Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health (AI050677, HD-051998, e GM103433), un Malcolm Feist cardiovascolare ricerca borsa di studio, e un americano comunione Heart Association predoctoral (10PRE4200007).

1. Preparazione di gelatina rivestite coprioggetto <ol><li> Posto lavata con acido coprioggetto (15 mm di diametro) in un piatto di plastica sterile 100 mm (es). Mettere 8-9 coprioggetti per piatto e fare in modo che non si tocchino tra loro o ai lati del piatto .. </li></ol> Nota: Coprivetrini, aghi e pinzette devono essere sterili per eliminare eventuali microrganismi contaminanti, nonché endotossine che influenzano le funzioni cellulari, compresa la motilità. <ol start="2"><li> Pesare la polvere di gelatina e risospendere la polvere in acqua deionizzata per ottenere una soluzione di gelatina con una concentrazione finale di 0,5 g/300 ml. Successivamente, la soluzione di gelatina deve essere sterilizzato. </li><li> Dispensare 2-3 gocce di gelatina (~ 100-150 ml) su ogni vetrino coprioggetto. </li></ol> Nota: Fare attenzione a non permettere la gelatina di toccare il piatto, altrimenti non sarà in grado di rimuovere i coprioggetti dal piatto. <ol start="4"&gt; <li> Cuocere la gelatina rivestite coprioggetto nel piatto 100 millimetri in un forno a 90 ° C per 10 min. </li><li> Togliere l&#39;eccesso di gelatina da pipettaggio gentile. </li><li> Essiccare i vetrini nel piatto 100 mm nel forno a 70 ° C per 45 min. </li><li> Una volta asciutto, rimuovere i coprioggetti dai piatto 100 millimetri con un ago sterile, privo di endotossine ago e pinzette (l&#39;ago viene utilizzato per spingere delicatamente il coprioggetto per renderla accessibile per le pinzette per rimuovere delicatamente). </li><li> Posizionare i singoli gelatina rivestite coprioggetto in pozzetti separati di un 24-ben piatto. </li></ol> 2. Preparazione di oro colloidali rivestite coprioggetto <ol><li> Pesare una quantità appropriata di acido chloroauric (triidrato tetrachloroauric acido; HAuCl 4 · 3H 2 O) e poi risospendere in acqua deionizzata sterile per preparare una soluzione finale di 14,5 mM (tossico). Preparare 1,5 ml di soluzione per 8-9 coprioggetti. </li></ol> Attenzione: acido chloroauric è hbracciata se ingerito, provoca ustioni della pelle e gravi lesioni oculari e può causare una reazione allergica cutanea. Tossico se ingerito. <ol start="2"><li> Pesare una quantità appropriata di citrato di sodio (trisodio diidrato 2-idrossipropano-1 ,2,3-tricarboxylate; Na 3 C 6 H 5 O 7) e poi risospendere la polvere in acqua deionizzata per ottenere una soluzione finale di 0,5%. Preparare 1 ml di soluzione per 8-9 coprioggetti. </li></ol> Attenzione: citrato di sodio può causare irritazione agli occhi e della pelle. Si può anche causare irritazione delle vie respiratorie e digestive. <ol start="3"><li> In una sterile, privo di endotossine becher combinano 1,5 ml di sterile 14.5 mm HAuCl soluzione 4 e 13.5 ml di acqua deionizzata sterile, il risultato dovrebbe produrre una soluzione debole giallo. I volumi di cui sopra consentiranno per 8-9 vetrini oro colloidale da effettuare. </li><li> Mentre continua agitazione, riscaldare la soluzione su una piastra calda finché inizia a bolio. </li></ol> Attenzione: Il riscaldamento della soluzione deve essere eseguita sotto cappa, come vapori possono essere nocivi e / o tossici. I vapori sono lacerazioni del tessuto delle mucose e delle vie respiratorie superiori. <ol start="5"><li> Togliere il becher dalla piastra. </li><li> In agitazione, aggiungere 0,7 ml della soluzione di citrato di sodio allo 0,5%. Il citato volume consentirà per 8-9 coprioggetti oro colloidale da effettuare. </li><li> Continuate a mescolare questa soluzione combinata per circa 2 min (Nota: il colore della soluzione cambierà gradualmente dal giallo tenue, per cancellare, al grigio, al viola, al viola intenso, prima di raggiungere un vino rosso o, preferibilmente, di colore ruggine) . Questo prodotto è la soluzione oro colloidale. </li><li> Raffreddare la soluzione di oro colloidale in una pipetta 10 ml per 1-2 min (per mantenere il livello gelatina sul coprioggetto da fusione quando la soluzione viene aggiunta oro colloidale) e poi aggiungere 1,0-2,0 ml del colloidal oro su ogni soluzione di gelatina rivestite coprioggetto precedentemente