This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany

1 Preparazione della migrazione Chambers <ol><li> Preparare una gelatina di cera di paraffina / petrolio (1: 1) mix e calore finché il composto si sarà sciolto. Utilizzando un pennello e disegnare 2-3 strati della gelatina paraffina / petrolio (1: 1) mescolare a metà del vetrino in base alle figure 1B-1D. NOTA: Stiamo usando vetrini comuni (76 x 26 x 1,0-1,5 mm (W / D / H)) </li><li> Applicare la cera di paraffina / petrolio mix gelatina sciolta rapidamente sul vetrino per evitare la solidificazione durante il disegno. Assicurarsi che lo strato di gelatina di cera di paraffina / petrolio è di circa 2-2,5 cm di lunghezza e 0,3-0,5 cm di larghezza. Lo spessore dello strato di gelatina paraffina / petrolio dovrebbe essere di circa 0,1-0,15 cm. </li><li> Aggiungere un coprioggetto alla cera di paraffina solidificata / petrolio mix gelatina e sigillare con 2-3 strati di paraffina mix gelatina di cera / di petrolio (Figure 1E, 1F). Utilizzare 4-8 camere di migrazione per un esperimento di migrazione cellulare comune. Camere Luogo di migrazione in per una posizione eretta in un rack. </li></ol> 2 Preparazione del collagene Sospensione Mix cellulare <ol><li> Harvest (ad esempio, con il 0,25% tripsina / EDTA) e contare le cellule di interesse. Risospendere le cellule in mezzi completi contenenti siero fetale bovino (FCS), antibiotici e integratori consigliato. Preparare 4-8 1.5 ml provette di reazione e 20 microlitri di sospensione cellulare contenente 4-6 x 10 4 cellule (il numero totale di cellule dipende dal tipo di cellula da analizzare) e riempire fino a 50 microlitri con completo supporto. NOTA: i composti supplementari (ad esempio, fattori di crescita, chemochine, inibitori, ecc) vengono aggiunti alla sospensione cellulare. Usare appropriate soluzioni madri tale che il volume finale della sospensione cellulare non supera i 50 ml. </li><li> Preparare un importo totale di 452 microlitri di sospensione collagene finale per quattro esperimenti di migrazione delle cellule. Aggiungere 50 microlitri 10x MEM (pH 5,1-5,5) e 27 ml di 7,5% soluzione di bicarbonato di sodio (pH 9,0-9,5) Per un tubo di reazione da 1,5 ml e mescolare accuratamente. Osservare il colore turno soluzione dal giallo-arancio al porpora intenso (pH 9,0-9,5). Aggiungi sospensione collagene 375 microlitri di liquido al / soluzione di bicarbonato di sodio 10x MEM e mescolare accuratamente. Il pH della sospensione collagene finale dovrebbe essere di circa 7,5 (indicato da una luce di colore viola). NOTA: Controllare il pH della soluzione di bicarbonato di sodio al 7,5%. Se il pH è circa 7,5 posto la soluzione di bicarbonato di sodio con un coperchio aperto in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2) di essere saturo di CO 2 e aumentare il pH (circa 9,0-9,5). Il pH della miscela di collagene sospensione cellulare è fondamentale per la stabilità della rete di collagene. Se è troppo bassa del reticolo di collagene crollerà durante l&#39;esperimento migrazione cellulare. NOTA: Per questo protocollo, utilizzare il collagene liquido (pH 1,9-2,2) dal posteriore bovina (2,9-3,3 mg / ml di collagene; il 95% collagene di tipo I, 5% collagene di tipo IV). Esempi di ulteriore collagene protocolli di preparazione reticolo utilizzandocollagene di tipo I da altre fonti, come ad esempio suini o di ratto, sono indicati in 32,33. Non modificare i volumi delle soluzioni utilizzate in quanto ciò altera la concentrazione di collagene finale di 1,67 mg / ml del reticolo. Una concentrazione di collagene superiore o inferiore ha un impatto sulla densità delle fibre di collagene e la distanza media tra di loro in concomitanza con le cellule comportamento migratorio 34. </li><li> Aggiungere 100 ml di sospensione finale di collagene per sospensione cellulare 50 microlitri e mescolare thoroughly.The sospensione collagene finale (1,67 mg / ml di collagene) è leggermente viscoso. Per trasferire l&#39;importo corretto (100 ml), pipetta la soluzione di collagene finale una volta su e giù prima di trasferirlo alla sospensione cellulare. NOTA: Una volta che la miscela di cellule di sospensione collagene è combinato con la soluzione di bicarbonato / sodio 10x MEM e il valore del pH è cambiato a 7,5 le fibre di collagene cominciano immediatamente a polimerizzare. </li><li> Trasferire la miscela di cellule di sospensione di collagene finale da thprovette di reazione di e alle camere di migrazione. Battere delicatamente la camera di migrazione per distribuire equamente il mix di cellule di sospensione di collagene sul fondo della camera di migrazione (Figura 1H). Collocare le camere migrazione in posizione verticale in un rack e incubare per circa 30 min (37 ° C, 5% CO 2) per consentire la polimerizzazione delle fibre di collagene. </li><li> Si noti che il collagene reticolo polimerizzato è leggermente torbida, ma ancora in fase di luce di colore viola. Riempire le camere di migrazione con terreno completo o mezzo completo con supplementi di interesse e sigillare la camera di migrazione con gelatina di cera di paraffina / miscela di petrolio (Figure 1I, 1J). </li></ol> 3 Registrazione e analisi della migrazione delle cellule Questa sezione descrive la registrazione di migrazione delle cellule mediante microscopia time-lapse video e l&#39;analisi della migrazione delle cellule dal monitoraggio delle cellule manuale. <ol><li> Accendere il microscopio e la hea palco