Questo lavoro è stato sostenuto da HL094536 (BJH).

1. Isolamento dei mitocondri di cuore di topo <ol><li> Per isolare il cuore mitocondri, anestetizzare e sacrificio topi secondo le procedure approvate dal locale Cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso. </li></ol> Nota: Tutte le fasi del protocollo di isolamento mitocondri deve essere eseguita su ghiaccio. Usare tamponi di ghiaccio freddo e pre-refrigerati Petri, Falcon tubi e tubi Eppendorf. I volumi stabiliti nel protocollo sono per un campione contenente 2 cuori di topo. <ol start="2"><li> Rimuovere i cuori, metterli in acqua fredda Buffer Isolamento mitocondri (300 saccarosio mM, 10 mM Na-HEPES, 200 mM EDTA, pH 7,4) e risciacquare sangue. </li></ol> Nota: Per ottenere risultati ottimali, il pH del buffer mitocondriali deve essere regolato con KOH e acido acetico. <ol start="3"><li> Cuori, posizionarli su un piatto freddo Petri, rimuovere il grasso e atri, e tritateli finemente con una lama fino ad ottenereche istituisce un prodotto omogeneo. </li><li> Trasferire cuori tritati in una provetta da 50 ml Falcon, aggiungere 10 ml di tampone Isolamento mitocondri con 0,1 mg / ml di tripsina e consente al campione di digerire in ghiaccio per 10 min. </li></ol> Nota: Tripsina durante la procedura di isolamento aumenta il rendimento di mitocondri isolati e deve essere mantenuta costante tra preparazioni mitocondriali. Si consiglia di testare le funzioni mitocondriali sui preparati isolato è l&#39;assenza di tripsina per garantire che l&#39;enzima non interferisce con la funzionalità. <ol start="5"><li> Aggiungere 10 ml di tampone di isolamento mitocondri con 0,1% di acidi grassi liberi BSA e 5 mg di inibitore della tripsina (soia) e mescolare per inversione della provetta diverse per neutralizzare la tripsina. </li></ol> Nota: Buffer Isolation mitocondri possono essere preparati in anticipo e possono essere conservati a -20 ° C. Controllare il pH dopo lo scongelamento. Tripsina, inibitore della tripsina o BSA deve esseredded al Buffer Isolamento mitocondri il giorno dell&#39;esperimento. <ol start="6"><li> Recuperare il tessuto digerito da un basso-medio della velocità di centrifugazione per 1 min a 4 ° C. </li><li> Tessuto Risospendere in 8 ml tampone Isolamento mitocondri con 0,1% di acidi grassi liberi BSA e omogeneizzare con un omogeneizzatore Dounce motorizzato con un pestello in Teflon (4-6 passi di 1,200-14,00 rpm). Conservare il campione in ghiaccio durante la omogeneizzazione. </li><li> Trasferire omogeneizzato in una provetta da 15 ml Falcon e centrifugare a 800xg per 10 min a 4 ° C per nuclei pellet e frammenti di tessuto. </li><li> Recuperare il supernatante contenente i mitocondri in provette Eppendorf e centrifugare a 8000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere accuratamente lo strato superiore bianco e lavare il residuo scuro pellet contenente i mitocondri in 1 ml di tampone Isolamento mitocondri. </li><li> Centrifugare a 8000xg per 15 min a 4 ° C. Gettare il surnatante e risospendere mitocondri pellet in 150 microlitri mitocondriale Isolazione del buffer. Tenere mitocondri in ghiaccio per ulteriori analisi. </li></ol> Nota: Per ottenere i migliori risultati durante saggi funzionali, utilizzare i mitocondri all&#39;interno di 4 ore di isolamento. <ol start="12"><li> Quantificare proteine ​​mitocondriali usando il saggio Bradford. </li></ol> 2. Controllo di qualità dei mitocondri isolati 2,1. Misura del rapporto di controllo respiratorio (RCR) <ol><li> Calibrare l&#39;elettrodo ossigeno Oxytherm di aria satura di acqua per stabilire il limite massimo di ossigeno. Quando un livello stabile di ossigeno è ottenuto aggiungere 100 microlitri di una soluzione preparata idrosolfito di sodio 10 mM di stabilire la linea di zero ossigeno. Eseguire misurazioni a 30 ° C. </li><li> Aggiungere 2 ml Tampone Respiration mitocondri (125 mM KCl, 20 mM HEPES, 3 mM MgCl2, 400 mM EGTA, DTT 300 mM, 5 mM KH 2 PO 4, pH 7,2) con 1 rotenone pM alla camera Oxytherm, sigillare la camera e inizio regiding. </li><li> Quando il segnale di ossigeno è stabile, aggiungere 250 ug mitocondri e registrare respirazione basale per 1 min. La respirazione a questo punto dovrebbe essere molto bassa in quanto i mitocondri sono respirano su substrati endogeni (Stato 1 respirazione). </li><li> Aggiungere 5 succinato mM e segnale di registrazione per 1 min. Il consumo di ossigeno dovrebbe aumentare durante la respirazione Stato 2. </li><li> Stato indurre 3 della respirazione aggiungendo ADP 150 uM. A questo punto il consumo di ossigeno dovrebbe aumentare grazie alla sintesi di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. Record segnale fino a respirazione rallenta, indicante il consumo ADP e la transizione allo stato 4 respirazione. Record Stato 4 respirazione per almeno 1 min. </li><li> Aggiungere 1 CCCP pM e segnale di registrazione per 1 min. Respirazione disaccoppiata dovrebbe essere massimale. </li></ol> Nota: L&#39;effetto