posto in un piatto da 24 pozzetti (es) (la quantità della soluzione oro colloidale che si aggiungono ai gelatina rivestite coprioggetto dipende da come le particelle d&#39;oro precipitato nella soluzione - vedi commenti qui sotto). </li></ol> Nota: Perché ci possono essere variazioni in termini di efficienza di precipitazione delle particelle d&#39;oro, si consiglia di aggiungere prima 0,5-1 ml della soluzione di oro colloidale ai gelatina rivestite coprioggetto e quindi posizionare il piatto da 24 pozzetti in incubatrice per 0,5 ore . Dopo questo periodo di incubazione, i coprioggetti devono essere controllati al microscopio ottico per la appropriata densità delle particelle d&#39;oro sui coprioggetti. Vedere Figura 1 per 20x immagini al microscopio di esempi di troppo bassa e troppo alta concentrazione di particelle d&#39;oro. Vedere Figura 2 per immagini al microscopio 40x di una concentrazione ideale di particelle d&#39;oro (almeno per l&#39;uso con monociti). L&#39;optdensità imal delle nanoparticelle di oro sul vetrino deve essere determinato sperimentalmente per ogni tipo cellulare utilizzato, come le caratteristiche delle diverse cellule detterà loro forza di movimento sui vetrini. Se la concentrazione di particelle d&#39;oro è insufficiente, aggiungere un ulteriore 0,5-1 ml della soluzione di oro colloidale alla gelatina rivestite coprioggetto. A seconda della dimensione della cella, la concentrazione appropriata delle particelle d&#39;oro può variare e, quindi, in ultima analisi dipende dalle dimensioni della cella esaminato per motilità. Per esempio, con monociti umani in piccole celle di dimensione (~ 10-20 um 28), una maggiore concentrazione di particelle d&#39;oro è stato richiesto nelle nostre analisi. La distribuzione appropriata di nanoparticelle di oro fornisce il ricercatore con la capacità di distinguere facilmente ed efficientemente i bordi delle tracce cellulari. Una concentrazione di particelle d&#39;oro che è troppo alto ostacola la capacità delle cellule di muoversi e quindi di misurare accuratamenteloro motilità, mentre una concentrazione di particelle d&#39;oro che è troppo bassa limita la capacità di delineare quelli una traccia precisa della motilità. Nota importante: se la sintesi di nanoparticelle di oro è problematico, nanoparticelle d&#39;oro sintetizzati sono disponibili in commercio nei formati da 5 nm a 400 nm. Inoltre, microsfere fluorescenti sono state utilizzate in studi di motilità cellulare 29. Tuttavia, l&#39;uso di queste microsfere richiede un microscopio fluorescente per l&#39;analisi della migrazione cellulare. <ol start="9"><li> Posizionare il 24 pozzetti piatto con oro colloidale ricoperte di vetrini in un incubatore a 37 ° C ed incubare da 1 ora a tutta la notte. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare / rimuovere oro non legato immergendo i coprioggetti (3x) in soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS, pH 7,4). </li><li> Posizionare questi colloidali d&#39;oro rivestite coprioggetto in un ambiente pulito 12 e piatto (i) contenente PBS. </li><li> Conservare queste coprioggetti a 4 ° C fino al momentoutilizzare (parafilm la piastra prima di mettere in frigorifero). </li></ol> Nota importante: Tenere sempre le colloidali d&#39;oro rivestite coprioggetto in qualche tipo di liquido / media come le particelle d&#39;oro possono sfaldarsi dalle coprioggetti se lasciati asciugare. I coprioggetti oro colloidale deve essere utilizzato entro 2-3 mesi dalla data in cui sono state formulate. Controllo qualità: In un singolo saggio phagokinetic motilità pista, è fondamentale utilizzare coprioggetti caratterizzati da una concentrazione simile di particelle d&#39;oro. Questo punto semplice consentirà le differenze quantitative motilità cellulare tra campioni di essere unicamente a causa della natura del trattamento e non le proprietà fisiche dei colloidali oro rivestite coprioggetto. Favoriamo con coprioggetto solo fatte al tempo stesso in singoli esperimenti, sebbene abbiamo dimostrato che finché la densità delle nanoparticelle di oro sono uguali, l&#39;uso di coprioggettoda diverse preparazioni è appropriato. 