The Watts Laboratory through the years, and Dr. Marlene Cohen and Kathy Schenck for teaching us this assay over two decades ago. NIGMS R25GM074119 supported development of this teaching module for a Short Course in Integrative and Systems Pharmacology held on the campus of MSU from 2005 to 2013.

NOTA: Tutte le procedure descritte in questo documento vengono eseguite secondo le linee guida stabilite dalla cura e l&#39;uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) della Michigan State University. Preparazione sistema 1. e configurazione <ol><li> Effettuare 5 L di una soluzione salina fisiologica (PSS), che è la quantità necessaria per un esperimento di contrazione vasca tessuto che utilizza fino a 50 ml bagni tessuto; vedi Tabella 2 per PSS ricetta. Calcolare totale volume richiesto moltiplicando numero di bagni tessuto volte il volume bagno e poi moltiplicato per il numero di lavaggi tissutali necessarie. <ol><li> Utilizzare Tabella 2 come guida per rendere PSS. Sciogliere i sali in circa 4 L di acqua. Si raccomanda acqua Tipo I - HPLC: NOTE </li><li> Aggiungere 8 ml di 1 M CaCl 2 soluzione (147 g / L se si utilizza il sale diidrato) alla soluzione, quindi la soluzione finale è Calcium mM 1.6. </li><li> Soluzione PSS Quantum sufficit a 5 L. </li></ol&gt; </li><li> Preriscaldare il sistema bagno tessuto a 37 ° C, attivando il ricircolo bagno di acqua riscaldata. Fase critica: Ogni componente del sistema è camicia d&#39;acqua, assicurarsi che siano collegati in serie tra loro. La direzione del flusso è critica - assicurare che i flussi d&#39;acqua verso ogni componente del collegamento spinato più basso e al più alto collegamento spinato. </li><li> Accendere sistema di acquisizione dati. Accendere i trasduttori di forza almeno 15 minuti prima dell&#39;esperimento equilibrare la temperatura. NOTA: La maggior parte dei trasduttori di forza impiegano estensimetri che sono sensibili alle variazioni di temperatura e presentano deriva termica inizialmente dopo l&#39;accensione. </li><li> Lancio software di acquisizione dati e di garantire il collegamento con il sistema di acquisizione dati. Si prega di seguire le istruzioni del produttore per l&#39;abilitazione registrazione dei dati. </li><li> Assicurarsi che i trasduttori di forza sono calibrati prima tessuto viene posto nel bagno tessuti e prima della registrazione dei dati è iniziata; foistruzioni del produttore per la calibrazione llow. </li><li> Collegare il sistema bagno tessuto una O 95% 2/5% di CO 2 bombole di gas per uso medico e controllare eventuali perdite di gas e quindi pressurizzare il sistema. </li><li> Riempire i serbatoi bagno tessuto con PSS e lasciare il tempo di soluzione di raggiungere la temperatura ottimale. Prime il sistema e rimuovere eventuali bolle d&#39;aria all&#39;interno del sistema e il tubo. </li><li> Controllare aeratori bagno tessuto per garantire l&#39;aerazione soluzione coerente, che ossigena il buffer PSS e fornisce moto browniano per distribuire farmaci che saranno introdotte nel bagno del tessuto durante l&#39;esperimento. Assicurati di aerazione / bolle non provoca il movimento dei tessuti, che interromperà le registrazioni di dati; diminuire il flusso di gas come necessario. NOTA: Il bagno dei tessuti e il sistema di acquisizione dati sono ora pronti ad avviare l&#39;esperimento. </li></ol> 2. Preparazione del tessuto <ol><li> Idealmente, sezionare tessuti dal animali immediatamente prima dell&#39;uso e collocare direttamente into PSS. NOTA: Alcuni tessuti possono essere salvati in PSS notte a 4 ° C, ma controlli appropriati deve essere fatto per convalidare la funzione del tessuto dopo una conservazione prolungata; vedere la sezione 6. </li><li> Utilizzare l&#39;aorta toracica come il tessuto in questo esercizio. </li><li> Anestetizzare il topo in conformità alle linee guida istituzionali e posizionare il lato dorsale topo giù. Confermare anestesia tramite una punta pizzico e la perdita di risposta riflessa a questo stimolo doloroso. NOTA: Questo protocollo usa 70 mg / kg di pentobarbital distribuito mediante un&#39;iniezione intraperitoneale. Linee guida istituzionali per l&#39;anestesia roditore possono differire. </li><li> Creare un pneumotorace creando un&#39;incisione con forbici lungo la membrana sul fondo della gabbia toracica. Poi, continuare l&#39;incisione dal fondo della gabbia toracica allo sterno e bisecare. </li><li> Sezionare o collocare parte quegli organi che sono sulla parte superiore della colonna vertebrale e individuare l&#39;aorta, che si trova direttamente lungo la colonna vertebrale. NOTA: Questo step fornisce uno spazio di lavoro chiaro per sezionare l&#39;aorta. </li><li> Sever tutti i collegamenti con l&#39;aorta; dall&#39;esofago, polmone, ecc e tagliare l&#39;aorta perpendicolare alla colonna vertebrale a livello del diaframma. </li><li> Premere delicatamente l&#39;aorta con una pinza e usare le forbici per sezionare l&#39;aorta dalla spina dorsale. Avviare la dissezione nella zona della membrana inferiore adiacente alla colonna vertebrale e di lavoro verso il cuore. Assicurati di prendere precauzioni in più per non tirare o tirare sul tessuto aortico, che può danneggiare il tessuto. </li><li> Posizionare immediatamente l&#39;aorta nel piatto dissezione preparato contenente PSS. NOTA: dissezione dell&#39;aorta ad anelli è meglio farlo in un piatto dissezione che ha un silastic nero fondazione. Questo