di CCCP sulla respirazione mitocondriale è dose-dipendente: alte concentrazioni di CCCP in grado di inibire il consumo di ossigeno e deve quindi essere attentamente titrated. <ol start="7"><li> Calcolare il rapporto di controllo respiratorio (RCR) dividendo tasso di consumo di ossigeno durante la respirazione Stato 3 per il tasso di consumo di ossigeno durante la respirazione Stato 4. RCR Un obiettivo deve essere ≥ 4. </li></ol> 2,2. Valutazione dell&#39;integrità della membrana mitocondriale (citocromo c di prova) <ol><li> Lavare accuratamente la camera di Oxytherm con il 70% di etanolo e acqua e ripetere i passaggi 2.1.2 -2.1.4. </li><li> Aggiungere 1 mM ADP e il consumo di ossigeno record per 1 min. </li><li> Aggiungere 10 pM citocromo c. Poiché citocromo c è impermeabile intatte membrane mitocondriali, un aumento respirazione indica rotti o danneggiati membrane mitocondriali. </li></ol> 3. La misura della mitocondriale di apertura dei pori di transizione di permeabilità <ol><li> Impostare il spettrofluorimetro per il multi-parametro di misura di apertura mtPTP. Utilizzando il programma FelixGx, creare una nuova configurazione hardware (Quanta sta maestro costantete) comprendente la sorgente di luce, monocromatore di eccitazione, compartimento campione e due rivelatori posizionati a 90 ° e 270 ° rispetto al monocromatore di eccitazione (Figura 4). Per ottenere una risoluzione massima di tempo, sia monocromatori di emissione (90 ° e 270 °) deve essere disabilitata ed i filtri di emissione a 90 ° e 270 ° nel vano campione attivato nel menu di configurazione hardware. Questo passaggio rimuovere il controllo del motore delle lunghezze d&#39;onda di emissione e correggere ogni monocromatore ad una particolare lunghezza d&#39;onda. Se i monocromatori emissioni non sono disattivati, ogni rivelatore ciclo tra le due lunghezze d&#39;onda e le misure duplicati verranno registrati. </li><li> Creazione di un nuovo protocollo di acquisizione utilizzando il tipo Multi Dye e immettere i seguenti coloranti: <ul><li> Fura (alto Ca + +): eccitazione 340 nm, emissione 525 nm (rilevatore 1) </li><li> Fura (basso Ca + +): eccitazione 380 nm, emissione 525 nm (rilevatore 1) </li><li> JC1 (aggregato): eccitazione 543 nm, Emissione 595 nm (rivelatore 2) </li><li> JC1 (monomero): eccitazione 498 nm, emissione 525 nm (rilevatore 1) </li><li> Gonfiore: eccitazione 525 nm, emissione 525 nm (rilevatore 1) </li></ul></li><li> Impostare le fessure di eccitazione e di emissione a 1 nm e la temperatura a 37 ° C. </li><li> Per ottenere il segnale raziometrico per Fura e JC-1, generare due tracce derivati: Fura (alto Ca + +) / Fura (basso Ca + +) e JC1 (aggregato) / JC1 (monomero). </li><li> Consente di regolare manualmente la lunghezza d&#39;onda di emissione di rivelatori 1 e 2 ai 525 nm e 595 nm, rispettivamente. </li><li> Mescolare 1 ml Tampone del saggio mitocondri (120 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES-Tris, pH 7,2) con 1 rotenone pM, 5 mM di succinato e 800 nM Fura FF in un monouso quattro lati metacrilato cuvetta. Aggiungi campione da 250 mg mitocondri e posto nel vano campione. Assicurarsi che l&#39;agitatore magnetico è acceso. </li><li> Avviare la registrazione. Dopo 1 minuto, mettere in pausa l&#39;acquisizione, aggiungere 500 nM JC-1 e quindi riavviare il uncquisition. Il segnale JC-1 ratio dovrebbe aumentare, indicando assorbimento colorante dai mitocondri attivo. La registrazione fino a JC-1 il segnale ha raggiunto un plateau (di solito entro 5 min). </li><li> Aggiungere 20 mM CaCl 2. Un aumento istantaneo in rapporto segnale Fura FF dovrebbe essere osservato dalla aumentata Ca 2 + in presenza del tampone di saggio, seguita da una graduale diminuzione a causa mitocondriale Ca 2 + assorbimento. Il segnale JC-1 ratio dovrebbe esibire una diminuzione transitoria breve indicativa di una lieve depolarizzazione della membrana mitocondriale. </li><li> Attendere fino al ritorno di rapporto segnale Fura FF al livello basale prima dell&#39;aggiunta di un altro impulso di CaCl 2 (1-1,5 min). Continua a pulsare ad intervalli fissi fino a mitocondri non possono accumulare Ca 2 + e iniziare il rilascio di Ca 2 + nel tampone. apertura mtPTP è visualizzato da un concomitante aumento del rapporto segnale Fura FF causa Ca 2 + release, una diminuzione del JC-1 rapporto segnale dovuto pote membranacollasso ntial, e una diminuzione della diffusione della luce dovuta a rigonfiamento mitocondriale (Figura 5). </li><li> Dopo l&#39;attivazione mtPTP, verificare la specificità Fura FF, JC-1 e segnali gonfiore rispettivamente con 1 mM EGTA, 1 pM CCCP e 5 ug / ml alameticina. </li><li> Per verificare la specificità di apertura mtPTP, ripetere i passaggi 3,6-3,9 in presenza di 1 pM della ciclosporina cyclophilin inibitore D A (cyclophilin D è un componente del mtPTP). In presenza di ciclosporina A, l&#39;apertura del mtPTP richiede molto più CaCl 2 impulsi di campioni di controllo (Figura 