Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Fondo nazionale belga per fi Scienti c Research (FNRS), il Interuniversitario di attrazione polacchi programma-belga Politica della scienza e le &quot;Comunità francese del Belgio-Actions de Recherches Concertées&quot; per FC, dalla Fondazione Gerusalemme Israele Science ( ISF) a MM (Grant # 1311-1312), e NM (Grant # 1312-1312).

1 preparazione di soluzioni <ol><li> Preparare isotonica (600 mOsm) e ipotonica (500 mOsm) soluzioni contenenti KCl 10 mM, 1 mM CaCl 2, e 8 M 2 (N-morfolina) Acido -ethanesulphonic (MES), pH 5.7 e regolare osmolarità con gli importi adeguati di D-sorbitolo: 540 mm per l&#39;isotonico e 440 mm per la soluzione ipotonica. Verificare l&#39;osmolarità della soluzione (entro il 3% del valore nominale) utilizzando un osmometro. </li><li> Preparare uno stock secco di &#39;mix enzimatico&#39; contenente i seguenti enzimi: 0,55 g cellulasi, 0,1 g pectolyase, 0,33 g di polivinilpirrolidone K 30, 0,33 g di BSA (vedi tabella 1 qui di seguito), mescolare la polvere secca da vortice, fare 5,7 mg aliquote e conservare a -20 ° C. </li></ol> 2 Isolamento di protoplasti di Arabidopsis mesofillo <ol><li> Preparare una capsula di Petri (10 cm) con circa 6 gocce (circa. 30 ml ciascuna) di soluzione isotonica. </li><li> Sbucciare le abaxial epidermide (inferiore) foglia di Arabidopsis, cut la foglia pelati in quadrati di circa 4 x 4 mm 2, quindi posizionare i quadrati sulla soluzione isotonica scende con il lato abaxial esposto verso il basso, toccando la soluzione. </li><li> Sciogliere 5,7 mg del mix enzima in 165 microlitri soluzione isotonica (3,3% w / w) in una provetta da 1,5 ml, mescolare delicatamente pipettando per un minuto o giù di lì fino alla dissoluzione, e mettere alcune gocce simili della soluzione enzimatica nello stesso Petri piatto. </li><li> Trasferire i pezzi di foglia sulla soluzione enzimatica gocce, chiudere il piatto di tenuta del coperchio con un giro di parafilm ed incubare per 20 minuti, il piatto che galleggia in un bagnomaria regolato a 28 ° C. </li><li> Aggiungere qualche più gocce della soluzione isotonica al piatto (2 gocce per ogni goccia di soluzione enzimatica). Trasferire ogni pezzo foglia di una nuova goccia soluzione isotonica, poi, in sequenza, ad una seconda goccia (per lavare la soluzione enzimatica via). Sollevare il pezzo per il bordo usando pinze, agita nella seconda discesa (come una bustina di tè) per rilasciare i protoplasti.Raccogliere le gocce con i protoplasti (utilizzando una pipetta 100 microlitri tagliati fuori) in una provetta da 1,5 ml. </li></ol> 3 Il ipotonico sfida saggio: Gonfiore cellulare Arabidopsis mesofillo <ol><li> Preparare il sistema di perfusione (Figura 1A) riempiendo una colonna con la soluzione isotonica e un&#39;altra colonna con la soluzione ipotonica. Aprire la valvola, far entrare un po flusso della soluzione (prima il ipotonico, quindi il isotonica) per riempire il tubo fino in fondo al collettore di aspirazione (Figura 1B). Assicurarsi che non ci siano bolle d&#39;aria intrappolate, e quindi chiudere la valvola. </li><li> Sigillare il coprioggetto, utilizzando grasso al silicone (Tabella 1), per fare un fondo per la camera all&#39;interno della diapositiva plexiglass (Figura 1B, vedi anche gli schemi della camera in Figura 1C). Per rendere il fondo della camera (la superficie rivolta verso l&#39;alto esposta del coprioggetto all&#39;interno dell&#39;anello di grasso) &quot;sticky&quot; per protoplasti, cappottocon carica positiva-cuscinetto protamina solfato (1% in acqua; Tabella 1) o poli-L-lisina (0,1% in acqua; Tabella 1). Stendere questo &#39;collante&#39; sopra il coprioggetto utilizzando un puntale, attendere per 1 - 2 minuti, sciacquare 3 - 4 volte con la soluzione isotonica e scuotere via la soluzione rimanente. </li><li> Riempire la camera con la soluzione isotonica. Poi, aggiungere una goccia di protoplasti contenenti soluzione alla camera, usando un puntale tagliato