permette l&#39;utilizzo di cavi che possono essere utilizzati per cannulare aorta ed essere fissato al piatto, garantendo stabilità mentre nel piatto dissezione. Lo sfondo nero prevede contrasto che aiuta la dissezione. Si deve prestare attenzione in uso di fili cannulating come endothelstrato di cellule ial può essere rimosso con eccesso sfregamento del filo contro il lume del vaso. </li><li> Dai filo e fare un piccolo angolo di 90 ° ad una estremità e spingere l&#39;estremità angolata nella fondazione silastic per ancorare il filo guida. Inserire l&#39;intera aorta nel piatto dissezione. </li><li> Tenere l&#39;estremità del filo guida con una pinza, e poi infilare delicatamente il filo nel lume dell&#39;aorta. </li><li> Utilizzare pinze e far scorrere il aorta sul filo. Quando l&#39;estremità libera del filo guida è visibile, curva il filo delicatamente e collocare l&#39;estremità libera nelle fondamenta silastic del piatto per stabilizzare il tessuto. </li><li> Utilizzando Vännäs piccole forbici e pinze, rimuovere il tessuto adiposo perivascolare e tutti gli altri tessuti estranei, coaguli di sangue, ecc fino a visualizzare l&#39;aorta toracica bianco e un po &#39;fibrosa. </li><li> Rimuovere l&#39;aorta pulita dal filo e usare le forbici per tagliare l&#39;aorta in anelli che sono di circa 3-5 mm in larghezza. </li><li> Inserire un anello aortico su uno di una coppia di tiganci SSUE tenendo premuto il gancio e con pinze a scivolare delicatamente l&#39;anello sul gancio. Ripetere questa operazione con il secondo gancio. Prestare attenzione al fine di garantire i ganci non groviglio; vedi figura 3. </li><li> Verificare che ogni gancio ha una sutura di seta diverso allegato. Verificare che un gancio ha un piccolo anello annodato seta che consente per il fissaggio a un bicchiere o in acciaio inossidabile, mentre l&#39;altro è un 10-4 cm lungo pezzo di sutura che sarà legato a mano al trasduttore di forza; vedi figura 3. NOTA: Dopo l&#39;aorta è fissato ai ganci, il tessuto è pronto per essere montato nel bagno tessuti; vedi figura 3. </li><li> Ripetere i passaggi 2,14-2,15, per montare un secondo anello aortico nella seconda camera bagno tessuto. </li></ol> 3. Tissue Placement a Bath <ol><li> Si noti che in questo sistema, i bagni tessuti stessi sono fermi. In questo momento, riempire le vasche di tessuto con riscaldato, PSS aerato e consentire la soluzione di venire a temperature. </li><li> Con la sutura di seta, cravatta uno dei ganci sulla preparazione del tessuto al piolo della barra di acciaio inossidabile. Posizionare questo fine nella camera bagno tessuti. Collegare l&#39;asta di un supporto ad anello e posizionare l&#39;altra estremità nel piatto colorazione pieno di PSS per mantenere il tessuto immersi in tampone; vedi figura 3. <ol><li> Posizionare l&#39;asta e il tessuto nella camera bagno tessuto e assicurarsi che il tessuto è completamente immerso nel PSS e l&#39;asta è sicuro; vedi figura 3. </li><li> Legare l&#39;altra sutura al trasduttore di forza e assicurarsi di lasciare lasco nel sutura tra il tessuto e il trasduttore di forza. NOTA: Questo gioco sarà rimosso regolando il micrometro; vedi figura 3. </li></ol></li><li> Ripetere questi passaggi per il secondo anello e il bagno il tessuto della camera aortica. </li></ol> 4. Impostare tensione passiva NOTA: Ogni tessuto ha una lunghezza (Lo) in cui le cellule muscolari lisce rispondono optimally. Esperimenti preliminari per determinare la tensione di stretching ottimale che realizza questa lunghezza deve essere eseguito per ciascun tipo di tessuto individuo da esaminare. Il ratto aorta toracica ha un ottimale tensionamento stiramento passivo di 4 g. <ol><li> Utilizzare il micrometro / cremagliera per aumentare la tensione di 2 g ed attendere il tessuto per raggiungere plateau. Una volta raggiunto plateau, aumentare la tensione altri 2 g e attendere per il tessuto di plateau. NOTA: negli anelli aortici, dopo la tensione iniziale di 2 g è tramontato e plateau raggiunto, il tessuto deve poi rilassarsi a ~ 1,6 g. Una seconda applicazione di 2 g porterebbe il tessuto ~ 3,6 g, da cui il tessuto sarà nuovamente valigie e tensione diminuirà. Quindi, dopo aver aggiunto 4 g di tensione totale, il software dovrebbe indicare circa 3,2 g di tensione. </li><li> Ripetere questi passaggi per il secondo anello e il bagno il tessuto della camera aortica. </li></ol> 5. Fare Equilibrazione e droga <ol><li> Equilibrare il tessuto per60 min dopo l&#39;applicazione di tensione passiva al tessuto. </li><li> Durante la fase di equilibrio, lavare il tessuto ogni 15-20 min. Svuotare la vasca tessuti e sostituire il PSS con PSS da un serbatoio riscaldato. NOTA: Durante questo tempo, il tessuto si rilasserà, che è indicata dalla perdita di tensione passiva. </li><li> Durante questo tempo, preparare farmaci per l&#39;esperimento, che devono essere almeno 1000 volte più concentrato rispetto alla concentrazione effettiva nel bagno, così è necessario solo un piccolo volume dello stock farmaco per ottenere la concentrazione desiderata. </li></ol> 6. Sfida iniziale <ol><li> Alla fine del periodo di equilibrazione, lavare il tessuto un&#39;ultima volta, salvare i dati, e riazzerare tutti gli ingressi. </li><li> Scegliere un agonista (composto che causerà contrazione attiva) a cui il tessuto risponde. NOTA: Nel ratto aorta toracica, il muscolo liscio arteriosa attivamente contratto per un agonista del