6). </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Figura 2 mostra un tipico controllo respiratorio di cuore di topo mitocondri isolati. Stato 3 della respirazione si ottiene per aggiunta di ADP di mitocondri respirano il succinato, ed è caratterizzato da un consumo di ossigeno significativamente aumentata rispetto al substratite da solo. Deplezione di Stato aggiunto ADP iniziati 4 respirazione, durante il quale il consumo di ossigeno e rallenta è paragonabile a tassi raggiunti prima dell&#39;aggiunta ADP. RCR si ottiene dividendo il tasso di consumo di ossigeno per respirazione 3 Stato da quello di Stato 4 respirazione. Il test citocromo c viene utilizzato per saggiare l&#39;integrità della membrana esterna mitocondriale: quando citocromo c è aggiunto mitocondri respirano il succinato e ADP, non aumentare la respirazione si osserva, indicando un intatto membrana mitocondriale esterna (figura 3). Una immagine rappresentativa per l&#39;apertura mtPTP nel cuore mitocondri isolati è mostrato in Figura 4. In questo caso l&#39;apertura mtPTP stata innescata con l&#39;aggiunta di 4 CaCl 2 impulsi (20 pM ciascuno) ad intervalli di 1,5 min. apertura mtPTP risulta dal rilascio simultaneo di mitocondriale vicino Ca 2 + (aumento del segnale Fura rapporto FF), crollo del mitochondpotenziale di membrana rial (decremento JC-1 rapporto segnale) e un aumento del volume mitocondriale (diminuzione del segnale gonfiore). Quando ciclosporina A è aggiunto, che si lega alla componente cyclophilin D di mtPTP, apertura mtPTP richiede 7 impulsi di CaCl 2 invece di 4 (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso del multi-parametro mitocondriale protocollo di transizione di apertura dei pori di permeabilità per il cuore mitocondri isolati. Cuore viene raccolto dai topi e mitocondri sono isolate tramite centrifugazione differenziale. La preparazione mitocondriale viene quindi valutata qualitativamente mediante misurazione polarografico del rapporto di controllo respiratorio e l&#39;integrità della membrana mitocondriale in presenza di citocromo c. Mitocondriale permeabilità transizione di apertura dei pori in mitocondri isolati è innescato da sequenziale CaCl 2 aggiunte e viene misurata con un spettrofluorimetro monitorando Ca 2 + libero dai mitocondri, crollo potenziale di membrana e gonfiore della matrice mitocondriale. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig2.jpg" /> Figura 2. Misurazione controllo del rapporto respiratorio (RCR) del cuore isolato mitocondri. Consumo di ossigeno da cuore isolato mitocondri viene misurata durante State 3 della respirazione in presenza di succinato e ADP, e durante la respirazione Stato 4 dopo il consumo ADP. La risposta di mitocondri isolati per uncouplers viene misurata mediante l&#39;aggiunta di CCCP. Numeri sul grafico sono i tassi di consumo di ossigeno da mitocondri isolati in nmol / min / mg di proteina. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig3.jpg" /> Figura 3. Misura<html> mento dell&#39;integrità della membrana del cuore isolato mitocondri. Membrana mitocondriale è determinata misurando il consumo di ossigeno nei mitocondri isolati in presenza di succinato e ADP e dopo l&#39;aggiunta del citocromo c. Numeri sul grafico sono i tassi di consumo di ossigeno da mitocondri isolati in nmol / min / mg di proteina. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig4.jpg" /> Figura 4. Configurazione hardware Spectrofluorometer per il multi-parametro di misura di apertura mtPTP. La configurazione hardware del spettrofluorimetro comprende una sorgente luminosa, un monocromatore di eccitazione, un compartimento campione e due rivelatori con lunghezze d&#39;onda di emissione a 525 nm fissi e 595 nm. Rivelatore 1 è utilizzato per la rilevazione del segnale di Fura FF alta e bassa Ca 2 +, JC-1 monomero, e il segnale di rigonfiamento. Rivelatore 2 misura il segnale JC-1 aggregato. jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig5.jpg" /> Figura 5. Multi-parametro di misura di apertura mtPTP nel cuore mitocondri isolati. apertura mtPTP è stato innescato da aggiunte sequenziali di 20 mM CaCl 2 ed è stato caratterizzato da Ca 2 + rilascio dai mitocondri, crollo potenziale di membrana mitocondriale e un aumento del volume matrice mitocondriale (gonfiore). Extramitocondriale Ca 2 + e potenziale di membrana sono stati misurati con gli indicatori raziometriche Fura FF (traccia verde) e JC-1 (traccia rossa). Gonfiore dei mitocondri è stata misurata mediante la registrazione di diffusione della luce a 525 nm (nero traccia). Specificità di JC-1 e segnali rigonfiamento è stato testato con 1 CCCP pM e 5 ug / ml alameticina (una tossina microbica). <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig6.jpg" /> Figura 6. Multi-Parametro di misura di apertura mtPTP nel cuore mitocondri isolati in presenza di ciclosporina A. ciclosporina A (1 pM) aumenta il numero di CaCl 2 impulsi necessari per aprire mtPTP nel cuore mitocondri isolati.