fuori e aspettare 3-4 minuti per i protoplasti di stabilirsi. Coprire la camera con un coperchio trasparente (Figure 1D, 1E) di toccare la superficie soluzione (evitare di intrappolare bolle d&#39;aria sotto). </li><li> Posizionare il vetrino (con delicatezza!) Su un tavolo microscopio invertito, collegarlo al sistema di perfusione e la pompa (la guardia contro le bolle d&#39;aria nel tubo!) E accendere il flusso della soluzione isotonica per perfusione costante a 1 ml / min (le tariffe più veloci può essere usato fino a 4 ml / min). </li><li> Per la registrazionevariazioni di volume, è usato un microscopio invertito, con un obiettivo 20X e con una videocamera CCD collegata ad un computer PC. Utilizzare il plugin &#39;CMU 1394 Camera Driver&#39; del software ImageJ (vedere la tabella di materiali specifici per gli indirizzi di download di questi due pezzi di software) per registrare un filmato video di 60 secondi di protoplasti immobili selezionati (presumibilmente, quelle attaccata al fondo) ad una velocità di 1 immagine / sec (1 Hz). Avviare la registrazione con 15 sec lavaggio della soluzione isotonica (ciò costituisce la linea di base), passare alla soluzione ipotonica per 45 secondi (per completare un totale di 60 secondi dall&#39;inizio della perfusione). Salvare il filmato in formato TIF. NOTA: Scegliere un campo di vista con il maggior numero possibile di cellule, che soddisfano i seguenti criteri: forma sferica e con un contorno di cellule ben focalizzato il loro più grande perimetro (Figura 2A). </li></ol> 4 Analisi della variazione di volume delle cellule Utilizzo ImageJ NOTA: Per analizzare ilserie di immagini di un rigonfiamento cellulare, utilizzare il &#39;Image Explorer&#39; e plugins &#39;Protoplast Analyzer&#39; nel software ImageJ (scritto da Xavier Draye) 14. Partendo con i protoplasti scelti al loro primo punto temporale, il plug-in &#39;Protoplast Analyzer&#39; in grado di rilevare automaticamente i protoplasti bordi (contorni) e calcolare l&#39;andamento temporale delle loro aree durante l&#39;esperimento (i plugin sono disponibili con il programma di analisi PfFit, qui di seguito) . <ol><li> Inizia ImageJ. Per aprire il filmato, fare clic su &#39;File&#39; del pannello ImageJ, poi, consecutivamente sul menu a discesa mentre si svolgono: &#39;Import&#39; poi &#39;Image Explorer&#39;. Evidenziare il filmato prescelto, quindi fare clic destro su di esso, poi a sinistra, clicca su &#39;Protoplast Analyzer&#39;. Percorso attraverso il filmato (con un cursore in protoplasti immagine in basso) per identificare i protoplasti che rimangono in gran parte immobile durante l&#39;esperimento - questi saranno analizzati. Ritornare alla prima image, utilizzando il mouse, disegnare cerchi (raccolti dagli strumenti di disegno ImageJ) intorno alle protoplasti selezionati (Figura 2B), quindi fare clic su &#39;OK&#39; nella tabella dei &quot;parametri di rilevazione&quot; che è apparso. </li><li> Per avviare l&#39;algoritmo di rilevamento di protoplasti, fare clic su &#39;locale&#39; sul pannello superiore dell&#39;immagine protoplasti, poi &#39;Processo&#39; nel menu a discesa. Esaminare i cerchi verdi intorno alle protoplasti selezionati (Figura 2C) in tutto il film. Salvare il &#39;risultato&#39; in un file Excel. Esci ImageJ. NOTA: Nel caso in cui appare un punto rosso (per indicare un cattivo contorno fit - di solito a causa di un contrasto povero), eseguire di nuovo con parametri diversi. </li><li> Per separare le linee appartenenti a ciascuna cella (che - se due o più cellule sono state analizzate simultaneamente - si intrecciano, perché l&#39;analisi viene fatta fotogramma per fotogramma), in Excel, ordinare i dati salvati in base alla colonna numero di cellule (&#39;oggetto&#39; ). </li><li> Per determine il fattore di conversione pixel-per-micron per ottenere il valore reale di P f, scatto l&#39;immagine di un sovrano micrometro tramite lo stesso obiettivo 20X microscopio. Trascinare una linea (prelevati da strumenti di disegno ImageJ) lungo l&#39;immagine righello e leggere il numero di pixel pari alla lunghezza righello nella parte inferiore del pannello principale ImageJ. Convertire i valori arbitrari zona dei pixel nel file Excel in micron 2. Salvare il corso zone tempo (per ogni cella separatamente) come file di testo (due colonne di numeri unici). NOTA: Questo sarà un input per il programma &#39;PfFit&#39; volumi di montaggio. </li></ol> 5. Modellazione del Tasso di osmolarità Variazione nella camera sperimentale Uso ImageJ e la f Fit Matlab programma P <ol><li> Aggiungere 2 mg xilene cyanol (Tabella 1, in basso) a 100 ml di soluzione isotonica (per produrre il &#39;colorante indicatore&#39;). </li><li> Preparare il sistema di perfusione (come in 3.1) con il colorante indicatore e la h non tintosoluzione ypotonic. </li><li> Sigillare il vetrino con grasso al silicone sul fondo della camera di plexiglass, quindi riempire delicatamente la camera con il colorante indicatore, coprire con un coprioggetto (come con i protoplasti prima) e posizionarlo sul palco microscopio. </li><li> Collegare la camera al sistema di perfusione e la pompa, e accendere il flusso di colorante indicatore di perfusione costante a l ml / min. </li><li> Registrare un filmato di 60 secondi alla velocità di 1 Hz. Avviare la registrazione con 15 sec di colorante indicatore, passare alla soluzione ipotonica per 45 sec. Smettere di riprese. Lavare con l&#39;indicatore Dye (almeno per 30 secondi), quindi avviare un nuovo film. Ripetere circa 5 - 6 volte e salvare tutti i film </li><li> Utilizzare il software ImageJ per analizzare le immagini video della trasmittanza colorante indicatore di ottenere un andamento temporale media del cambiamento trasmittanza. <ol><li> Inizia ImageJ, fare clic su &#39;File&#39;, poi, &#39;Apri&#39;, e cercare il film. Per ogni film, disegnare un ampio 10 pixel verticalirettangolo ovunque l&#39;immagine 1 ° del film su. Fare clic su &#39;Immagine&#39; sul pannello principale ImageJ, quindi fare clic su &#39;Crop&#39; nel menu a discesa. </li><li> Per allineare i 60 fotogrammi (del filmato 60 sec) in una riga, fare clic di nuovo &#39;Immagine&#39;, quindi fare clic su consecutivamente nei menu a discesa mentre si svolgono: &#39;Stacks&#39; e &#39;Fare Montage&#39; (colonne, righe 60 1). Disegnare un rettangolo orizzontale alta 1 pixel ovunque lungo tutta la fila di immagini e cliccare su &#39;Analizza&#39; nel pannello principale ImageJ, quindi fare clic su &#39;profilo grafico&#39; nel menu a discesa. NOTA: A &#39;Trama di Montage&#39; finestra apparirà (non mostrato), e un elenco dei dati di trasmittanza possono essere aperti dal menu. Ogni immagine del film è rappresentato in questa lista di 10 valori di trasmittanza originari del suo rettangolo largo 10 pixel e di conseguenza la &quot;base dei tempi&quot; (il numero sequenziale dell&#39;immagine) è 10 volte più a lungo. </li><li> Copiare le liste del dat trasmittanzauna (una lista per ogni film) in un file Excel. Calcolare la media dei corsi a tempo trasmittanza ottenuti dai diversi film delle vampate di colorante indicatore. Generare una base reale tempo moltiplicando il numero sequenziale dell&#39;immagine di 0,1. Salvare il periodo di tempo mediato (due colonne) in un file di testo. NOTA: Prima di media, se lo si desidera, tracciare i corsi individuali di tempo, di rifiutare eventuali irregolarità. Assicurarsi che il film include almeno 5 sec finale dello stato stazionario trasmittanza dell&#39;indicatore Dye. </li></ol></li><li> Avviare il raccordo Fit Matlab programma P f (pannello &#39;indicatore Fit&#39;, figura 3) per calcolare i vari parametri del corso tempo osmolarità. NOTA: sulla base delle note concentrazioni iniziali e finali della soluzione nella vasca da bagno, l&#39;andamento temporale del cambiamento di concentrazione osmotica della soluzione viene calcolata l&#39;andamento temporale di concentrazione (calcolato, a sua volta, dalla