recettore adrenergico alfa a causa della innervazione delil tessuto del sistema nervoso simpatico. Un agonisti adrenergici non sarebbe utile nei tessuti intestinali dato che agonisti adrenergici causano rilassamento. In questo caso potrebbe essere utilizzato un agonista del recettore come acetilcolina (recettore colinergico). Un&#39;alternativa sia fenilefrina e acetilcolina è quello di utilizzare un agonista non recettoriale quali alta potassio (K) come prima sfida. In muscolatura liscia, alta K opera per indirettamente i canali del calcio aperta e quindi è visto come un indice generale di integrità della muscolatura liscia. <ol><li> Eseguire la prima sfida o la sfida di sveglia con l&#39;aggiunta di 10 -5 M fenilefrina al bagno tessuti. Per raggiungere questa concentrazione in 50 ml vasca tessuto, aggiungere 50 ml di una soluzione di fenilefrina 10 -2 M. NOTA: 50 ml in 50 ml di PSS è una diluizione 1/1000, per cui la concentrazione finale è 1,000x inferiore a magazzino, o 10 -5 M. La conoscenza di volume e manutenzione costante del volume all&#39;interno del bagno tessuto cHamber è fondamentale per determinare la concentrazione finale di droga. </li></ol></li><li> Aggiungere 10 -5 M fenilefrina al bagno tessuti e consentire la contrazione di picco e poi plateau, quando la pendenza dei dati diventa zero. Assicurati di registrare ogni evento sperimentale per facilitare l&#39;analisi post-sperimentale. </li><li> Dopo plateau, lavare l&#39;agonista accuratamente svuotando e riempimento della camera di bagno con tessuto nuovo PSS. Assicuratevi di registrare questi eventi pure. NOTA: Una regola generale è che la concentrazione di agonista nel bagno è ridotto 10 volte con ogni lavaggio. Sebbene, più di 3-4 lavaggi possono essere necessari per portare il tessuto indietro al suo tono basale equilibrio (tensione). </li><li> Lasciare riposare in tessuto tono basale per ~ 10 minuti prima di procedere. </li></ol> 7. Experiment NOTA: Prazosin, un antagonista del recettore adrenergico alfa, sarà introdotto nella camera bagno tessuti a spostare il resp concentrazioneCurva Onse di fenilefrina (PE); questo è un antagonismo dimostrabile. <ol><li> Per un bagno, aggiungere il veicolo (H 2 O) in cui è stato sciolto prazosin. Per un altro, aggiungere la giusta concentrazione di prazosina. In questo caso, aggiungere 25 ml di veicolo ad un bagno e 25 pl di 10 -5 M concentrazione del prazosin all&#39;altro per ottenere un 5 x 10 -9 M o una concentrazione 5 nM nel bagno. NOTA: L&#39;aggiunta di veicolo sembra necessario in questo esempio, è imperativo farlo utilizzando altri veicoli che hanno un potenziale di essere vasoattivo (ad esempio, DMSO, etanolo, acetato). Aggiungere il rispettivo veicolo anche se poche prove esiste per essere vasoattivo. </li><li> Lascia veicolo / prazosina nei bagni e non lavare il tessuto per 1 ora. <ol><li> Mentre i tessuti sono equilibrante, preparare più concentrazioni di agonisti (PE). Comprendono una vasta gamma di concentrazioni, dalle concentrazioni che provochino alcuna risposta (ad esempio, &lt;/ Em&gt; 10 -9 M PE) a concentrazioni che superano la risposta massima (ad esempio, 10 -4 M PE). Dal curve concentrazione-risposta sono logaritmica in natura, fare sei soluzioni separate stock di PE (10 -6 -10 -1 m) attraverso diluizioni seriali dalla soluzione madre 10 -1 M. Assicurarsi che il volume necessario per ogni concentrazione è leggermente maggiore del triplo rispetto al volume totale necessario per tutti i bagni (cioè&gt; 300 ml). </li></ol></li><li> Procedere aggiungendo agonisti, come descritto nella Tabella 1. NOTA: Questo esperimento genererà una curva di concentrazione-risposta cumulativa a PE; ogni iterazione tiene conto della quantità di sostanza già aggiunto al bagno. Aggiunte verificano fino a quando aumentano più la contrazione, o l&#39;intera curva è stabilizzato. <ol><li> Aggiungere ogni concentrazione di farmaco singolarmente fino al raggiungimento della soglia di tessuti. </li><li> Se non si verifica alcun cambiamento, aggiungere il successivo concentrazioneSerie; vedi Tabella 2. NOTA: La tempistica di queste aggiunte dipende l&#39;agonista utilizzato. Ad esempio, noradrenalina e fenilefrina contrazione sviluppa rapidamente, e dovrebbero plateau in pochi minuti. Al contrario, endotelina-1 contrazione si sviluppa lentamente e può non plateau per quasi 45 minuti. Altro sperimentazione può essere effettuata sul tessuto dopo la costruzione di una curva come questo, purché (1) la sostanza lava fuori; e (2) si può dimostrare che il tessuto ritorna normale comportamento contrattile e non è influenzato dalle stimolazioni precedenti. </li></ol></li></ol> Analisi 8. Dati <ol><li> Assicurarsi di salvare i dati immediatamente prima e dopo un intervento (ad esempio, sveglia o completo della curva). </li><li> Trovare e impostare la linea di base del tessuto per ogni bagno tessuto canale di camera / ingresso, che sarà di aiuto in analisi dei dati. </li><li> Una volta che la linea di base è impostato, trovare la risposta massima per ogni concentrazione, e registrare il change al basale. Sequenziale muoversi attraverso ciascuna delle concentrazioni e registrare lo spostamento della linea di base. </li><li> Rappresentare graficamente i dati risultanti. Fate questo in qualsiasi programma di grafica. NOTA: Graph Pad Prism è progettato per farmacologi, e questo è ideale per il tipo di esperimento qui presentata. </li></ol>