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A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte.</a> 21, 469-478 (2011).</li><li>Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">What is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).</li><li>Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++influx+and+efflux+rates+in+guinea+pig+cardiac+mitochondria:+low+and+high+affinity+effects+of+cyclosporine+A.">Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).</li><li>Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+rat+heart+mitochondria.+The+demonstration+of+functional+coupling+to+oxidative+phosphorylation+in+an+inner+membrane-matrix+preparation.">Creatine kinase of rat heart mitochondria. The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation.</a> J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).</li><li>Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+uncoupling+proteins+and+decreased+efficiency+in+palmitate-perfused+hyperthyroid+rat+heart.">Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart.</a> AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).</li><li>Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Permeability+Transition+Pore+in+Skeletal+Muscle+Mitochondria.">Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 273, 12662-12668 (1998).</li><li>Berman, S. B., Watkins, S. C., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+biochemical+and+ultrastructural+comparison+of+mitochondrial+permeability+transition+in+isolated+brain+and+liver+mitochondria:+evidence+for+reduced+sensitivity+of+brain+mitochondria.">Quantitative biochemical and ultrastructural comparison of mitochondrial permeability transition in isolated brain and liver mitochondria: evidence for reduced sensitivity of brain mitochondria.</a> Exp. Neurol. 164, 415-425 (2000).</li><li>Panov, A., Dikalov, S., Shalbuyeva, N., Hemendinger, R., Greenamyre, J. T., Rosenfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-+and+tissue-specific+relationships+between+mitochondrial+permeability+transition+and+generation+of+ROS+in+brain+and+liver+mitochondria+of+rats+and+mice.">Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 292, 708-718 (2007).</li><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+isolation:+functional+mitochondria+from+mouse+liver,+muscle+and+cultured+filroblasts.">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured filroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo qui presentato descrive i passi necessari per valutare sperimentali transizione di apertura permeabilità pori nel cuore mitocondri isolati (Figura 1 e Figura 4): la procedura per isolare cuore topo mitocondri, i controlli respiratori che assicurano l&#39;integrità e la funzionalità, i parametri monitorati durante mitocondriali mtPTP apertura ed i coloranti utilizzati per la loro misurazione, la costituzione della strumentazione spettrofluorimetrico, e la caratterizzazio...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3030 </td></tr><tr><td> Inibitore della tripsina (soia) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9128 </td></tr><tr><td> Sodio hydrosulfite </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71699 </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R8875 </td></tr><tr><td> Citocromo c </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7752 </td></tr><tr><td> Alameticina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2759 </td></tr><tr><td> Ciclosporina A </td><td> Calbiochem </td><td> 239835 </td></tr><tr><td> Fura FF </td><td> Invitrogen </td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;td&gt; JC-1 </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Tissue-grinder Potter Elvehjem con pestello in Teflon 15 ml </td><td> Wheaton Industries </td><td></td></tr><tr><td> Agitatore ad asta </td><td> Wheaton Industries </td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm (elettrodo di ossigeno a temperatura controllata) </td><td> Hansatech Instruments </td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80 spettrofluorimetro doppia emissione </td><td> Photon Technology International, Inc. </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria

