quot;di tipo selvatico&quot; vermi da lastre separate per ulteriori analisi in quanto questi rappresentano linee transgeniche indipendenti (Figure 3-5). </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano non ci sono interessi economici in competizione o conflitto di interessi.

In questo protocollo vi presentiamo un axenic mCeHR mezzi liquidi modificato che consente una rapida C. generazione elegans con produzione di un gran numero di vermi. Questo supporto mostra diversi vantaggi come i vermi sono coltivate senza contaminare E. coli o sottoprodotti batterici e possono essere sfruttati in studi nutrizionali e tossicologici. L&#39;uso di E. coli o altri batteri in detti studi ha diversi inconvenienti. Ad esempio, la crescita dei batteri può cambiare in varie...

Il nematode del suolo, Caenorhabditis elegans, è un potente organismo modello utilizzato in numerosi studi dalla genetica alla tossicologia. Come risultato della sua dimensione 1 mm tempo di generazione rapida di quattro giorni facilità di coltivazione, e un gran numero di progenie, questi nematodi sono stati utilizzati in un numero di schermi genetici e farmacologici 1, 2. Ricercatori approfittare di questo worm per identificare molecole e percorsi conservati nei sistemi di vertebrati. Questi percorsi sono segnali di morte cellulare, percorsi di invecchiamento e del metabolismo, e il sistema nervoso 3-6. Inoltre, la trasparenza di C. elegans consente la generazione di linee transgeniche utilizzando reporter proteine ​​fluorescenti, che possono essere visualizzati direttamente per analizzare i modelli di espressione genica e localizzazione delle proteine. In molti studi questo nematode è coltivato su una superficie a base di agar-solido utilizzando nematode mezzo di crescita (NGM) piastre o in lculture iquid seminati con Escherichia coli come fonte di cibo 7,8. Queste fonti di cibo batteriche possono confondere studi biochimici e tossicologici con interferenza da batteri sottoprodotti che influenzano l&#39;interpretazione dei risultati. Per evitare questi effetti compounding, C. elegans possono essere coltivate in un mezzo liquido axeniche che è privo di batteri come fonte di cibo. Usando questo supporto, abbiamo coltivato con successo milioni di vermi altamente sincronizzati per molti di serie C. protocolli elegans, compresa l&#39;analisi microarray di geni differenzialmente regolati in C. elegans esposto a diverse concentrazioni eme, e produzione di vermi transgenici utilizzando gene bombardamento. Questo supporto è chimicamente definita e modificata da una ricetta originale formulata dal Dr. Eric Clegg 9. Usando questo supporto mCeHR, abbiamo identificato con successo geni coinvolti nella eme omeostasi, riferiti ai geni come eme responsivi (HRG s) 10, che avrebbenon sarebbe stato possibile in condizioni di crescita regolari che utilizzano piastre di agar NGM seminato con E. coli. In questo protocollo si descrive la procedura per l&#39;introduzione e il mantenimento C. elegans cresciuti su E. coli per la axenic mCeHR e utilizzare questo metodo per ottenere un gran numero di vermi per produrre transgenico C. Linee elegans utilizzando microparticelle bombardamento. Abbiamo presenti anche studi che dimostrano l&#39;utilità di utilizzare supporti axeniche per la determinazione del fabbisogno nutrizionale di C. elegans utilizzando eme come esempio. Questi studi mostrano che utilizzando mCeHR supporti consente la rapida crescita di un gran numero di C. elegans per molte applicazioni a valle utilizzate dai ricercatori worm.