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Authors have nothing to disclose.

Misurazione della forza isometrica come strumento di ricerca è di oltre 150 anni, ma continua ad essere la tecnica prototipo per la caratterizzazione dei recettori nei tessuti contrattili 2. La potenza di questa tecnica è nella sua semplicità e versatilità: registrando risposte indotte da concentrazioni crescenti di un agonista in presenza o assenza di un antagonista, una miriade di informazioni può essere ricavato sulle caratteristiche farmacologiche di ciascun farmaco e il recettore a cui si lega 3-5. Esperimenti di questo tipo Garner anche informazioni sulla concorrenza contro natura non competitiva degli antagonisti utilizzati, nonché eterogeneità recettore e effetti non specifici farmacologiche 6-8. Così, con permutazioni semplici a questa isolata esperimento vasca tessuto, un profilo farmacologico relativamente completo dei recettori che mediano agonista indotta contrazione muscolare può essere generato. In termini di agonismo, the efficacia relativa (E MAX) e la potenza (EC 50) di un agonista in un dato tessuto possono essere calcolati e rispetto alle reazioni di altri agonisti della stessa tessuti 1. Nel nostro esperimento, il ratto dell&#39;aorta toracica è stata incubata con entrambi veicolo o α 1 antagonista del recettore adrenergico prazosin (5 nM) per una ora prima di aggiungere l&#39;α 1 adrenergico fenilefrina al bagno tessuti e generando contrazione. Figura 2 presenta modificato risultati di figura 1. Le risposte verdi sono stati contrassegnati con la contrazione massima raggiunta dal PE contrassegnati come max, la ½ massima contrazione contrassegnati come tali e poi associato alla concentrazione di PE che ha causato tale risposta. Identificare questi valori è identificare la concentrazione effettiva di un agonista che realizza un mezzo max (50%) di risposta o valore EC 50. Purtroppo, con il parametro agonista-dipendentes da solo per determinare le caratteristiche dei recettori di legame può essere complicato 9. Idealmente, ulteriori esperimenti utilizzando antagonisti dei recettori permettono il calcolo dei due parametri importanti che sono fondamentali per definire l&#39;interazione tra un farmaco e un recettore: la -log 10 della dissociazione antagonista costante (pK B) e la -log 10 dell&#39;antagonista molare concentrazione necessaria per suscitare duplice spostamento verso destra della curva concentrazione-risposta (pA 2) 10. Sia K B e pA 2 guadagno loro utilità dal fatto che esse sono valori agonisti indipendenti, e rimangono costanti anche tra differenti tessuti 11. Dai dati della figura 2, pK B può essere calcolata utilizzando la seguente equazione e basato su valori di EC 50 calcolati altrove: CE 50 in assenza di prazosin = 2 x 10 -8 M CE 50 nella presence di prazosina = 7 x 10 -6 M Risolvere per K B nella seguente equazione: log (dr-1) = log [B] - log K B Dove: [B] = concentrazione antagonista, o 5 x 10 -9 M. log (5 x 10 -9 M) = -8.3 dr = rapporto dose di valore EC 50 in presenza di antagonisti / CE 50 in assenza. Se vi è uno spostamento verso destra, questo valore sarà maggiore di uno. Pertanto: dr = 7 x 10 -6 M / 2 x 10 -8 M o 700 x 10 -8 M / 2 x 10 -8 M = 700/2 = 350 Sostituendo per [B] e dr: log (350-1) = -8 - log K B 2.54 = -8 - log KB pK B = 10.54 Questo valore per prazosina è coerente con i valori ottenuti quando prazosina interagisce con un α 1 adrenergici recepto 12,13, suggerendo che il recettore adrenergico mediare contrazione fenilefrina è il recettore adrenergico α 1. Diversi passi sono fondamentali per il successo di questi esperimenti. I tessuti devono rimanere in PSS dopo la dissezione per prevenire la perdita di vitalità del tessuto. Qualsiasi preparazione muscolare isometrica ha un ottimo rapporto lunghezza-tensione che genera forza massima contro tensione passiva 14,15. Per l&#39;esperimento descritto in questo protocollo, tensione passiva ottimale è stato precedentemente determinato da incrementi brevemente aggiunta di 0,5 g di tensione passiva al tessuto. Il tessuto deve iniziare senza tono e poi, dopo 30 minuti di equilibrio, il tessuto è stato sfidato con una concentrazione massima di KCl (80 mm), che ha generato tono attivo. Quindi, il tessuto è stato lavato e lasciata tornare a tono basale. Dopo 15 min al basale, un&#39;altra 0,5 g di tensione passiva è stata posta e questo processo ripetuto finché un plateau ditensione attiva è stato raggiunto con tensione passiva supplementare. In esperimenti preliminari, 4 g