Ringraziamo il Prof. A. Vinogradov e il dottor Vera Grivennikova per l&#39;introduzione degli autori nel campo della biologia dei mitocondri e molti utili suggerimenti e consigli in questa procedura. Gli autori sono grati alla signora Amanda McKintock dall&#39;ufficio Queens University mezzi per l&#39;aiuto con la preparazione video.

Introduzione Mitocondri di cuore di ratto è una delle preparazioni più comuni per gli studi passati e presenti del metabolismo cellulare. Essi possono essere ottenuti in modo rapido e affidabile in grande quantità dal tipo selvaggio o animali knock-out. La procedura generale consiste di digestione del tessuto dalla tripsina, il frazionamento e centrifugazione differenziale. Ci sono diverse condizioni che devono essere tenuti in isolamento dei mitocondri da vari tessuti, compreso il cuore (Fig. 1). <ul><li> Il tessuto deve essere accuratamente tritata, in quanto influisce direttamente sulla produzione dei mitocondri ottenuti. Tessuto cardiaco è meglio tritare con piccole forbici curve e può essere seguita da utilizzare una smerigliatrice Latapie tessuto o, se un macinino tessuto non è disponibile, una pressa aglio con fori di diametro di uscita di circa 1,0 mm di diametro. </li><li> E &#39;necessario mantenere la temperatura delle soluzioni ad ogni passo. Pertanto l&#39;intera procedura deve essere effettuata in una stanza fredda e tutti gli strumenti e le soluzioni devono essere preparati e raffreddato in anticipo. Se le condizioni di temperatura non sono mantenuti stabili varie proprietà della preparazione può essere perso. Struttura mitocondriale è molto sensibile al gelo così overfreezing della sospensione (per esempio durante la centrifugazione) non è consentito, specialmente se gli studi di trasporto attivo sono importanti. </li><li> Un parametro importante è il tempo-durata della procedura, l&#39;isolamento deve essere eseguita il più rapidamente possibile e la preparazione ottenuto deve essere utilizzato immediatamente. Pertanto, strumenti chirurgici, le soluzioni e gli apparecchi devono essere preparati in anticipo. </li></ul> Materiali e strumenti Strumenti <ol><li> Dritti forbici operativo, punta aguzza </li><li> Forbici curve </li><li> Forcipe </li><li> Scatola di Petri </li><li> Piccolo imbuto + pezzo di nylon filtro (lavata) </li><li> 6 bicchieri da 50 ml </li><li> Due agitatori magnetici e due bagni di ghiaccio </li><li> Un bagno di ghiaccio grande </li><li> 2 barre magnetiche piccoli </li><li> Spatole per raschiare pellet </li><li> Centrifuga tubi </li><li> Stampa del tessuto Latapie (può essere sostituito con stampa aglio) </li><li> Teflon-vetro omogeneizzatori 20ml e 1-2ml </li><li> Rifiuti coppa </li><li> Provette Eppendorf per la finale sospensione mitocondriale e campioni per la determinazione delle proteine </li><li> Bagni di ghiaccio </li></ol> Le soluzioni (calcolato per 2 ratti): <ol><li> Soluzione di lavaggio: 0,3 M saccarosio, 10 HEPES mM (pH = 7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml) </li><li> Isolamento tampone: 0,3 M saccarosio, 10 HEPES mM (pH = 7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg / ml di BSA (Sigma A6003) (preparato dal buffer di lavaggio 100 ml). BSA può essere sostituito da meno costosa grassi acidi analoghi. Lo stesso buffer o le sue variazioni isotonica può essere utilizzata come buffer di risospensione. </li><li> Tripsina (Sigma T8003) soluzione: 2.5mg/ml a 1 mM HCl (0,5 ml) </li><li> Tripsina inibitore di soia (Sigma T9128) 6,5 mg/10 ml di tampone di isolamento </li></ol> Protocollo Lo schema generale della procedura è riportato in fig. 1. Cuore deve essere raffreddato e lavato in tampone di lavaggio, il tessuto asportato ventricolare, tritato e omogeneizzato fotolitica durante il trattamento con tripsina. La sospensione è centrifugata a bassa velocità e il supernatante ottenuto viene centrifugato di nuovo alle alte velocità per raccogliere mitocondri. A seconda degli esperimenti previsti nel buffer risospendere può essere sostituito da qualsiasi altra soluzione isotonica. Gli animali sono stati terminati in conformità con il Regno Unito &quot;Animali (procedure scientifiche) Act&quot;. dalla dislocazione cervicale seguita da decapitazione. E &#39;necessario estrarre il cuore subito