Il poro di transizione di permeabilità mitocondriale (mtPTP) è un canale non specifica che forma nella membrana mitocondriale interna per trasportare soluti con una massa molecolare inferiore a 1,5 kDa. Anche se l&#39;identità definitiva molecolare del poro è ancora in discussione, proteine ​​come cyclophilin D, VDAC e ANT contribuire alla mtPTP formazione. Mentre il coinvolgimento di apertura mtPTP nella morte cellulare è ben definito 1, accumulando prove indicano che la mtPTP serve un ruolo fisiologico durante mitocondriale omeostasi Ca 2 + 2, bioenergetica e redox di segnalazione 3. apertura mtPTP è innescata da matrice Ca 2 +, ma la sua attività può essere modulata da diversi altri fattori come stress ossidativo, adenina nucleotide esaurimento, alte concentrazioni di Pi, depolarizzazione della membrana mitocondriale o sganciamento, e acidi grassi a catena lunga 4. In vitro, mtPTP apertura può essere achieved aumentando la concentrazione di Ca 2 + all&#39;interno della matrice mitocondriale mediante aggiunte esogene di Ca 2 + (capacità di ritenzione di calcio). Quando i livelli di Ca 2 + nei mitocondri raggiunge una certa soglia, il mtPTP apre e facilita Ca 2 + rilascio, la dissipazione della forza motrice protonica, crollo potenziale di membrana ed un aumento di volume della matrice mitocondriale (gonfiore) che conduce infine alla rottura del membrana mitocondriale esterna e perdita irreversibile della funzione organello. Qui si descrive un saggio fluorimetrico che permette una caratterizzazione completa di apertura mtPTP nel cuore topo mitocondri isolati. Il test prevede la misurazione simultanea dei tre parametri mitocondriali che vengono alterati quando apertura mtPTP verifica: mitocondriale Ca 2 + movimentazione (assorbimento e rilascio, misurata dalla concentrazione di Ca 2 + nel mezzo di saggio), il potenziale di membrana mitocondriale, e mitochoVolume ndrial. I coloranti impiegati per la misurazione Ca 2 + nel mezzo di saggio e il potenziale di membrana mitocondriale sono Fura FF, un impermeant membrana, indicatore raziometrico che subisce uno spostamento della lunghezza d&#39;onda di eccitazione in presenza di Ca 2 +, e JC-1, un cationico, Indicatore raziometrico che costituisce monomeri verdi o rosse aggregati al potenziale di membrana a bassa e alta, rispettivamente. Variazioni di volume mitocondriale sono misurata registrando diffusione della luce dalla sospensione mitocondriale. Dal momento che di alta qualità, i mitocondri funzionale sono necessari per il test di apertura mtPTP, abbiamo anche descrivere i passi necessari per ottenere intatta, cuore altamente accoppiato e funzionale mitocondri isolati.