trasmittanza colorante indicatore), supponendo che segue le stesse dinamiche come ilconcentrazione di colorante. P f Fit è un programma disponibile per l&#39;uso a titolo gratuito. Il &#39;PfFit_Installer_web.exe&#39; può essere scaricato da: P f Guida per l&#39;utente Fit &#39;con spiegazioni e definizioni precise è accessibile tramite Giove come un file supplementare, che aiuta a familiarizzare l&#39;utente con il programma P F Fit. </li><li> Nel pannello &#39;indicatore Fit&#39;, importare i dati del corso tempo medio di trasmittanza Indicatore Dye (&#39;file di dati Indicator&#39;, figura 3A) e inserire manualmente i parametri dell&#39;esperimento attuali e le ipotesi iniziali dei parametri &#39;width&#39; e &#39; t_half &#39;che descrive l&#39;andamento temporale della concentrazione di colorante indicatore (Figura 3B. Fare clic su&#39; Esegui &#39;per visualizzare le trame dei andamento nel tempo della concentrazione colorante indicatore (dati reali e in forma, figura 4a), e del modellato (calcolato) Bagno osmolarità (Figura 4B). NOTA: agood adatta ai dati è essenziale (una raccomandazione: iniziare con i valori riportati nella figura 3). </li></ol> 6 Determinazione del P F utilizzando il Fitting programma Matlab P f Fit NOTA: Oltre alle ipotesi di base per quanto riguarda il comportamento di un protoplasti come un vero e perfetto osmometro 11, la determinazione di P f basa sulla presunzione che P f può cambiare con il tempo, che questa dinamica di P f sottende il tempo corso della variazione di volume delle cellule e che i tre parametri sufficienti per descriverlo: P fi (il valore iniziale di P f), Slope Pf (il tasso di variazione lineare di P f) e Delay (il periodo compreso tra l&#39;inizio del bagno cambiamento osmolarità fino all&#39;inizio della variazione di volume delle cellule). Diversi modelli possono essere testati, tra cui diverse combinazioni di questi parametri e dei loro valori, inclusi i valori nulli 11. P <sub&gt; f Fit cerca la migliore combinazione di questi parametri per produrre - mediante calcolo - la riproduzione più fedele l&#39;andamento temporale sperimentale della variazione di volume cella 11, calcolato, a sua volta, dalla serie importato di aree cellula-profilo (vedi anche il Supplemental &#39;P f Guida Fit utente&#39;). <ol><li> Passare alla &#39;Fit Volume&#39; del pannello (Figura 5). Scegliere per l&#39;importazione del file di dati aree (il file di testo con l&#39;andamento temporale delle &quot;aree&quot; dei protoplasti analizzati, Figura 5A). Scegliere &#39;Ultimo Indicatore Fitting&#39; come fonte parametro (Figura 5B, vedere la &#39;P f Guida per l&#39;utente Fit&#39; di alternative). NOTA: Questi parametri (Figura 5D) vengono poi utilizzate per rigenerare il cambiamento osmoticum nella vasca da bagno per i volumi procedura di montaggio. </li><li> Nel &#39;Volume Fit&#39; pannello (Figura 5C), inizializzare (compilare le ipotesi iniziali per i parametri F) P: P f, Pf e Delay Slope (una raccomandazione: iniziare con 1, 1, e 30, rispettivamente), ha scelto il modello di &#39;classe&#39; (una raccomandazione: iniziare con II e marchio &#39;verifica&#39; per tutti e tre i parametri da montare). Fare clic su &#39;Esegui&#39;, poi bulbo oculare la figura intermedia (Figura 5E) e regolare il parametro Delay e la lunghezza del record, se necessario. </li><li> Esaminate il grafico dei risultati (figura 6) per valutare la qualità vestibilità e registrare l&#39;errore di misura. Modificare i parametri di inizializzazione pochi piegare ogni, e ri-&#39;Run &#39;. Nota: Non scoraggiatevi quando il programma si blocca - basta riavviare il programma! </li><li> Ripetere questa procedura diverse volte, partendo da diverse combinazioni di parametri di inizializzazione, puntando il valore minimo dell&#39;errore in forma. </li><li> Copiare l&#39;elenco dei risultati in forma direttamente dallo schermo, o trovare in tegli PfFit-generato il file &#39;_FIT_Vol_Results.txt&#39;. </li></ol>