3. Analisi della motilità cellulare <ol><li> Posizionare i colloidali d&#39;oro rivestite coprioggetto in un supporto appropriato cellulari per le celle di interesse. </li><li> Trasferire le cellule opportunamente trattate sulle colloidali d&#39;oro rivestite coprioggetto posti in un piatto da 24 pozzetti (es) </li></ol> Nota: Il numero di celle trasferite al singolo pozzo deve essere determinato per ciascun tipo di cella studiata. Idealmente, le cellule devono essere distribuiti sulla colloidale oro rivestite coprioggetto, che a sua volta consente per l&#39;analisi statistica delle tracce solo creati da una singola cella. Se le cellule vengono piastrate ad una concentrazione troppo alta, diventa altamente probabile che tracce sovrapposizione di più celle si vedrà. Tracce sovrapposte non può essere quantificato con precisione e, quindi, non possono essere prese in considerazione nelle analisi finali del movimento delle cellule testate. Sovrapposizione tracce come risultato diil coinvolgimento di più celle sono di solito facilmente osservare, come fusi o incrociate brani (nel campo di analisi) in cui due o più celle possono essere osservati nella stessa area contigua cancellata. <ol start="3"><li> Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2 per 24 ore (o per qualsiasi momento adatto, ad esempio, abbiamo analizzato la motilità dei monociti tra 6 ore e 24 ore le cellule post-trattamento ed endoteliali a 12 ore dopo il trattamento). La tempistica ottimale per determinare e misurare la motilità cellulare varierà con il tipo di cella studiata e, quindi deve essere determinato sperimentalmente per ogni tipo cellulare (un buon punto di partenza, tuttavia, è 6-12 ore dopo il trattamento). </li></ol> Nota: Se sperimentali oro colloidali rivestite coprioggetto devono essere immagazzinati e / o analizzati in un secondo tempo, le cellule e nanoparticelle d&#39;oro devono essere fissati sui vetrini. Per compiere questo passo fissazione; seguente Passaggio 3.3, primo lavaggio coprioggetti accuratamente 2 volte con 1xPBS (immersione del coprioggetti è preferibile, come la rimozione di nanoparticelle di oro da coprioggetto deve essere evitata), quindi utilizzare un metodo standard di fissazione delle cellule, quali incubazione a temperatura ambiente con paraformaldeide al 3%. Dopo 15 min di incubazione, la paraformaldeide 3% deve essere rimosso e lavato con cura i coprioggetti 3 volte con PBS 1x. I coprioggetti fissi possono essere conservati in frigorifero. <ol start="4"><li> Utilizzando un microscopio ottico, catturare immagini delle tracce create da una singola cellula in movimento (Nota: L&#39;ingrandimento utilizzato per fotografare tracce cellulari certamente variare a seconda del tipo di cellula in esame). Esempi di tracce cellulari creati da cellule non mobili e mobili su oro colloidale rivestite coprioggetto sono mostrati nella Figura 2. </li></ol> Nota: Le nanoparticelle di oro del formato usato nel saggio phagokinetic motilità traccia è stato trovato per essere completamente non tossico per le cellule 30. Se necessario, La vitalità delle cellule esaminate può essere valutata mediante colorazione con tripan blu o esaminati per altri marcatori di vitalità cellulare. Si dovrebbe tener conto della necessità di fissaggio, tipo di fissaggio, ecc, se questa fase deve essere intrapreso. <ol start="5"><li> Utilizzando il software liberamente disponibile, come software ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) o NIH Image ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/</a> ), sia sviluppato al National Institutes of Health, o ImageTool ( <a href="http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html" target="_blank">http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html</a> ), sviluppato presso l&#39;Università del Texas Health Science Center a San Antonio, la superficie media (in unità arbitrarie) di oro colloidale autorizzata dalla 10-20 o più celle (per campione) viene determinata per ciascun braccio sperimentale dalle immagini catturate. Le statistiche possono quindi essere eseguito su tha raccolto i risultati. Ad esempio, i risultati possono essere rappresentati come media ± l&#39;errore standard dei mezzi (SEM) con test t di Student eseguiti, e un valore di p &lt;0.05 utilizzati come misura di significatività statistica tra i campioni. Figure 3 e 4 passaggi mostrano nel analisi dell&#39;area di oro colloidale eliminato dalla cellula. </li></ol>