microscopioter. Regolare la temperatura a 37 ° C. Utilizzare un obiettivo 10X. Mettere camera di migrazione sotto un microscopio e mettere a fuoco circa 50 cellule o più nel campo visivo. </li><li> Migrazione cellulare Record in modalità time-lapse utilizzando un&#39;applicazione software di video sorveglianza multi-camera. Salvare i filmati di migrazione cellulare in un formato appropriato, ad esempio, &quot;* avi&quot; o &quot;* mov&quot;. Collegare i file video di migrazione delle cellule di un database contenente informazioni di supporto, come il tipo di cellula e condizioni sperimentali. NOTA: Stiamo registrando linfociti e HSPCs per un massimo di 2 ore utilizzando un fattore di time-lapse di 1:80, il che significa che 0,75 sec in time-lapse è pari a 1 min in tempo reale. Le cellule tumorali sono cellule in movimento lento e sono quindi registrate per almeno 16 ore utilizzando un fattore di time-lapse di 1: 1.800 (0,5 sec in time-lapse è pari a 15 minuti in tempo reale). </li><li> Analizzare i film migrazione cellulare utilizzando un&#39;applicazione software di monitoraggio cella appropriata, come i plugin software ImageJ(Una visione d&#39;insieme è dato in 18). Per un&#39;analisi imparziale è di cruciale importanza che le cellule saranno selezionati a caso senza la conoscenza se le cellule sono migratrici attivo o meno. NOTA: Stiamo usando un software di auto-sviluppato per tenere traccia manualmente i percorsi di almeno 30 cellule per sperimentare seguendo le cellule si muovono con precisione con il cursore del mouse (che è posizionato al nucleo). Durante il monitoraggio, xy coordinate delle celle cingolati sono determinati automaticamente in base alla modalità time-lapse utilizzato. Per linfociti / HSPCs xy coordinate sono determinate ogni 0,75 secondi (pari a 1 minuto in tempo reale), mentre per le cellule tumorali xy coordinate sono determinate ogni 0,5 secondi (pari a 15 minuti in tempo reale). </li><li> Determinare un totale di 60 xy coordinate per cella per un tipico esperimento migrazione cellulare. Questo è uguale a 1 ora in tempo reale per i linfociti / HSPCs e 15 ore in tempo reale per le cellule tumorali. A &quot;,&quot; indica che una cella non è spostato tra two punti di tempo, mentre un &quot;valore numerico&quot; indica la distanza in &quot;pixel&quot; una cellula è spostato tra 2 punti temporali (Figura 2A). NOTA: il monitoraggio delle cellule manuale richiede esperienza. In particolare, le cellule migrano veloce sono difficili da rintracciare e ogni tipo di cellula mostrano un comportamento migratorio netto che potrebbe essere innescato da fattori integrati. In caso di divisione cellulare, mentre il monitoraggio, scegliere a caso una cellula figlia per continuare il monitoraggio. Le cellule che migrano fuori del campo di vista o muoiono durante il monitoraggio non sono trascurati, ma sono considerati per l&#39;analisi. </li></ol> Analisi 4. Dati <ol><li> Analizzare i dati di tracciamento cellulare utilizzando un&#39;applicazione software appropriato, ad esempio, un foglio di calcolo. <ol><li> Analizzare i dati di monitoraggio delle cellule copiando la cella di rilevamento dati grezzi (Figura 2A), in un modello di foglio di calcolo auto-progettato. Moltiplicare somma dei &quot;valori numerici&quot;, che rappresentala distanza totale di una cella ha migrato con un fattore di correzione per convertire i &quot;pixel&quot; in &quot;micron&quot;. </li><li> Determinare due parametri di migrazione cellulare: l&#39;attività motoria (che equivale al tasso di migrazione) e il tempo di movimento attivo (Figure 2C, 2D). </li><li> Identificare le cellule che sono migrate minore di 25 micron (livello di soglia per ridurre il numero di cellule falsi positivi) come cellule non-movimento. Sostituire &quot;valori numerici&quot; di queste cellule con &quot;,&quot;. NOTA: Il parametro &quot;attività motoria&quot; (o tasso di migrazione) rappresenta la percentuale di cellule della popolazione di cellule cingolato che si sono trasferiti tra due punti di tempo (Figura 2D). Un &quot;valore numerico&quot; è definito come una cellula in movimento, mentre &quot;,&quot; è definito come una cella non in movimento. Il parametro &quot;tempo di movimento attivo&quot; (attiva) rappresenta la percentuale del tempo totale di una cella è migrato nel rimento per il periodo di tempo del periodo di osservazione (Figura 2C). Un &quot;valore numerico&quot; indica che una cellula è spostato, mentre &quot;,&quot; indica che una cella non è mossa. Questo parametro viene inoltre utilizzato per determinare il numero di cellule che non si è mosso. </li></ol></li><li> Calcolare la significatività statistica e dei dati di migrazione delle cellule di visualizzazione. <ol><li> Calcola significatività statistica dell&#39;attività locomotoria medio della cellule (tasso di migrazione) utilizzando il test di Mann-Whitney. Consideriamo p-value &lt;0.05 come significativo. </li><li> Visualizzare l&#39;attività locomotoria medio di cellule come xy-diagramma, schema BoxPlot, o come un diagramma grafico a barre. Visualizzare i dati basati su celle singole, come il tempo di movimento attivo o la velocità, come un diagramma grafico a barre o un istogramma. NOTA: Se l&#39;applicazione software foglio di calcolo scelto non contiene una tabella o un grafico istogramma strumento BoxPlot una ricerca online deve essere effettuata per la ricerca di idonei tutorials. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