<table><tbody><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H2O</td><td>Sigma</td><td>M-2393</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S-4641</td><td></td></tr><tr><td>Potassium citrate monohydrate</td><td>Sigma</td><td>P-1722</td><td></td></tr><tr><td>CuCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>C455-500</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>M87-100</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>Z-0152</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NH4)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(SO4)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>F-1018</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt</td><td>Sigma</td><td>A-1752</td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5 -phosphate</td><td>Sigma</td><td>C-1006</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 2&#039; - and 3&#039; -monophosphate</td><td>Sigma</td><td>G-8002</td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5 -phosphate, disodium salt</td><td>Sigma</td><td>U-6375</td><td></td></tr><tr><td>Thymine</td><td>Sigma</td><td>T0376</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylglucosamine</td><td>Sigma</td><td>A3286</td><td></td></tr><tr><td>DL-Alanine</td><td>Fisher</td><td>S25648&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>p-Aminobenzoic Acid</td><td>Sigma</td><td>A-9878</td><td></td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Sigma</td><td>B-4639</td><td></td></tr><tr><td>Cyanocobalamine (B-12)</td><td>Sigma</td><td>V-2876</td><td></td></tr><tr><td>Folinate (Ca)</td><td>Sigma</td><td>F-7878</td><td></td></tr><tr><td>Niacin</td><td>Sigma</td><td>N-0761</td><td></td></tr><tr><td>Niacinamide</td><td>Sigma</td><td>N-3376</td><td></td></tr><tr><td>Pantetheine</td><td>Sigma</td><td>P-2125</td><td></td></tr><tr><td>Pantothenate (Ca)</td><td>Sigma</td><td>P-6292</td><td></td></tr><tr><td>Pteroylglutamic Acid (Folic Acid)</td><td>ACRCS</td><td>21663-0100</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal 5&#039;-phosphate</td><td>Sigma</td><td>P-3657</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxamine 2HCl</td><td>Sigma</td><td>P-9158</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine HCl</td><td>Sigma</td><td>P-6280</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin 5-PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(Na)</td><td>Sigma</td><td>R-7774</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine HCl</td><td>Sigma</td><td>T-1270</td><td></td></tr><tr><td>DL-6,8-Thioctic Acid</td><td>Sigma</td><td>T-1395</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>Choline di-acid citrate</td><td>Sigma</td><td>C-2004</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;myo&lt;/em&gt;-Inositol</td><td>Sigma</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G-7520</td><td></td></tr><tr><td>Lactalbumin enzymatic hydrolysate</td><td>Sigma</td><td>L-9010</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion</td><td>BD</td><td>211065</td><td></td></tr><tr><td>Hemin chloride</td><td>Frontier Scientific</td><td>H651-9</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, sodium salt</td><td>Sigma</td><td>H-3784</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>J.T. Baker</td><td>F676-05</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids</td><td>Invitrogen</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>MEM Amino Acids Solution</td><td>Invitrogen</td><td>11130-051</td><td></td></tr><tr><td>Nalidixic acid sodium salt</td><td>Sigma</td><td>N4382</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline Hydrochloride</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194542</td><td></td></tr><tr><td>Biolistic Delivery System</td><td>BioRad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Gold particles (Au Powder)&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Ferro Electronic Material Systems</td><td>6420 2504, JZP01010KM</td><td></td></tr><tr><td>or</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gold Particles 1.0 &amp;mu;m</td><td>BioRad</td><td>&amp;nbsp;165-2263</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment

In questo protocollo, presentiamo i materiali necessari, e la procedura per fare C modificati. Legans e assuefazione e della Riproduzione media (mCeHR). Inoltre, la procedura per l&#39;esposizione e acclimatazione C. elegans cresciuti su E. coli a axeniche mezzi liquidi sono descritti. Infine, gli esperimenti a valle che utilizzano axenic C. elegans illustrano i benefici di questa procedura. La capacità di analizzare e determinare C. fabbisogno nutritivo elegans è stato illustrato da una crescente N2 wild type vermi in mezzi liquidi axeniche con concentrazioni variabili eme. Questa procedura può essere replicata con altri nutrienti per determinare la concentrazione ottimale per la crescita e lo sviluppo verme o, per determinare gli effetti tossicologici dei trattamenti farmacologici. Gli effetti di varie concentrazioni eme sulla crescita di tipo selvaggio vermi sono stati determinati mediante osservazione microscopica qualitativa e quantificazione tegli numero di worm che crescevano in ciascuna concentrazione eme. Inoltre, l&#39;effetto di varie concentrazioni di nutrienti può essere saggiata utilizzando vermi che esprimono sensori fluorescenti che rispondono alle variazioni del nutriente di interesse. Inoltre, un gran numero di vermi erano facilmente prodotti per la generazione di transgenici C. elegans utilizzando microparticelle bombardamento.

