Vorremmo riconoscere la NSF per il finanziamento (cbet-0846259).

Fare riferimento alla Tabella 1 per la preparazione di tutti i media, tamponi e soluzioni di riferimento in questo protocollo. 1. Produzione di Aha-etichetta Adenovirus <ol><li> Preparare undici da 100 mm piatti di coltura di tessuto di cellule umane embrionali di rene (HEK 293) mantenuti in HEK 293 mezzo di crescita delle cellule (vedi Tabella 1) a 37 ° C fino a quando non hanno raggiunto l&#39;80 - 90% confluenza. (Nota:. Culture confluenza con oltre il 90% possono essere difficili da infettare e non può produrre virus come desiderato) </li><li> Allentare le cellule in uno dei piatti rimuovendo prima il mezzo di crescita, risciacquo una volta con 5 ml di tampone TD, quindi incubando le cellule per un minuto in 1 ml di tripsina-EDTA (1 ×). </li><li> Aggiungere 9 ml di HEK 293 mezzo di crescita cellulare, e utilizza un emocitometro per contare il numero di espianti di cellule HEK 293 da questo piatto. Utilizzare questo numero per calcolare la quantità di adenovirus di tipo 5 (Ad5) richiesto per infezione con un multiplicity di infezione (MOI) valore di 10 PFU / cell. Conto del fatto che per la normale Ad5, l&#39;indice di infettività (rapporto di particelle infettive al numero totale di particelle) è tipicamente 1:20. </li><li> Preparare 10 ml di tampone infezione. </li><li> Rimuovere lentamente il HEK 293 mezzo di crescita delle cellule provenienti dai dieci capsule di Petri rimanenti, quindi lavare con 5 ml di tampone TD. Aggiungere 1 ml di tampone di infezione per ogni piatto e incubare a 37 ° C per 1 ora. Durante questo periodo di infezione, far oscillare delicatamente ogni lato piatto di coltura a lato a intervalli di 15 min. </li><li> Dopo l&#39;infezione, aggiungere 9 ml di terreno fresco HEK 293 crescita cellulare e incubare a 37 ° C per 18 ore. </li><li> Preparare 100 ml di terreno Aha etichettatura (Met o mezzo di controllo per il controllo). Assicurati di filtrare le soluzioni stock concentrate con un 0,2 micron filtro per siringa sterile prima di preparare i mezzi di comunicazione di etichettatura. </li><li> Cautela (per non lavare via le cellule infette) rimuovere il HEK 293 mezzo di crescita delle cellule dopo 18 ore unond lavare ogni piatto cultura con 5 ml di tampone TD. </li><li> Rimuovere il TD soluzione tampone di lavaggio e aggiungere 10 ml di mezzo di etichettatura Aha ad ogni piatto cultura. Per un controllo, metionina mezzo di controllo deve essere usato al posto del mezzo di etichettatura Aha in questa fase. </li><li> Incubare le cellule infettate in etichettatura mezzo a 37 ° C per 6 h. L&#39;etichettatura possono essere effettuate in qualsiasi momento tra 12-24 ore post-infezione, ma non dovrebbe essere più lungo di 6 ore di durata. Questo intervallo è stato determinato per massimizzare la sovrapposizione con la traduzione delle proteine ​​virali strutturali, mentre l&#39;infettività garantendo non è significativamente diminuita. 7 </li><li> Rimuovere con cura il mezzo di etichettatura in modo da non interferire con le cellule. Aggiungere 10 ml di terreno fresco HEK 293 crescita cellulare per ogni piatto e incubare le cellule a 37 ° C per un&#39;altra ora 18. Per minimizzare la perdita di cellule infette durante questa fase, non è necessario rimuovere completamente la soluzione di etichettatura. Il HEK 293 mezzo di crescita cellulare contiene un eccesso di Met che competere con qualsiasi residuo di Aha. </li><li> Passare al punto 3 per la purificazione. </li></ol> 2. Produzione di Adenovirus azido-Sugar-etichetta <ol><li> Seguire la procedura dal titolo Produzione di Adenovirus Aha marcato fino al punto 1.5. </li><li> Preparare 100 ml di zucchero azido-media etichettatura. </li><li> Coprire le cellule con 10 ml di fresco azido-zucchero mezzo etichettatura e incubare a 37 ° C per 44 h. </li></ol> 3. Purificazione di Azide marcati con particelle adenovirali <ol><li> Rimuovere i supporti con le cellule infette da ogni piatto la cultura e il trasferimento ai tubi conici. Centrifugare a 2000 g per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in tampone TD (con 8 