dopo la decapitazione dell&#39;animale, in modo che non vi è alcun ritardo tra la fine degli animali e di estrazione del cuore. Se l&#39;isolamento parallelo di fegato mitocondri si aspetta i ratti vanno lasciati a digiuno durante la notte prima dell&#39;esperimento. <ol><li> Preparare tre bicchieri contenenti 40 ml di tampone di lavaggio. Raffreddarli nel ghiaccio-sale da bagno da 3 a 5 minuti prima di procedere alla fase successiva. Assicurarsi di non overfreeze e utilizzare immediatamente subito dopo nuvole di cristalli di ghiaccio iniziano a comparire. </li><li> Aprire il torace del ratto decapitato ed estrarre il cuore. Fare piccole incisioni e poi subito a trasferire il cuore alla gelida soluzione nel becher prima. Spremere il cuore per rimuovere il sangue e lo mise nel secondo becher. Ripetere questa operazione per ogni cuore. </li><li> Secco il cuore sulla carta da filtro. Togliere tutto il grasso, sangue rappreso, orecchiette e fasce e la piscina del tessuto ventricolare. </li><li> Tritare il tessuto in pool con piccole forbici curve sul piatto di Petri in ghiaccio per circa 5 minuti fino a quando la dimensione delle particelle è di circa 1-2 mm. </li><li> Mettere il trito in tessuto la stampa dei tessuti e passareattraverso. Essere consapevoli del fatto che una notevole quantità di materiale può rimanere sulla stampa in modo da raccogliere tutto il tessuto cardiaco dalle pareti e fondo della stampa. </li><li> Trasferire il materiale nel becher con 50 ml di tampone di lavaggio e mescolate. Quindi filtrare la sospensione attraverso un filtro di nylon. Lavare il tessuto tritato sul filtro 3 volte con il tampone di lavaggio e scartare il filtrato. </li><li> Trasferire il tessuto lavato in 20 ml di tampone di lavaggio e posizionarlo nel bagno di ghiaccio sul agitatore magnetico. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di tripsina sotto agitazione costante e avviare il timer. Preparare un altro agitatore magnetico, bagno di ghiaccio e un secondo 50 bicchiere ml. </li><li> Sul 4 ° minuto brevemente omogeneizzare la porzione sospensione da parte con un piccolo vagamente dotato di vetro teflon omogeneizzatore (10-15ml) con diversi colpi su e giù per disperdere la sospensione. Dopo omogeneizzazione trasferire la sospensione nel becher secondo. Ripetere la procedura per il 9 ° minuto, in modo da eseguire l&#39;omogeneizzazione della sospensione due volte in totale. Dopo 15 min di incubazione, aggiungere 10 ml di isolare tampone contenente inibitori della tripsina e incubare per 1 min. </li><li> Filtrare la sospensione di nuovo attraverso un filtro di nylon e salvare il filtrato. Raccogliere la frazione di particolato a sinistra su un filtro e omogeneizzare per 1 min a 15-20 ml di tampone di lavaggio. </li><li> Combina l&#39;omogeneizzato con il filtrato e centrifugare per 15 minuti a 600g. </li><li> Con attenzione filtrare il supernatante risultante in una provetta da centrifuga nuovo. Evitare la contaminazione del pellet e centrifugare ancora per 15 minuti a 8500g. </li><li> Dopo la centrifugazione ad alta velocità scartare il surnatante e lavare il pellet di 2-3 volte con 1 ml di buffer di scartare il soffice strato bianco bordo esterno. Spezzare il pellet con la spatola, ma evitare la macchia rossa di eritrociti in basso. Se le cellule del sangue ottenuto Loos, rimuovere i bit rossi dalla sospensione prima di omogeneizzazione. </li><li> Risospendere il pellet con un piccolo omogeneizzatore o, in alternativa pipettando gentile. Diluire la sospensione con più Isolationbuffer e centrifugare ancora per 15 minuti a 8500g. </li><li> Eliminare il surnatante, risospendere il pellet in risospensione tampone (un buffer isotonica di scelta) e centrifugare di nuovo. </li><li> La risultante marrone pellet contiene lavato mitocondri intatti. Risospendere il pellet in un volume molto piccolo di tampone isotonica di vostra scelta. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2202/2202fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Schema dimostrando la procedura passo-passo di isolamento del cuore di ratto mitocondri. Parte superiore, Fasi 1-9: disgregazione del tessuto, il trattamento tripsina e omogeneizzazione; parte inferiore, tappe 10-15: centrifugazione differenziale.