Coltura C. elegans in axeniche aiuti mezzo liquido nella determinazione di sostanze nutritive che sono richiesti dai vermi, senza interferenze da parte di metaboliti secondari prodotti da E. coli. Worm di tipo selvatico N2 acclimatare i media mCeHR entro tre generazioni e mostrano una crescita paragonabile a vermi cresciuti su piastre NGM batteriche. Infatti, questi vermi diventano gravide entro 4 giorni, rispetto a 3,5 giorni per i vermi coltivati ​​sui batteri OP50. U...

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Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans è di solito coltivate su piastre di agar solidi o liquidi in colture seminate con E. coli. Per evitare sottoprodotti batterici da confondere studi tossicologici e nutrizionali, abbiamo utilizzato un mezzo liquido axenic, CeHR, crescere e sincronizzare un gran numero di vermi per una gamma di applicazioni a valle.

Culturing<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; In axeniche Liquid Media e la creazione di transgeniche Worms da microparticelle Bombardamento

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

culturing-caenorhabditis-elegans-axenic-liquid-media-creation

Research

JoVE Journal

Biology

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

16.9K Views.  University of Maryland.  C. elegans è di solito coltivate su piastre di agar solidi o liquidi in colture seminate con E. coli. Per evitare sottoprodotti batterici da confondere studi tossicologici e nutrizionali, abbiamo utilizzato un mezzo liquido axenic, CeHR, crescere e sincronizzare un gran numero di vermi per una gamma di applicazioni a valle. 

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The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

Il Nematode Caenorhabditis Elegans - un modello Versatile In Vivo per studiare le interazioni ospite-microbo

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Ricerca

Genetica

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generazione di Stabile transgenici C. elegans Utilizzando Microiniezione

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biologia

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Applicazione di RNAi ed espressione di fattore di trascrizione indotta da calore-shock per riprogrammare le cellule germinali ai neuroni in c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Biologia dello sviluppo

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema modello per Amylopathy Studio

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Neuroscienze

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Generazione di transgenici C. elegans Di Trasformazione Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Coltivare e manipolare geneticamente i nematodi entomopatogeni

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

Immunologia e infezioni

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather than individual worm samples to quantify bacterial load in this organism. Here it is argued that the large inter-individual variability seen in bacterial colonization of the C. elegans intestine is informative, and that batch digest methods discard information that is important for accurate comparison across conditions. As describing the variation inherent to these samples requires large numbers of individuals, a convenient 96-well plate protocol for disruption and colony plating of individual worms is established.

Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions

This protocol describes a 96-well disruption of individual bacterially colonized Caenorhabditis elegans following cold paralysis and surface bleaching&#160;to remove external bacteria. The resulting suspension is plated on agar plates to allow accurate, medium-throughput quantification of bacterial load in large numbers of individual worms.

Utilizzo di dati single-worm per quantificare l'eterogeneità nelle interazioni caenorhabditis elegans-batteriche

The nematode Caenorhabditis elegans is a model system for host-microbe and host-microbiome interactions. Many studies to date use batch digests rather ...