totale di tensione passiva è stato determinato per raggiungere la massima generazione tensione attiva in anelli aortici, e quindi tale quantità totale di tensione è posto sugli anelli prima equilibrazione. Procedurale, è meglio azzerare prima applicazione tensione passiva, ma può essere fatto in qualsiasi momento prima dell&#39;esperimento. Over-stiramento dei tessuti, in qualsiasi punto l&#39;esperimento o dissezione, avrà un impatto negativo vitalità del tessuto e dei risultati sperimentali. Questo è più indispensabile quando si posiziona tessuti nel bagno, in quanto questa operazione ha la più alta probabilità di eccessivo stiramento. Lavaggio adeguato, in numero e durata è richiesto per gli effetti riproducibili. Una seconda sfida troppo presto dopo una sfida iniziale, o prima di tessuti sono tornati alla tensione di riferimento, si tradurrà in risposte aberranti. Se lo studio reversibili antagonisti / inibitori, i tessuti non devono essere lavati prima di agonista Inoltre, come l&#39;inibizioneconcentrazione tor sarà diminuito. Ci sono notevoli vantaggi e svantaggi per gli isolati da bagno tessuto saggi. Svantaggi: I tessuti possono sperimentare diversi gradi di danni durante la rimozione chirurgica o il posizionamento di anelli a ganci. Poiché la cellula endoteliale è il rivestimento interno dell&#39;anello aortico, è necessario prestare attenzione al posizionamento dell&#39;anello a ganci in modo da non danneggiare questo strato di cellule. I tessuti possono anche avere distintamente differenti lunghezze di tempo in cui sono vitali nel bagno tessuti, e questo deve essere determinata; Non tutti i tessuti sono uguali. Lungo queste linee, i tessuti possono cambiare nella loro capacità di risposta per tutto il giorno in modo che i controlli orari diventano un controllo necessario per ogni esperimento. Un buon esempio di questo è la trachea cavia che migliora in contrattilità massimo del 100% durante un tipico esperimento 8 ore. I farmaci che sono poco solubili in acqua possono precipitare nel PSS. Infine, un cumulativoND additivi non cumulativi di un farmaco che è un agonista potrebbe tradursi in risultati diversi se si verifica recettore desensibilizzazione per l&#39;agonista; angiotensina II è uno di questi farmaci che mostra tachifilassi rapidi. Vantaggi: Uno dei vantaggi principali di tessuto esperimenti bagno è che è in tempo reale; si può vedere l&#39;esperimento come si svolge e può rapidamente trarre conclusioni e pianificare i prossimi passi, così come risoluzione dei problemi durante un esperimento. Un esperimento prende un giorno di fare. Tessuti multipli possono tipicamente essere preparati da un animale in modo che un animale può servire come proprio controllo, e che aggiunge forza per un esperimento. Uno può anche isolare il tessuto da altri fattori, per testare una risposta relativamente pura del tessuto al farmaco. In esperimenti in vitro come il sistema vasca tessuto permettono anche l&#39;uso di una piccola quantità di farmaco rispetto ad un esperimento in vivo. Il disegno sperimentale di base qui descritto può essereampiamente modificato per consentire la registrazione dei parametri aggiuntivi o l&#39;introduzione di altri stimoli esterni. Ad esempio, l&#39;aggiunta di elettrodi consente campo stimolazione elettrica di nervi che innervano 16,17. Con l&#39;aggiunta di sonde termiche o di pH, gli effetti della temperatura e del pH sulle risposte contrattili possono essere misurati 18,19. Analogamente, l&#39;ossigeno può essere sostituito parzialmente o completamente con N 2 per valutare ipossia effetti indotti. Inoltre, gli stessi principi di base della misurazione contrattilità isometrica utilizzati in questo video possono essere utilizzati per sviluppare sistemi che permettono la misurazione concomitante di sviluppo tensione isometrica e cambiamenti di calcio intracellulare 20. La trasduzione del segnale è anche facilmente studiato, poiché esistono sistemi che possono rapidamente congelare un campione di tessuto durante una risposta, in modo tale che l&#39;attività di un sistema via di trasduzione del segnale può essere verificata biochimicamente. La variazione di equipment che può essere usato per fare questo è enorme. L&#39;intero sistema, sia a mano costruito o automatico, può essere acquistato da più aziende diverse. I bagni di tessuto e titolari dei tessuti utilizzati in questo protocollo sono stati (bagni tissutali) e costruito a mano (titolari) soffiato a mano da parte di un in-house officine Michigan State University.