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Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Un protocollo spettrofluorimetrico per la misura della permeabilità mitocondriale apertura dei pori di transizione nel cuore topo mitocondri isolati è presentato qui. Il test prevede la misurazione simultanea dei mitocondri Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manipolazione, volume potenziale di membrana mitocondriale e mitocondriale. La procedura per ottenere il cuore di alta qualità e funzionale mitocondri è anche descritto.

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

multi-parameter-measurement-permeability-transition-pore-opening

Research

JoVE Journal

Biology

21.4K Views.  University of Washington, Seattle. Un protocollo spettrofluorimetrico per la misura della permeabilità mitocondriale apertura dei pori di transizione nel cuore topo mitocondri isolati è presentato qui. Il test prevede la misurazione simultanea dei mitocondri Ca 2 + Manipolazione, volume potenziale di membrana mitocondriale e mitocondriale. La procedura per ottenere il cuore di alta qualità e funzionale mitocondri è anche descritto.

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Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Preparazione del Cuore Rat altamente Accoppiato mitocondri

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

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Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Misurare il osmotica dell&#39;acqua Permeabilità Coefficiente (P<sub&gt; F</sub&gt;) Di celle sferiche: protoplasti impianto isolato come un esempio

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immunolocalizzazione della membrana esterna proteine ​​mediante citometria di flusso di mitocondri isolati

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Misura di Smooth funzione muscolare nei isolato carta igienica-applicazioni Farmacologia Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Metodi per la determinazione dei tassi di glucosio e acidi grassi ossidazione nel cuore isolato di lavoro Rat

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La tecnica del rene perfusi mouse isolato

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found responsible for very diverse diseases, ranging from neurological pathologies to cancer. Interestingly, mitochondria have recently been shown to display the capacity to be transferred between cell types, notably from human mesenchymal stem cells (MSC) to cancer cells in coculture conditions, with metabolic and functional consequences for the mitochondria recipient cells, further enhancing the current interest for the biological properties of these organelles.
Evaluating the effects of the transferred MSC mitochondria in the target cells is of primary importance to understand the biological outcome of such cell-cell interactions. The MitoCeption protocol described here allows the transfer of the mitochondria isolated beforehand from the donor cells to the target cells, using MSC mitochondria and glioblastoma stem cells (GSC) as a model system. This protocol has previously been used to transfer mitochondria, isolated from MSCs, to adherent MDA-MB-231 cancer cells. This mitochondria transfer protocol is adapted here for GSCs that present the specific particularity of growing as neurospheres in vitro. The transfer of the isolated mitochondria can be followed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and confocal imaging using mitochondria vital dyes. The use of mitochondria donor and target cells with distinct haplotypes (SNPs) also allows detection of the transferred mitochondria based on the concentration of their circular mitochondrial DNA (mtDNA) in the target cells. Once the protocol has been validated with these criteria, the cells harboring the transferred mitochondria can be further analyzed to determine the effects of the exogenous mitochondria on biological properties such as cell metabolism, plasticity, proliferation and response to therapy.

Here, a protocol (MitoCeption) is presented to transfer mitochondria, isolated from human mesenchymal stem cells (MSC), to glioblastoma stem cells (GSC), with the goal of studying their biological effects on GSC metabolism and functions. A similar protocol can be adapted to transfer mitochondria between other cell types.