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid nematode growth media (NGM), allowing the efficient collection of population-level data for survival and other physiological phenotypes, and periodic sampling of subpopulations for fluorescent biomarker quantification. Limitations to this approach are the inability to (1) follow individual worms over time to develop age trajectories for phenotypes of interest and (2) monitor fluorescent biomarkers directly in the context of the culture environment. Alternative culture approaches use liquid culture or microfluidics to monitor individual animals over time, in some cases including fluorescence quantification, with the tradeoff that the culture environment is contextually distinct from solid NGM. The WorMotel is a previously described microfabricated multi-well device for culturing isolated worms on solid NGM. Each worm is maintained in a well containing solid NGM surrounded by a moat filled with copper sulfate, a contact repellent for C. elegans, allowing longitudinal monitoring of individual animals. We find copper sulfate insufficient to prevent worms from fleeing when subjected to aversive interventions common in aging research, including dietary restriction, pathogenic bacteria, and chemical agents that induce cellular stress. The multi-well devices are also molded from polydimethylsiloxane, which produces high background artifacts in fluorescence imaging. This protocol describes a new approach for culturing isolated roundworms on solid NGM using commercially available polystyrene microtrays, originally designed for human leukocyte antigen (HLA) typing, allowing the measurement of survival, physiological phenotypes, and fluorescence across the lifespan. A palmitic acid barrier prevents worms from fleeing, even in the presence of aversive conditions. Each plate can culture up to 96 animals and easily adapts to a variety of conditions, including dietary restriction, RNAi, and chemical additives, and is compatible with automated systems for collecting lifespan and activity data.

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Here, we present a protocol to culture isolated individual nematodes on solid media for lifelong physiological parameter tracking and fluorescence quantification. This culture system includes a palmitic acid barrier around single-worm wells to prevent animals from fleeing, allowing the use of aversive interventions, including pathogenic bacteria and chemical stressors.

Coltura a lungo termine di singoli Caenorhabditis elegans su terreni solidi per il monitoraggio longitudinale della fluorescenza e interventi avversivi

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, rapid reproduction cycle (~3 days), short lifespan (~3 weeks), and numerous available tools for genetic manipulation and molecular analysis. The most common approach for conducting aging studies in C. elegans, including survival analysis, involves culturing populations of tens to hundreds of animals together on solid nematode growth media (NGM) in Petri plates. While this approach gathers data on a population of animals, most protocols do not track individual animals over time. Presented here is an optimized protocol for the long-term culturing of individual animals on microfabricated polydimethylsiloxane (PDMS) devices called WorMotels. Each device allows up to 240 animals to be cultured in small wells containing NGM, with each well isolated by a copper sulfate-containing moat that prevents the animals from fleeing. Building on the original WorMotel description, this paper provides a detailed protocol for molding, preparing, and populating each device, with descriptions of common technical complications and advice for troubleshooting. Within this protocol are techniques for the consistent loading of small-volume NGM, the consistent drying of both the NGM and bacterial food, options for delivering pharmacological interventions, instructions for and practical limitations to reusing PDMS devices, and tips for minimizing desiccation, even in low-humidity environments. This technique allows the longitudinal monitoring of various physiological parameters, including stimulated activity, unstimulated activity, body size, movement geometry, healthspan, and survival, in an environment similar to the standard technique for group culture on solid media in Petri plates. This method is compatible with high-throughput data collection when used in conjunction with automated microscopy and analysis software. Finally, the limitations of this technique are discussed, as well as a comparison of this approach to a recently developed method that uses microtrays to culture isolated nematodes on solid media.

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Presented here is an optimized protocol for culturing isolated individual nematodes on solid media in microfabricated multi-well devices. This approach allows individual animals to be monitored throughout their lives for a variety of phenotypes related to aging and health, including activity, body size and shape, movement geometry, and survival.

Coltura a lungo termine e monitoraggio di Caenorhabditis elegans isolati su terreni solidi in dispositivi multi-pozzetto

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

C. elegans Maintenance

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and even physical phenomena. In order to use C. elegans to its full potential, proper care and attention to the basic maintenance of this powerful organism is essential.
In this video you will learn the basic housing and feeding requirements of C. elegans, how to correctly handle and manipulate worms using a worm pick and how to freeze and recover important worm stocks. Towards the end of the video we will visit a few applications of modifying the housing, feeding and manipulation of these important animals.

Maintenance of Caenorhabditis elegans

C. elegans Manutenzione

Ceanorhabditis elegans has been, and is still, used to great success as a model organism for studying a variety of developmental, genetic, molecular and ...

Culturing

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