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We have nothing to disclose.

Descritto qui è una procedura semplice e molto efficace per misurare la P f di isolati protoplasti vegetali, applicabile in linea di principio anche ad altre cellule sferiche, ad es., Oociti di rana 11. Questo metodo si basa sulla misura della P f in risposta ad una sfida osmotica alla cella. A differenza di altri metodi basati su questo approccio, tuttavia, la variazione di soluzioni, cioè, della osmolarità, non è istantanea ma graduale, durante un bagno perfusione...

L&#39;assorbimento di acqua e il flusso attraverso le membrane cellulari è un requisito fondamentale per l&#39;esistenza dell&#39;impianto sia a cellulare e tutto il livello dell&#39;impianto. A livello cellulare, acquaporine (AQPs) giocano un ruolo chiave nella regolazione del coefficiente di permeabilità all&#39;acqua osmotica (P f) della membrana cellulare 1-3. Ad oggi, diversi metodi sono stati utilizzati per misurare il endogena P f di protoplasti da diversi organi vegetali (ad esempio radici, mesofillo, endodermis, ecc., Recensito da Chaumont et al. 4). Uno degli approcci per misurare P f è quello di esporre i protoplasti di una sfida osmotico e di monitorare il tasso iniziale del suo cambiamento di volume (ad esempio., La pendenza della prima fase lineare della variazione di volume). Due metodi differenti sono stati precedentemente descritti sulla base di questo approccio, entrambi basati su uno scambio istantaneo di soluzioni. Il primo consiste immobilizzione del protoplasti con una micropipetta di aspirazione e commutare il flusso della soluzione 5 e la seconda di trasferimento del protoplasti da una soluzione all&#39;altra utilizzando una micropipetta 6. Questi aspirazione micropipetta e micropipetta metodi di trasferimento, che permettono l&#39;acquisizione di immagini proprio all&#39;inizio dello scambio soluzione veloce (per catturare la prima fase lineare della variazione di volume), probabilmente comportare uno stress fisico per protoplasti e richiedono attrezzature specializzate e micromanipolazione esperto. Il metodo qui descritto riduce al minimo il disturbo alle cellule, comporta nessun micromanipolazione e permette la derivazione di P f quando la perfusione bagno non è istantanea. Dopo la digestione enzimatica, i protoplasti, immersi in una soluzione isotonica, sono immobilizzati sul fondo coprioggetto di vetro di un Plexiglass (aka Lucite o perspex) da camera di interazione carica. Poi, durante un bagno perfusione costante,la soluzione isotonica viene lavato via da una soluzione ipotonica generando una sfida ipoosmotico ai protoplasti. Il rigonfiamento del protoplasti è video registrato e quindi, combinando le informazioni sul decorso della perfusione vasca e l&#39;andamento temporale del gonfiore cella, il P f è determinata dalla elaborazione di immagini e procedure di montaggio curva. I vantaggi di questo metodo sono che l&#39;esperimento è molto efficiente, cioè è possibile monitorare alcune cellule simultaneamente in un singolo test, e che non richiede particolari attrezzature o particolari competenze micromanipolazione. Diverse applicazioni di questo metodo sono possibili. Ad esempio, la determinazione del nativo P f di una varietà di cellule di diversi tessuti e piante, come mesofillo e raggruppare le cellule della guaina di Arabidopsis foglia 7, mais mesofillo foglia o radice cellule della corteccia 8-10 o di sospensione di cellule in coltura 11,12. In additisu, è possibile determinare P f di cellule animali sferiche come le cellule ovociti 11. Un altro esempio riguarda l&#39;esame delle attività di AQP da espressione transitoria della loro gene nei protoplasti (o qualsiasi altri geni che possono influire li, ad esempio, i geni di chinasi) e la determinazione del loro contributo alla P f; per esempio, l&#39;espressione di pomodoro AQP SlTIP2; 2 in Arabidopsis mesofillo protoplasti di PEG trasformazione e determinazione la SlTIP2; P 2-correlati F 13. Infine, l&#39;esame degli effetti sulla P f di diverse molecole / sostanze (farmaci, ormoni, ecc) ha aggiunto alle soluzioni possono anche essere esaminato, per esempio del bloccante AQP HgCl 2 7. Il seguente protocollo descrive l&#39;isolamento di protoplasti di cellule e la determinazione del loro P f Arabidopsis mesofillo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:288px;">KCl</td>
			<td style="width:140px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:159px;">01247-1</td>
			<td style="width:516px;"><a href="http://www.chemimpex.com/">http://www.chemimpex.com</a> 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:288px;">CaCl2</td>