La disciplina di farmacologia ha utilizzato il sistema isolato bagno tessuto per oltre 150 anni. La versatilità di questo sistema ha permesso agli scienziati di tutto il mondo per caratterizzare recettori e del segnale del recettore trasduzione, con questa conoscenza che costituisce la base di terapie che hanno curato milioni di persone con malattie o disturbi come l&#39;ipertensione, insufficienza cardiaca, diabete, malattie gastrointestinali, della vescica disfunzione, asma e disturbi della deglutizione, per citarne solo alcuni. A tutt&#39;oggi, la vasca tessuto isolato rimane un aspetto importante di sviluppo di farmaci e la ricerca di base, in quanto consente il tessuto di funzionare come un tessuto. In questa lezione Giove, un protocollo formale è condivisa a dimostrare un esperimento visivo e virtuale utilizzando i dati di un esperimento isolato carta igienica che misura contrazione isometrica, che permette la caratterizzazione del recettore. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tessuto vive unnd funzioni nel suo complesso tessuto, con esito fisiologica (contrazione o rilassamento) che è rilevante per il corpo. Si tratta di una sintesi di passi (interazione farmaco-recettore, trasduzione del segnale, di seconda generazione messenger, il cambiamento in eccitabilità del muscolo liscio, e modificare in funzione del tessuto). Mentre altre tecniche permettono lo studio di ciascuno di questi passaggi (es radiolegante vincolante per affinità farmaco, la misurazione di secondi messaggeri), isolato tecnica vasca tessuto consente l&#39;integrazione di tutti questi passaggi 1. Un altro vantaggio è che il mantenimento funzione del tessuto consente il calcolo di importanti variabili farmacologici che sono più significativi in un tessuto vs un ambiente cellulare; si avvicina a come i farmaci esaminati funzionerebbero nel corpo nel suo complesso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="863">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LabChart Software</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td></td>
			<td>7.2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PowerLab (4 channel)&#160;</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QuadBridge (4 channel)</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>ML112</td>
			<td>ML112</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Adapter Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLAC11</td>
			<td>MLAC11</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Force-Displacement Transducer</td>
			<td>Grass Instrument Co</td>
			<td>FT03</td>
			<td>FT03</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grass Transducer Cable</td>
			<td>Grass Instrument Co</td>
			<td>TAC-7 REV-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BNC to BNC Cable</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>MLAC01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IsoTemp 2100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>IC-2100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Bath</td>
			<td>Multiple Sources&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Physiological Salt Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PSS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Braided Silk Suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>51-7615</td>
			<td>SP104</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ring Stand</td>
			<td>Humboldt MFG Co</td>
			<td>H-2122 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting Dishes</td>
			<td>Handmade with Silicone</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tygon Tubing</td>
			<td>VWR Scientific</td>
			<td>63010-100</td>
			<td>R-3603</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hose Clamps</td>
			<td>Cole-Parmer Instrument Co</td>
			<td>06832-08</td>
			<td>SNP-8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50ml Muscle Bath</td>
			<td>Eberhartglass Blowing</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250ml Warming Chambers</td>
			<td>Eberhartglass Blowing</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gas Dispersion Tube</td>
			<td>Ace Glass</td>
			<td>7202-06</td>
			<td>7202-02</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Custom Stands</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Three-Prong Clamps</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td>Talon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-Connector</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td>Talon</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Hooks</td>
			<td>Hand Made in House</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue Dissection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica Stereomicroscope MZ6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>10447254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomaster Microscope Fiber-Optic Light Source</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12562-36</td>
			<td>12562-36</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Petri Dish</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td></td>
			<td>7740 Glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sylgard Silicone Elastomer</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 170 Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vannas Scissors</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-150</td>
			<td>160-150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Splinter &#38; Fixation Forceps</td>
			<td>George Tiemann &#38; Co</td>
			<td>160-55</td>
			<td>160-55</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of smooth muscle function in the isolated tissue bath-applications to pharmacology research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