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Biol. 294, 23-29 (2005).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Brooks, D. M., Brooks, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Invasion+Assay+Using+Matrigel(R).">In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R).</a> Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).</li><li>Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+DAPK+inhibits+cell+motility+by+blocking+the+integrin-mediated+polarity+pathway.">The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway.</a> J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).</li><li>Benazeraf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+cell+motility+gradient+downstream+of+FGF+controls+elongation+of+an+amniote+embryo.">A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo.</a> Nature. 466, 248-252 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il saggio di motilità phagokinetic brano presentato in questo articolo è un metodo semplice e molto efficace per l&#39;analisi quantitativa della migrazione cellulare. Perché più tipi di cellule possono essere analizzati 9-17, questo metodo ha il potenziale utilizzo ampio diverse discipline. L&#39;uso di oro colloidale rivestite coprioggetto consente la misurazione di una zona traccia cancellata da una cellula in movimento. Il dosaggio può misurare l&#39;effetto di stimoli differenti fattori di crescita ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Coprioggetto di vetro (15 mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-83 </td><td></td></tr><tr><td> Gelatina 300 Bloom </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-1890 </td><td></td></tr><tr><td> Acid triidrato Tetrachloroauric </td><td> Fisher Chemical </td><td> G54-1 </td><td> 14,5 mM (una soluzione di lavorazione finale) </td></tr><tr><td> Citrato di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP327-500 </td><td> 0,5% (soluzione di lavoro finale) </td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Fisher Scientific </td><td> O4042 </td><td> 3% (una soluzione di lavorazione finale) </td></tr><tr><td> 100 millimetri tessuto piatto Cultura </td><td> Sarstedt </td><td> 83,1802 </td><td></td></tr><tr><td> 12-pozzetti </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-29 </td><td></td></tr><tr><td> Piastre da 24 pozzetti </td><td> Fisher Scientific </td><td> 07-200-84 </td><td></td></tr><tr><td> Techne Forno Hybridiser HB-1D </td><td> LabPlanet </td><td> 2040500 </td><td> Il forno di laboratorio standard sarà sufficiente </td></tr><tr><td> 10 ml Pipette sierologiche </td><td> Sarstedt </td><td> 86.1254.001 </td><td></td></tr><tr><td> Pipettare-Aid Filler / Dispenser </td><td> Drummond </td><td> 13-681-15 </td><td></td></tr><tr><td> P200 singolo manuale dei canali Pipette </td><td> Rainin </td><td> PR-200 </td><td></td></tr><tr><td> 200 ml Barrier Tips </td><td> CLP </td><td> BT200 </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ software </td><td> <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">htt</a>p :/ / rsb.info.nih.gov / IJ / </td><td></td><td> Licenza: Public Domain </td></tr><tr><td> Nikon Eclipse TE300 con un CoolSNAPfx fotometrici in bianco e nero a 12 bit CCD </td><td> Nikon </td><td></td><td> Fuori, La specifica più simile ha Nikon Eclipse Ti, ma una estremità inferiore Nikon 80i sarà adatto pure. Altri marchi forniscono anche microscopi comparabili. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Nota: I reagenti e le attrezzature elencati di seguito sono stati utilizzati da noi nei nostri studi diversi. Altri materiali di consumo, fornitori, reagenti e le apparecchiature possono essere utilizzati, purché abbiano specifiche simili. </td></tr></tbody></table>