			<td style="width:140px;">Merck</td>
			<td style="width:159px;">11718006</td>
			<td><a href="http://www.merck.com/">http://www.merck.com</a> 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:288px;">2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">15152002</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:288px;">D-Sorbitol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">18032003</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:288px;">Cellulase</td>
			<td style="width:140px;">Worthington, Lakewood, NJ, USA</td>
			<td style="width:159px;">LS002603</td>
			<td><a href="http://www.worthingtonbiochem.com/">http://www.worthingtonbiochem.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:288px;">Pectolyase</td>
			<td style="width:140px;">Karlan,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Phonix, AZ, USA</td>
			<td style="width:159px;">8006</td>
			<td><a href="http://www.karlan.com/">http://www.karlan.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:288px;">Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">81420</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:288px;"><a href="https://my.labguru.com/catalog/materials/216">Bovine Serum Albumin (BSA)</a></td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">A9418-5G</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:288px;">Protamine sulphate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P4380</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P8920</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">X4126</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Silicone vacuum grease heavy</td>
			<td style="width:140px;">Merck</td>
			<td style="width:159px;">107921</td>
			<td><a href="https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&amp;SEO_ErrorPageOccurred=true&amp;attachments=CoA">https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&#38;SEO_ErrorPageOccurred=true&#38;attachments=CoA</a></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100/TS100F</td>
			<td><a href="http://www.nikoninstruments.com/">http://www.nikoninstruments.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Peristaltic pump</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td style="width:159px;">EP-1 Econo&#160;Pump</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Grayscale digital camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td style="width:159px;">CFW-1308M</td>
			<td><a href="http://www.scioncorp.com/">http://www.scioncorp.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CMU 1394 Camera Driver&#8217; plugin for ImageJ</td>
			<td style="width:140px;">Carnegie Mellon</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html">http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html</a> 
			Free software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td style="width:140px;">NIH</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> 
			Free software</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Econo Gradient Pump Fittings Kit</td>
			<td style="width:140px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:159px;">731-9006</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Connectors, manifold</td>
			<td style="width:140px;">DirectMed</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S">http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Burette infusion sets (columns)</td>
			<td style="width:140px;">Welford</td>
			<td style="width:159px;">IF-BR-001</td>
			<td>http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tubing</td>
			<td style="width:140px;">TYGON</td>
			<td style="width:159px;">R-3603</td>
			<td><a href="http://www.usplastic.com/">http://www.usplastic.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plexiglass slide etc.</td>
			<td style="width:140px;">Perspectiv</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.perspectiv.co.il/index-en.html">http://www.perspectiv.co.il/index-en.html</a> 
			Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as &#39;a copy of the slide already made for M. Moshelion&#39;.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">3M packaging Scotch tape 1&#39;&#39;, clear</td>
			<td style="width:140px;">Viking Industrial, UK</td>
			<td style="width:159px;">VKMONO25</td>
			<td><a href="http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8">http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8</a> 
			any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the osmotic water permeability coefficient (pf) of spherical cells: isolated plant protoplasts as an example