La capacità di migrare è una caratteristica delle cellule tumorali 4. Senza la possibilità di staccarsi dal tumore primario e migrare attraverso le circostanti cellule tumorali tessuto connettivo non sarà in grado di seminare lesioni secondarie, che sono la principale causa di morte di quasi tutti i pazienti affetti da cancro. A causa di questa relazione molti studi si stanno concentrando sulla migrazione delle cellule del cancro. Lo scopo di questi studi è l&#39;identificazione di nuove molecole target ...

Come la fusione cellulare (per una rassegna cfr 1,2) migrazione delle cellule è un altro fenomeno biologico che è coinvolto in una pletora di processi fisiologici, tra cui lo sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite e le risposte immunitarie (per una rassegna vedi 3). Tuttavia, la capacità di migrare è anche un prerequisito per le cellule tumorali a metastatizzare (per una rassegna vedi 3,4). Migrazione delle cellule è un complesso, non ancora pienamente compreso processo che è diretto dal gioco delle diverse vie di trasduzione del segnale iniziata da diversi ligando (ad esempio, citochine, chemochine, fattori di crescita, ormoni, componenti della matrice extracellulare) del recettore (ad esempio, tirosin-chinasi del recettore, recettori per le chemochine, integrine) interazioni 5 in ultima analisi, che causano la riorganizzazione del citoscheletro di actina concomitante con de- e rimontaggio di complessi di adesione focale e integrina-mediata segnalazione 6. in vitro e in vivo test di migrazione delle cellule sono stati sviluppati negli ultimi decenni, tra cui il saggio di Boyden camera / transwell 7, scratch test / guarigione della ferita test 8-10, tridimensionale ( 3D) matrice di collagene migrazione dosaggio 11, nonché l&#39;imaging intravitale / microscopia (per una rassegna vedi 12). Ciascuno di questi saggi di migrazione cellulare ha pro e contro, ad esempio, in materia di costi e necessità di attrezzature, il trattamento o l&#39;affidabilità dei dati ottenuti. Sia la camera di Boyden / transwell test e il test graffio / dosaggio guarigione della ferita sono facili, a basso costo e saggi ben sviluppati per misurare la migrazione delle cellule in vitro 7-10. Nella camera di Boyden / transwell cellule test vengono seminate sulla cima di un inserto contenente pori (circa 8 micron di diametro) - il cosiddetto vano superiore 7. Opzionale, l&#39;inserto può essere rivestito con m extracellularecomponenti ATRIX, ad esempio, la fibronectina, collagene, ecc, per simulare un ambiente più fisiologico. Allo stesso modo, le cellule endoteliali possono essere coltivate sulla parte superiore dell&#39;inserto, imitando in tal modo una barriera di cellule endoteliali 13. Quelle cellule che sono passati attraverso i pori durante un intervallo di tempo definito nel vano inferiore ospitare media e integratori, come i fattori di crescita e chemochine, sono usati come-out lettura di quantificare la migrazione cellulare (o stravaso). Nel saggio graffio / guarigione cellule test ferite vengono seminate in piastre e sono coltivate a confluenza 10. In dipendenza delle piastre di regolazione sperimentali potrebbe essere pre-rivestito con componenti della matrice extracellulare, quali fibronectina. Dopo aver creato un graffio / ferita raschiando le singole cellule monostrato cellulare da ogni lato del graffio / ferita può migrare nello spazio vuoto, riempimento / guarigione è 10 quindi. La distanza tra i due lati del graffio / ferite è determinatain dipendenza del tempo ed è utilizzato come un out lettura per l&#39;attività migratoria delle cellule 10. Tuttavia, per discriminare tra proliferazione cellulare (che potrebbe anche tradursi in riempimento / guarigione del graffio / ferita) e la migrazione cellulare si consiglia di combinare l&#39;analisi con microscopio video time-lapse e di singola cellula di monitoraggio 10. Tuttavia, sia la camera di Boyden / transwell test e scratch test / guarigione della ferita test, sono piuttosto imperfetto, concernente un ambiente cellulare fisiologico-like. Nella camera di Boyden / cellule dosaggio transwell devono migrare attraverso un poro di plastica, mentre nel scratch test / guarigione della ferita cellule del test vengono seminate su un piatto di plastica bidimensionale pre-rivestito. Allo stesso modo, è ben noto che il comportamento migratorio differisce marcatamente tra un ambiente bidimensionale e 3D 3. Per esempio, aderenze tridimensionale a matrice di fibroblasti differiscono da adesioni focali e fibrillari caratterizzati su duesubstrati -dimensionale nel loro contenuto di α5β1 e integrine αvβ3, paxillina, altri componenti del citoscheletro, e la fosforilazione della tirosina chinasi di adesione focale 14. Allo stesso modo, le cellule incorporati all&#39;interno di un ambiente 3D visualizzate anche un comportamento migratorio alterato 15. Così per analizzare la migrazione cellulare più accuratamente un saggio di