<ol>
	<li>Jacobus, W. E., Saks, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+heart+mitochondria:+changes+in+its+kinetic+properties+induced+by+coupling+to+oxidative+phosphorylation.">Creatine kinase of heart mitochondria: changes in its kinetic properties induced by coupling to oxidative phosphorylation.</a> Arch. Biochem. Biophys. 219, 167-178 (1982).</li><li>Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., Vinogradov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+assay+of+the+intramitochondrial+enzymes:+use+of+alamethicin+for+permeabilization+of+mitochondria.">In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria.</a> Anal. Biochem. 313, 46-52 (2003).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Dettagliato protocollo rapido per l&#39;isolamento dei mitocondri intatti con un alto grado di accoppiamento è descritto. Preparato ottenuto può essere utilizzato per la ricerca funzionale o strutturale bioenergetica cellulare, studi di proteomica o analisi del DNA mitocondriale e contenuto di lipidi. Studi biofisici di trasporto attivo di ioni e metaboliti intermedi può essere eseguita anche. E &#39;possibile elaborare ulteriormente la preparazione mitocondriale al fine di isolare particelle submitocondriali, membrana esterna o purificare componenti separati della fosforilazione ossidativa. Il metodo descritto è una modifica del protocollo standard di isolamento da Jacobus e Saks 1. Il rendimento atteso dei mitocondri preparato è di circa 10-15 mg di proteine ​​mitocondriali per cuore e il rapporto di controllo respiratorio sul malato / glutammato di tale preparazione varia da 8 a 12 con la respirazione Stato IV di circa 0,12 mmol O 2 proteine ​​xmin -1 XMG -1 a 23 ° C nel medio composto da saccarosio 0,25 M, 10 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 5 mM fosfato di potassio (pH 8,0) con 150 ADP mM per la respirazione iniziazione Stato III (per le esatte condizioni sperimentali ed integrazioni, vedi rif . 2). Particolare attenzione dovrebbe essere data ad alcuni dettagli tecnici prima dell&#39;inizio della procedura di isolamento. E &#39;fondamentale utilizzare pulire in policarbonato o provette da centrifuga in polipropilene, quindi i tubi devono essere accuratamente lavati con un pennello pulito e acqua calda, tuttavia il trattamento detergente deve essere mantenuto al minimo. Inoltre, è meglio per raccogliere tutta la vetreria e gli strumenti necessari nella stanza fredda un giorno prima l&#39;isolamento. Durante l&#39;isolamento durante il trasferimento dal buffer di palloni bicchieri, а attenzione particolare deve essere posta per evitare che gocce d&#39;acqua ghiacciata nelle soluzioni. Durante la manipolazione dei tessuti è opportuno sottolineare che l&#39;estrazione cuore deve essere effettuata nel più breve tempo possibile, dal momento che anche a breve tempo di ritardo tra la decapitazione dell&#39;animale e il raffreddamento del tessuto si tradurrebbe in mitocondri parzialmente disaccoppiato. Rapido raffreddamento e lavaggio accurato dei cuori rimosso è essenziale per ottenere la preparazione standard, privo di emoglobina e NADase eritrociti. Tripsina viene utilizzato per connettivo degradazione delle proteine ​​per aumentare la suscettibilità del tessuto per forza di taglio durante l&#39;omogeneizzazione. L&#39;esposizione prolungata del tessuto della proteasi deve essere evitata in quanto si traduce in mitocondri di qualità inferiore. Dopo centrifugazioni ad alta velocità le mura del provette devono essere pulite con la carta velina per rimuovere eventuali depositi di materiale grasso accumulato sulle pareti. Per la risospensione finale è meglio utilizzare un basso volume del buffer finale al fine di minimizzare la perdita di funzioni mitocondriali durante lo stoccaggio (da 150 a 200 ul di buffer per ogni cuore). Per gli studi del trasporto di cationi bivalenti non agenti chelanti devono essere presenti nella preparazione finale così mitocondri devono essere lavati più volte con EGTA-free medio e utilizzato entro prime ore dopo l&#39;isolamento.