In termini di agonismo, l&#39;efficacia relativa (E MAX) e la potenza (EC 50) di un agonista in un dato tessuto possono essere calcolate e confrontate alle risposte di altri agonisti della stessa tessuti 1. Nel nostro esperimento, il ratto dell&#39;aorta toracica è stata incubata con entrambi veicolo o α 1 antagonista del recettore adrenergico prazosin (5 nM) per un&#39;ora prima di aggiungere l&#39;α 1 adrenergico fenilefrina al bagno tessuti e generando contrazione (Figura 1). Figura 2 presenta modificate risultati di Figura 1. Le risposte verdi hanno segnato la contrazione massima raggiunta dal PE contrassegnato come max, la contrazione massima ½ contrassegnati come tali e poi associato alla concentrazione di PE che ha causato tale risposta. Identificare questi valori è identificare la concentrazione effettiva di un agonista che realizza un mezzo max (50%) di risposta o CE <sub&gt; 50 valore. Questo era donegraphically in questo software example.Computer che utilizza funzioni logistiche per curve sigmoidali possono essere utilizzati per il montaggio della curva e calcolo dei valori di EC 50. In generare e interpretare questi risultati, è importante utilizzare entrambe le concentrazioni basse e alte di agonista per creare la curva concentrazione-risposta. Senza abbastanza punti per mostrare una linea di base stabile e massima plateau, EC 50 e E MAX possono solo essere stimati. Ciò è stato fatto graficamente in questo esempio. Software che utilizza funzioni logistiche per le curve sigmoidali può essere utilizzato per il montaggio della curva e il calcolo dei valori di EC 50. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Carta igienica Schema Cartoon rappresentano un anello di tessuto posto nella doppia parete, camicia d&#39;acqua ba tessutoth. Buffer afflusso e deflusso sono regolati da un rubinetto di vetro 3 vie integrato nella base della camera. O 2 / CO 2 viene fatto gorgogliare attraverso un aeratore che viene sigillato con una guarnizione per impedire perdite di PSS o gas. Ingresso ricircolo è inferiore alla uscita per mantenere adeguato ricircolo e prevenire la formazione di sacche d&#39;aria che potrebbero causare disregolazione temperatura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52324/52324fig2highres.jpg" /> Figura 2:. Rat toracica Aorta + endotelio La figura in alto raffigura quattro esperimenti separati (diversi animali e fatto da diversi ricercatori su diversi set up, come rappresentato da colori diversi) per testare la capacità di prazosina di spostare una contrazione PE-indotta. Prazosin (5 NM) chiaramente spostato PE-indotta curva contrazione verso destra in modo parallelo. Figura 3: Rat toracica Aorta + endotelio stima grafica dei valori di EC 50 per PE in assenza (veicolo) e presenza (prazosina) antagonista.. Linea verde (gruppo C) solo è segnato. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Sale </td><td> MW (g / moli) </td><td> 5 Litri </td><td> FINALE mM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> (grammi) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58.45 </td><td> 37.99 </td><td> 130 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.56 </td><td> 1.75 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> KH2PO4 </td><td> 136,1 </td><td> 0.8 </td><td> 1.18 </td></tr><tr><td> MgSO4• 7h20 </td><td> 246.5 </td><td> 1.45 </td><td> 1.17 </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84.21 </td><td> 6.25 </td><td> 14.9 </td></tr><tr><td> Destrosio </td><td> 180,16 </td><td> 5 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 380 </td><td> 0.05 </td><td> 0.03 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Normal fisiologica soluzione salina (PSS) Ricetta Contenuti del PSS tamponato con bicarbonato utilizzato in questo esperimento.. Sono inclusi i pesi molecolari di tutti i sali e la quantità aggiunta di 5 L di dH 2 O per ottenere la concentrazione desiderata. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Concentrazione in bagno </td><td> L&#39;aggiunta di agonisti fatto il bagno </td></tr><tr><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 50 ml 1 x 10 -6 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -9 M </td><td> 100 ml 1 x 10-6 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -5 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -8 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -5 </td></tr><tr><td> 1 x 10 -7 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -4 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -7 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -4 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -6 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -6 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -3 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 3 x 10 -5 M </td><td> 100 ml 1 x 10 -2 M </td></tr><tr><td> 1 x 10 -4 M </td><td> 35 ml 1 x 10 -1 M </td></tr></tbody></table> Tabella 2:. Tissue Bath Additive Agonist Concentrazioni La quantità di agonisti da aggiungere a ogni bagno a proPerly costruire curve concentrazione-risposta cumulative. La concentrazione vasca desiderato si ottiene con l&#39;aggiunta di quantità sequenziali di concentrazioni crescenti di agonista. Ogni aggiunta tiene conto della concentrazione di agonista già presente nel bagno. Questo viene fatto per ridurre al minimo l&#39;aumento di volume nel bagno tessuto che risulterebbe da utilizzando volumi crescenti di una singola concentrazione di agonista.