migrazione è raccomandato consentendo di misurare la migrazione di cellule singole all&#39;interno di un ambiente fisiologico o fisiologico simile 3D. Imaging intravitale / microscopia è il gold-standard per misurare la migrazione delle cellule all&#39;interno di un contesto fisiologico 3D. Questo non appartiene solo alle interazioni matrice extracellulare delle cellule, ma anche per le interazioni tra diversi tipi di cellule, come le cellule tumorali e le cellule endoteliali durante stravaso 16 o il traffico dei linfociti nel linfonodo 17, che, ad oggi, è possibile grazie al miglioramento delle tecniche di microscopia a fluorescenza, come 2-fotonemicroscopio confocale a scansione laser, l&#39;uso di coloranti fluorescenti vitali e ceppi di topi transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti derivati ​​12,16,17. Inoltre, l&#39;imaging intravitale / microscopia può essere combinato con il monitoraggio delle cellule manuale e automatica 18. Tuttavia, a causa della necessità di un 2-fotone microscopio confocale a scansione laser e animali (e appropriati modelli animali transgenici) intravitale immagini / microscopia è una tecnica piuttosto intenso costi. Per superare le limitazioni della camera di Boyden / transwell test e il test di guarigione scratch test / ferita e per analizzare la migrazione di diversi tipi di cellule all&#39;interno di un ambiente 3D 3D matrice di collagene test di migrazione è stato sviluppato 11,19. In tal modo, le cellule che migrano sono incorporate all&#39;interno di una rete in fibra di collagene 3D, che più somiglia alla situazione in vivo. Congiuntamente, a causa di time-lapse microscopia video di migrazione delle cellule reale si misura permettendo determinazione di diversi parametri di migrazione e loro alterazioni in risposta a fattori pro-migratori o inibitori. Vari tipi di cellule potrebbero essere analizzati con questa tecnica, compresi i linfociti e leucociti 11,20, staminali emopoietiche / progenitrici 21-24, e le cellule tumorali 5,25-29. Oltre alle cellule singole anche cellulare cluster o sferoidi possono essere incorporati all&#39;interno della concomitante matrice di collagene con analisi della emigrazione di singole cellule dal cluster di cellule / sferoide nel collagene reticolo 30,31. Questo protocollo presenta una panoramica su una tecnica semplice, ma potente per analizzare il comportamento migratorio dei diversi tipi di cellule all&#39;interno di un ambiente 3D - un metodo in vitro ottenendo dei risultati che sono vicine alla situazione in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Leica DM IL inverted microscope</td>
			<td style="width:192px;">Leica, Wetzlar, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Microscope stage heater</td>
			<td style="width:192px;">Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">JVC C1431 video camera</td>
			<td style="width:192px;">JVC, Bad Vilbel, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Axis 241Q video server</td>
			<td style="width:192px;">Axis communication GmbH, Ismaning, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Mac G5 Computer</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">iMac</td>
			<td style="width:192px;">Apple Macintosh</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">FileMaker Pro</td>
			<td style="width:192px;">FileMaker GmbH, Unterschlei&#223;heim, Germany</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Multi-camera video surveillance software(Security Spy)</td>
			<td style="width:192px;">Bensoftware, London, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Runtime Revolution Media 2.9.0</td>
			<td style="width:192px;">RunRev Ltd., Edinburgh, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Paraffin</td>
			<td style="width:192px;">Applichem GmbH, Darmstadt, Germany</td>
			<td style="width:119px;">A4264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:244px;">Petrolatum jelly</td>
			<td style="width:192px;">local drug store</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">Purecol (liquid collagen)</td>
			<td style="width:192px;">Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>contains 2.9-3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">10x MEM</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">M0275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">7.5% Sodium Bicarbonate solution</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">S8761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">EGF</td>
			<td style="width:192px;">Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td>
			<td style="width:119px;">E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:244px;">U73122</td>
			<td style="width:192px;">Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td>
			<td align="right" style="width:119px;">662035</td>
			<td>dissolve first in CHCL3; reconstitute in DMSO just prior to use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix

La capacità di migrare è un segno distintivo di vari tipi di cellule e svolge un ruolo fondamentale in numerosi processi fisiologici, tra cui lo sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite, e le risposte immunitarie. Tuttavia, la migrazione cellulare è anche un meccanismo chiave nel cancro consentire queste cellule tumorali a staccarsi dal tumore primario per avviare la diffusione metastatica. All&#39;interno di questi ultimi anni sono stati sviluppati vari metodi di migrazione delle cellule per analizzare il comportamento migratorio dei diversi tipi di cellule. Poiché il comportamento locomotorio di cellule differisce notevolmente tra un bidimensionale (2D) e tridimensionali (3D) ambiente si può presumere che l&#39;analisi della migrazione delle cellule che sono incorporati in un ambiente 3D produrrebbe nella migrazione cellulare più significativo dati. Il vantaggio della matrice di collagene 3D dosaggio migrazione descritto è che le cellule sono incorporate all&#39;interno di una rete fisiologica 3D di fibre di collagene che rappresentano il principale componente della matrice extracellulare. A causa ditime-lapse videomicroscopia migrazione cellulare reale viene misurata permettendo la determinazione di diversi parametri di migrazione e loro alterazioni in risposta a fattori pro-migratori o inibitori. Vari tipi di cellule potrebbero essere analizzati con questa tecnica, tra cui linfociti / leucociti, cellule staminali e cellule tumorali. Allo stesso modo, anche i gruppi di cellule o sferoidi possono essere incorporati all&#39;interno della concomitante matrice di collagene con analisi della emigrazione di singole cellule dal cluster di cellule / sferoide nel reticolo di collagene. Concludiamo che la matrice di collagene 3D test di migrazione è un metodo versatile per analizzare la migrazione delle cellule all&#39;interno di un ambiente 3D fisiologico-like.