preparation of highly coupled rat heart mitochondria

La funzione dei mitocondri nella generazione di cellulari di ATP nel processo di fosforilazione ossidativa è ampiamente riconosciuto. Negli ultimi decenni ci sono stati significativi progressi nella nostra comprensione delle funzioni delle altre mitocondri rispetto alla generazione di energia. Questi includono il loro ruolo nella apoptosi, in qualità di segnalazione organelli, lo sviluppo e l&#39;invecchiamento dei mammiferi e il loro contributo al coordinamento tra il metabolismo cellulare e la proliferazione cellulare. La nostra comprensione dei processi biologici modulata dai mitocondri si basa su metodi robusti per l&#39;isolamento e trattamento dei mitocondri intatti dai tessuti degli animali da laboratorio. Mitocondri di cuore di ratto è una delle preparazioni più comuni per gli studi passati e presenti del metabolismo cellulare tra cui studi su animali knock-out. Qui si descrive un metodo dettagliato per il rapido isolamento di mitocondri intatti con un alto grado di accoppiamento. Tale preparazione del cuore di ratto mitocondri è un oggetto ottimo per la ricerca funzionali e strutturali sulla bioenergetica cellulare, trasporto di biomolecole, studi di proteomica e analisi del DNA mitocondriale, proteine ​​e lipidi.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria at JoVE.com

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Descriviamo а protocollo per l&#39;isolamento di puro cuore di ratto altamente accoppiato mitocondri per studi funzionali o strutturali di bioenergetica cellulare, misure biofisica, proteomica o il DNA mitocondriale e analisi di lipidi.

Preparazione del Cuore Rat altamente Accoppiato mitocondri

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

preparation-of-highly-coupled-rat-heart-mitochondria

Research

JoVE Journal

Biology

22.7K Views.  University of Manchester. Descriviamo а protocollo per l'isolamento di puro cuore di ratto altamente accoppiato mitocondri per studi funzionali o strutturali di bioenergetica cellulare, misure biofisica, proteomica o il DNA mitocondriale e analisi di lipidi.

Video: Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

L&#39;impianto di ingegneria tessutale nel Cuore Rat

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

Ricerca

Biologia

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

Preparazione delle Culture del cervello di ratto aggregati per Neuron e Studi sullo Sviluppo Glia

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Cultura primario di miociti adulti Cuore Rat

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Purificazione dei mitocondri da cellule di lievito

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparazione di embrioni per la microscopia elettronica del Drosophila Tubo cuore embrionale

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

Preparazione dei tendini coda di topo per studi di biomeccanica e Mechanobiological

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantificare singolo microvasi Permeabilità in Isolata Blood-perfusione Rat Lung Preparazione

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.