Studiare AQP meccanismi di regolazione è fondamentale per la comprensione delle relazioni idriche sia a livello cellulare e tutto il livello dell&#39;impianto. Presentato qui è un metodo semplice e molto efficace per la determinazione del coefficiente di permeabilità all&#39;acqua osmotica (P f) in protoplasti vegetali, applicabile in linea di principio anche ad altre cellule sferiche come oociti di rana. Il primo passo del saggio è l&#39;isolamento di protoplasti dal tessuto vegetale di interesse mediante digestione enzimatica in una camera con una soluzione isotonica adeguata. La seconda fase consiste in un saggio sfida osmotica: protoplasti immobilizzati sul fondo della camera vengono sottoposti ad una partenza perfusione costante con una soluzione isotonica e seguiti da una soluzione ipotonica. Il gonfiore cella è il video registrato. Nella terza fase, le immagini vengono elaborate in linea per produrre variazioni di volume, e l&#39;andamento temporale delle variazioni di volume è correlato con l&#39;andamento temporale della variazione di osmolarezza del mezzo perfusione camera, utilizzando una curva di raccordo procedura scritta in Matlab (il &#39;PfFit&#39;), per produrre P f.

Per determinare la P f e confrontare l&#39;attività di diversi AQPs, vengono utilizzati protoplasti da mesofillo foglia Arabidopsis. Questi protoplasti sono stati trovati ad avere bassi basale (sfondo) livelli P f 7 e può servire come un sistema funzionale espressione per consentire riproducibili misurazioni P f. Protoplasti da una foglia maturo da un 6 settimane di età Arabidopsis pianta sono stati isolati e tre gene costruisce con i geni AQP d...

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Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Misurare il coefficiente di permeabilità all&#39;acqua osmotica (P f) delle cellule può aiutare a capire i meccanismi di regolazione delle acquaporine (AQPs). P determinazione F in protoplasti di cellule vegetali sferiche qui presentati coinvolge protoplasti isolamento e l&#39;analisi numerica dei loro tasso iniziale di variazione di volume a seguito di una sfida osmotico costante durante il bagno di perfusione.

Misurare il osmotica dell&#39;acqua Permeabilità Coefficiente (P<sub&gt; F</sub&gt;) Di celle sferiche: protoplasti impianto isolato come un esempio

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

15.9K Views.  The Hebrew University of Jerusalem.  Misurare il coefficiente di permeabilità all'acqua osmotica (P f) delle cellule può aiutare a capire i meccanismi di regolazione delle acquaporine (AQPs). P determinazione F in protoplasti di cellule vegetali sferiche qui presentati coinvolge protoplasti isolamento e l'analisi numerica dei loro tasso iniziale di variazione di volume a seguito di una sfida osmotico costante durante il bagno di perfusione. 

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Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network function1. These proteins are found at the presynaptic and postsynaptic membranes 2. Studies in mice indicate that neurexins and neurologins have an essential role in synaptic transmission 1. Recent reports have shown that altered neuronal connections during the development of the human nervous system could constitute the basis of the etiology of numerous cases of autism spectrum disorders 3.
Caenorhabditis elegans could be used as an experimental tool to facilitate the study of the functioning of synaptic components, because of its simplicity for laboratory experimentation, and given that its nervous system and synaptic wiring has been fully characterized. In C. elegans nrx-1 and nlg-1 genes are orthologous to human NRXN1 and NLGN1 genes which encode alpha-neurexin-1 and neuroligin-1 proteins, respectively. In humans and nematodes, the organization of neurexins and neuroligins is similar in respect to functional domains.
The head of the nematode contains the amphid, a sensory organ of the nematode, which mediates responses to different stimuli, including osmotic strength. The amphid is made of 12 sensory bipolar neurons with ciliated dendrites and one presynaptic terminal axon 4. Two of these neurons, named ASHR and ASHL are particularly important in osmotic sensory function, detecting water-soluble repellents with high osmotic strength 5. The dendrites of these two neurons lengthen to the tip of the mouth and the axons extend to the nerve ring, where they make synaptic connections with other neurons determining the behavioral response 6.
To evaluate the implications of neurexin and neuroligin in high osmotic strength avoidance, we show the different response of C. elegans mutants defective in nrx-1 and nlg-1 genes, using a method based on a 4M fructose ring 7. The behavioral phenotypes were confirmed using specific RNAi clones 8. In C. elegans, the dsRNA required to trigger RNAi can be administered by feeding 9. The delivery of dsRNA through food induces the RNAi interference of the gene of interest thus allowing the identification of genetic components and network pathways.