Il 3D-collagene test di migrazione matrice utilizzata in combinazione con time-lapse video-microscopia e di monitoraggio delle cellule assistita da computer consente la determinazione di vari parametri di migrazione delle cellule, compreso sia il parametro basato sulla popolazione (ad esempio, l&#39;attività locomotoria media) e parametri basati su celle singole (ad esempio, il tempo di movimento attivo, velocità, distanza migrato). Un esempio di set di dati di monitoraggio delle cellule ottenuti, l&...

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Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Migrazione delle cellule è un fenomeno biologico che è coinvolto in una pletora di fisiologica, come la guarigione delle ferite e le risposte immunitarie, e dei processi fisiopatologici, come il cancro. Il test di migrazione matrice 3D-collagene è uno strumento versatile per analizzare le proprietà migratorie dei diversi tipi di cellule all&#39;interno di in un ambiente fisiologico simile a 3D.

Analisi della migrazione delle cellule all&#39;interno di una tridimensionale di collagene Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.5K Views.  Witten/Herdecke University.  Migrazione delle cellule è un fenomeno biologico che è coinvolto in una pletora di fisiologica, come la guarigione delle ferite e le risposte immunitarie, e dei processi fisiopatologici, come il cancro. Il test di migrazione matrice 3D-collagene è uno strumento versatile per analizzare le proprietà migratorie dei diversi tipi di cellule all'interno di in un ambiente fisiologico simile a 3D. 