a quantitative evaluation of cell migration by the phagokinetic track motility assay

Motilità cellulare è un processo biologico importante per entrambi gli organismi unicellulari e pluricellulari. È essenziale per il movimento di organismi unicellulari verso una fonte di nutrienti o lontano da condizioni inadatte, nonché negli organismi multicellulari per lo sviluppo del tessuto, sorveglianza immunitaria e guarigione delle ferite, solo per citarne alcuni ruoli 1,2,3. La deregolamentazione di questo processo può portare a gravi malattie neurologiche, cardiovascolari e immunologiche, così come aggravato la formazione di tumori e diffondere 4,5. Molecolarmente, polimerizzazione di actina e riciclaggio recettore hanno dimostrato di giocare un ruolo importante nella creazione di estensioni cellulari (lamellipodia), che guidano il movimento in avanti della cella 6,7,8. Tuttavia, molte domande circa la migrazione delle cellule biologiche rimangono senza risposta. Il ruolo centrale per la motilità cellulare in salute e malattia sottolinea l&#39;importanza di comprendere il mec specificohanisms coinvolti in questo processo e rende metodi accurati per valutare la motilità cellulare particolarmente importante. Microscopi sono di solito utilizzati per visualizzare il movimento delle cellule. Tuttavia, le cellule muovono piuttosto lentamente, rendendo la misurazione quantitativa della migrazione delle cellule un processo di consumo di risorse che richiedono costose telecamere e software per creare quantitativi e ritardi film di cellule mobili. Pertanto, la capacità di eseguire una misurazione quantitativa della migrazione cellulare che è conveniente, non laborioso, e che utilizza attrezzature comuni laboratorio è una grande necessità di molti ricercatori. Il dosaggio phagokinetic motilità traccia utilizza la capacità di una cellula in movimento per eliminare particelle d&#39;oro dal suo percorso per creare una traccia misurabile su una colloidale oro rivestite coprioggetto 9,10. Con l&#39;uso di software liberamente disponibile, tracce multiple possono essere valutati per ogni trattamento di compiere esigenze statistiche. Il saggio può essere utilizzato per valutaremotilità di molti tipi di cellule, come le cellule tumorali 11,12, fibroblasti 9 13, neutrofili, cellule muscolari scheletriche, cheratinociti 14 15, 16 trofoblasto, cellule endoteliali e monociti 17, 10,18-22. Il protocollo prevede la creazione di vetrini rivestiti con nanoparticelle di oro (Au °) che sono generati da una riduzione di acido chloroauric (Au 3 +) con citrato di sodio. Questo metodo è stato sviluppato da Turkevich et al. Nel 1951 23 e poi migliorata nel 1970 da Frens et al. 24,25. Come risultato di questa fase la riduzione chimica, particelle di oro (10-20 nm di diametro) precipitare dalla miscela di reazione e può essere applicato a vetrini, che sono quindi pronto per l&#39;uso nelle analisi migrazione cellulare 9,26,27. In generale, il dosaggio phagokinetic motilità traccia è una misura veloce, facile e quantitativa della motilità cellulare. Inoltre,può essere utilizzato come un semplice saggio ad alta prestazione, per l&#39;uso con i tipi di cellule che non sono suscettibili di e ritardi imaging, nonché altri usi a seconda delle esigenze del ricercatore. Insieme, la capacità di misurare quantitativamente la motilità cellulare di tipi di cellule senza la necessità di costosi microscopi e software, insieme con l&#39;uso di attrezzature di laboratorio e prodotti chimici comuni, rendono il phagokinetic motilità saggio traccia una scelta solida per gli scienziati con un interesse a comprendere cellulare motilità.

Viene mostrato un esempio di immagini prese al microscopio ottico mostra un&#39;area traccia cancellata da una singola cellula (un monocita dai nostri esperimenti è mostrato in Figura 2). Non mobili cellule creano caratteristica piccola, ovale o di forma circolare intorno si tratti indicanti un basso livello basale di movimento per queste cellule non stimolate (Figure 2A e 2B). In contrasto, cellule altamente motili [nel nostro sistema, citomegalovirus umano (HCMV) cellule infettate] s...

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A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Il saggio traccia phagokinetic motilità è un metodo utilizzato per valutare il movimento delle cellule. Specificamente, il saggio misura chemochinesi (motilità cellulare casuale) nel tempo in modo quantitativo. Il saggio sfrutta la capacità delle cellule di creare una traccia misurabile della loro movimento oro colloidali rivestite coprioggetto.

Una valutazione quantitativa della migrazione cellulare con il Test Phagokinetic motilità Traccia

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.8K Views.  Louisiana State University Health Sciences Center. Il saggio traccia phagokinetic motilità è un metodo utilizzato per valutare il movimento delle cellule. Specificamente, il saggio misura chemochinesi (motilità cellulare casuale) nel tempo in modo quantitativo. Il saggio sfrutta la capacità delle cellule di creare una traccia misurabile della loro movimento oro colloidali rivestite coprioggetto.

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Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

La valutazione quantitativa delle cellule immunitarie nel tessuto danneggiato del midollo spinale mediante citometria di flusso: un nuovo uso per un metodo di purificazione cellulare

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Analisi quantitativa di tutti influenza di tipo A Hemagglutinins e neuraminidasi virale utilizzando anticorpi Universale di saggi semplice Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Il rilevamento del virus infettivo da Campo-zanzare raccolte mediante test coltura cellulare Vero

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

Monitoraggio migrazione delle cellule dendritiche usando<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Test di cocultura per valutare la migrazione transeteliale neutrofila indotta da agenti patogeni

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

La valutazione quantitativa della migrazione dei neutrofili Umana Attraverso una coltivate vescica Epitelio

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

Valutazione conformazionale di HIV-1 trimeric busta glicoproteine ​​Utilizzando una base di Cell-ELISA Saggio

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR test per la determinazione di espressione Profili di tipo I e III interferone sottotipi

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...