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are membrane-neuron adhesion proteins which perform essential roles in synaptic differentiation and transmission. Neuroligin deficient mutants of C. elegans are defective in detecting osmotic strength, but when they also contain a mutation in the gene coding neurexin, they recover the wild type phenotype.

Evitare osmotica Caenorhabditis elegans: Funzione sinaptica di due geni, ortologhi di Human NRXN1 E NLGN1, Come candidati per l&#39;autismo

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network ...

Ricerca

Biologia

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescenza separazione delle cellule attivate delle protoplasti impianto

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Misurare la rigidezza flessionale di cellule batteriche Utilizzando una trappola ottica

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Misurazione della Cinetica di Trascrizione mRNA nelle cellule viventi singolo

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is avoided when the herbivore is able to select other plants2. Antibiosis is the degree to which the plant affects the fitness of the herbivore feeding on it1.Tolerance is the degree to which the plant can withstand or repair damage caused by the herbivore, without compromising the herbivore's growth and reproduction1. The durability of herbivore resistance in an agricultural setting depends to a great extent on the resistance mechanism favored during crop breeding efforts3.
We demonstrate a no-choice experiment designed to estimate the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp. Several species of African grasses of the genus Brachiaria are valuable forage and pasture plants in the Neotropics, but they can be severely challenged by several native species of spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae)4.To assess their resistance to spittlebugs, plants are vegetatively-propagated by stem cuttings and allowed to grow for approximately one month, allowing the growth of superficial roots on which spittlebugs can feed. At that point, each test plant is individually challenged with six spittlebug eggs near hatching. Infestations are allowed to progress for one month before evaluating plant damage and insect survival. Scoring plant damage provides an estimate of tolerance while scoring insect survival provides an estimate of antibiosis. This protocol has facilitated our plant breeding objective to enhance spittlebug resistance in commercial brachiariagrases5.

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

This video explains mechanisms of host plant resistance to herbivory and demonstrates a no-choice test that estimates the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp.

Caratterizzano Erbivoro meccanismi di resistenza: Spittlebugs su Brachiaria Spp. come esempio

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

La tecnica infiltrazione-centrifugazione per l&#39;estrazione di apoplastico fluido da foglie delle piante Utilizzo<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Come un esempio

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Analisi Rapida di fenotipi circadiani in Arabidopsis protoplasti transfettate con un luminescenti Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. Furthermore, chloroplasts are critical for plant responses to various abiotic stresses, such as salinity and osmotic stresses. A chloroplast may contain up to ~3,000 different proteins, some of which are encoded by its own genome. However, the majority of chloroplast proteins are encoded in the nucleus and synthesized in the cytosol, and these proteins need to be imported into the chloroplast through translocons at the chloroplast envelope membranes. Recent studies have shown that the chloroplast protein import can be actively regulated by stress. To biochemically investigate such regulation of protein import under stress conditions, we developed the method described here as a quick and straightforward procedure that can easily be achieved in any laboratory. In this method, plants are grown under normal conditions and then exposed to stress conditions in liquid culture. Plant material is collected, and chloroplasts are then released by homogenization. The crude homogenate is separated by density gradient centrifugation, enabling isolation of the intact chloroplasts. Chloroplast yield is assessed by counting, and chloroplast intactness is checked under a microscope. For the protein import assays, purified chloroplasts are incubated with 35S radiolabeled in vitro translated precursor proteins, and time-course experiments are conducted to enable comparisons of import rates between genotypes under stress conditions. We present data generated using this method which show that the rate of protein import into chloroplasts from a regulatory mutant is specifically altered under osmotic stress conditions.

Here we describe a new method to study protein import into isolated chloroplasts under stress. The method is rapid and straightforward, and can be applied to study the consequences of different stress conditions for chloroplast protein import, and the corresponding regulatory mechanisms.

Analisi delle proteine ​​importazione in cloroplasti isolati da piante stressate

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...