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Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Misura di Smooth funzione muscolare nei isolato carta igienica-applicazioni Farmacologia Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

measurement-smooth-muscle-function-isolated-tissue-bath-applications

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Drugs Acting on Autonomic Nervous System: Adrenergic Agonists and Antagonists Agents

SCIENTISTS IN ACTION

135.8K Views.  Michigan State University. This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition. 

Video: Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

Focale Ca 2 + Rilevamento transitoria nel muscolo liscio

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

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Biologia

The Mouse Cremaster Muscle Preparation for Intravital Imaging of the Microcirculation

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic by-products. This balance is achieved by the movement of blood through the microcirculation, which encompasses the smallest branches of the vascular supply throughout all tissues and organs. Arterioles branch from arteries to form networks that control the distribution and magnitude of oxygenated blood flowing into the multitude of capillaries intimately associated with parenchymal cells. Capillaries provide a large surface area for diffusional exchange between tissue cells and the blood supply. Venules collect capillary effluent and converge as they return deoxygenated blood towards the heart. To observe these processes in real time requires an experimental approach for visualizing and manipulating the living microcirculation.
The cremaster muscle of rats was first used as a model for studying inflammation using histology and electron microscopy post mortem1,2. 
The first in vivo report of the exposed intact rat cremaster muscle investigated microvascular responses to vasoactive drugs using reflected light3. However 
curvature of the muscle and lack of focused illumination limited the usefulness of this preparation. The major breakthrough entailed opening the muscle, 
detaching it from the testicle and spreading it radially as a flat sheet for transillumination under a compound microscope4. While shown to be a valuable 
preparation to study the physiology of the microcirculation in rats5 and hamsters6, the cremaster muscle in mice7 has proven particularly useful in dissecting 
cellular pathways involved in regulating microvascular function8-11 and real-time imaging of intercellular signaling12. 
The cremaster muscle is derived from the internal oblique and transverse abdominus muscles as the testes descend through the inguinal canal13. 
It serves to support (Greek: cremaster = suspender) and maintain temperature of the testes. As described here, the cremaster muscle is prepared as a thin flat sheet 
for outstanding optical resolution. With the mouse maintained at a stable body temperature and plane of anesthesia, surgical preparation involves freeing the muscle 
from surrounding tissue and the testes, spreading it onto transparent pedestal of silastic rubber and securing the edges with insect pins while irrigating it 
continuously with physiological salt solution. The present protocol utilizes transgenic mice expressing GCaMP2 in arteriolar endothelial cells. GCaMP2 is a 
genetically encoded fluorescent calcium indicator molecule12. Widefield imaging and an intensified charge-coupled device camera enable in vivo study of 
calcium signaling in the arteriolar endothelium.

A tissue preparation is described for visualization and experimental manipulation of the living microcirculation. In anesthetized male mice, the thin, highly vascularized cremaster muscle is prepared for intravital microscopy to study microvascular networks including arterioles, capillaries and venules. This preparation is readily adapted for rats and hamsters.

La preparazione muscolare mouse Cremaster for Imaging intravitale del microcircolo

Throughout the body, the maintenance of homeostasis requires the constant supply of oxygen and nutrients concomitant with removal of metabolic ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Vivo Valutazione Ex della contrattilità, affaticabilità e alternanza in isolati muscoli scheletrici

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Esplorare arteriosa Muscolo liscio KV7 Funzione canale del potassio con morsetto Elettrofisiologia Patch e Myography pressione

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Misura della forza durante la contrazione per valutare la funzione muscolare in larve Zebrafish

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

A due fotoni Imaging di Intracellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipolazione e l&#39;ossido nitrico Produzione in endoteliale e della muscolatura liscia cellule di un isolato Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Misura di fluttuazioni calcio all&#39;interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

L&#39;isolamento di Murine coronarica vascolari cellule muscolari lisce

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La tecnica del rene perfusi mouse isolato

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...