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Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Stampa planare e tridimensionale di inchiostri conduttivi

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Ricerca

Bioingegneria

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

Live-cellula Imaging di migrazione delle cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti-taggato in una matrice tridimensionale

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling in the tumor microenvironment 1. Previously, research on the tumor microenvironment has focused primarily on tumor-stromal interactions 1-2. However, the tumor microenvironment also includes a variety of biophysical forces, whose effects remain poorly understood. These forces are biomechanical consequences of tumor growth that lead to changes in gene expression, cell division, differentiation and invasion3. Matrix density 4, stiffness 5-6, and structure 6-7, interstitial fluid pressure 8, and interstitial fluid flow 8 are all altered during cancer progression.
Interstitial fluid flow in particular is higher in tumors compared to normal tissues 8-10. The estimated interstitial fluid flow velocities were measured and found to be in the range of 0.1-3 &mu;m s-1, depending on tumor size and differentiation 9, 11. This is due to elevated interstitial fluid pressure caused by tumor-induced angiogenesis and increased vascular permeability 12. Interstitial fluid flow has been shown to increase invasion of cancer cells 13-14, vascular fibroblasts and smooth muscle cells 15. This invasion may be due to autologous chemotactic gradients created around cells in 3-D 16 or increased matrix metalloproteinase (MMP) expression 15, chemokine secretion and cell adhesion molecule expression 17. However, the mechanism by which cells sense fluid flow is not well understood. In addition to altering tumor cell behavior, interstitial fluid flow modulates the activity of other cells in the tumor microenvironment. It is associated with (a) driving differentiation of fibroblasts into tumor-promoting myofibroblasts 18, (b) transporting of antigens and other soluble factors to lymph nodes 19, and (c) modulating lymphatic endothelial cell morphogenesis 20.
The technique presented here imposes interstitial fluid flow on cells in vitro and quantifies its effects on invasion (Figure 1). This method has been published in multiple studies to measure the effects of fluid flow on stromal and cancer cell invasion 13-15, 17. By changing the matrix composition, cell type, and cell concentration, this method can be applied to other diseases and physiological systems to study the effects of interstitial flow on cellular processes such as invasion, differentiation, proliferation, and gene expression.

Interstitial fluid flow is elevated in solid tumors and can modulate tumor cell invasion. Here we describe a technique to apply interstitial fluid flow to cells embedded in a matrix and then measure its effects on cell invasion. This technique can be easily adapted to study other systems.

Tridimensionale Cultura modello cellulare per misurare gli effetti del flusso del fluido interstiziale sulla Invasion cellule tumorali

The growth and progression of most solid tumors depend on the initial transformation of the cancer cells and their response to stroma-associated signaling ...

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

Concentric Sistema Gel per studiare il ruolo biofisica di Matrix Microenvironment sulla migrazione Cell 3D

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Planar gradiente di diffusione del sistema per Indagare Chemiotassi in un 3D collagene Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper composition, targeted modulus, and well-defined architectural features. Biomaterials that recapitulate the intrinsic architecture of in vivo tissue are vital for studying diseases as well as to facilitate the regeneration of lost and malformed soft tissue. A novel biofabrication technique was developed which combines state of the art imaging, three-dimensional (3D) printing, and selective enzymatic activity to create a new generation of biomaterials for research and clinical application. The developed material, Bovine Serum Albumin rubber, is reaction injected into a mold that upholds specific geometrical features. This sacrificial material allows the adequate transfer of architectural features to a natural scaffold material. The prototype consists of a 3D collagen scaffold with 4 and 3 mm channels that represent a branched architecture. This paper emphasizes the use of this biofabrication technique for the generation of natural constructs. This protocol utilizes a computer-aided software (CAD) to manufacture a solid mold which will be reaction injected with BSA rubber followed by the enzymatic digestion of the rubber, leaving its architectural features within the scaffold material.

An innovative biofabrication technique was developed to engineer three-dimensional constructs that resemble the architectural features, components, and mechanical properties of in vivo tissue. This technique features a newly developed sacrificial material, BSA rubber, which transfers detailed spatial features, reproducing the in vivo architectures of a wide variety of tissues.

Tridimensionale Tecnologia biomimetica: Novel Biorubber Consente di creare Definito micro e macro scala Architetture in collagene idrogel

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

Preparazione e analisi di<em&gt; In Vitro</em&gt; Tridimensionale carcinoma mammario mondo dei replicanti

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Tessuti epiteliali Ingegneria tridimensionali integrati all&#39;interno di matrice extracellulare

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Che caratterizzano la migrazione delle cellule all'interno del tridimensionale In Vitro ferita ambienti

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.