ml di tampone TD per 10 piatti). </li><li> Lisare le cellule infettate dai ripetuti (3 o più) cicli gelo-disgelo con un Dewar di azoto liquido e di un bagno di acqua a 37 ° C. Centrifugare a 2000 g per 10 mina 4 ° C per separare i detriti cellulari dal supernatante. </li><li> Preparare un gradiente di CsCl tubo di densità centrifuga prima pipettando 2,5 ml di 1,25 g / ml soluzione di CsCl in un tubo di centrifuga Ultra Clear. Successivamente, utilizzare una pipetta con la sua punta posizionato sul fondo del tubo di aggiungere lentamente 2,0 ml di 1,4 g / ml soluzione di CsCl, facendo attenzione a non disturbare l&#39;interfaccia di gradiente. </li><li> Pipettare il surnatante da 3,2 gradino sulla parte superiore del tubo gradiente di densità CsCl, e se necessario aggiungere tampone TD per riempire il tubo. Centrifugare i campioni in un rotore oscillante a 125.000 g per 1 ora a 15 ° C in un&#39;ultracentrifuga. </li><li> Dopo il completamento di ultracentrifugazione, le particelle del virus dovrebbe essere visibile come una banda bianca spessa in corrispondenza dell&#39;interfaccia dei due soluzioni CsCl. Effettuare una piccola perforazione sul fondo del tubo con un ago sterile per consentire alla soluzione di scendere goccia a goccia. </li><li> Raccogliere la banda bianca e spessa, che dovrebbe contenere i etichettati Ad5 particelle, taking cura di escludere eccesso di soluzione CsCl. Evitare di raccogliere le proteine ​​cellulari che banda sopra lo strato di virus. Inoltre escludere capsidi virioni vuoti che formano uno strato leggero leggermente sopra la banda di spessore virus bianco. </li><li> Facoltativamente, eseguire una purificazione finale sulle particelle etichettati Ad5. Aggiungere la frazione raccolta dal passaggio a 3,6 a 4 ml tubo ultracentrifuga e riempire il tubo con 1,35 g / ml soluzione di CsCl. Centrifugare a 125.000 g per 18 ore a 15 ° C e raccogliere la banda spessa bianco che forma al centro del tubo come descritto ai punti 3.5 e 3.6. (Si noti che se il titolo virale è bassa, una banda bianca può non essere visibile dopo la seconda centrifugazione, e non sarà possibile recuperare il virus etichetta). </li><li> Per la conservazione delle particelle virali per lunghi periodi di tempo, dialisi dell&#39;estratto virus raccolto deve essere eseguita contro tampone di stoccaggio virus. Conservare i campioni di virus dializzati a -80 ° C. </li></ol> 4. Lipropagazione di particelle adenovirali modificati con sonde alchino Utilizzo Strain-Promosso Azide-acetilenici cicloaddizione (SPAAC) <ol><li> Ad una soluzione di 50 pl di azide-modified Ad5 in tampone virus stoccaggio, aggiungere 0,25 pl di soluzione di etichettatura SPAAC. (Fare riferimento alla tabella di reagenti per una lista di venditori di alchini tesi disponibili in commercio). </li><li> Lasciare il ceppo-promosso reazione di cicloaddizione procedere notte a temperatura ambiente. Se un sensibile alla luce sonda (ad esempio TAMRA) viene utilizzato, coprire il recipiente di reazione con un foglio di alluminio. </li><li> Purificare il virus etichettati conformemente al punto 6. </li></ol> 5. Legatura delle particelle adenovirali modificati con sonde alchino in rame (I)-catalizzata Azide-acetilenici cicloaddizione (CuAAC) in Atmosfera deossigenato <ol><li> Luogo 7,2 mg di rame (I) bromuro (CuBr) in polvere in un tubo Eppendorf, coperto da un foglio di alluminio. </li><li> Pipettare 1 ml di DMSO in un secondo tubo Eppendorf. </li><li> Preparare50 pl di soluzione di etichettatura CuAAC in un terzo tubo Eppendorf. Coprire con un foglio di alluminio se la sonda alchino è sensibile alla luce (ad esempio TAMRA-alchini). </li><li> Mettere i tre tubi Eppendorf, senza cappuccio, in un sacchetto guanto deossigenato per 6 ore. Tutti i campioni devono rimanere all&#39;interno della borsa guanto fino al completamento della reazione CuAAC. </li><li> Preparare una soluzione stock 50 × di CuBr aggiungendo 1 ml di DMSO a 7,2 mg di polvere di CuBr, entrambi dei quali sono stati deossigenata secondo la fase 5,4. </li><li> Iniziare la reazione CuAAC pipettando 1 ml di questa soluzione stock CuBr a 50 pl della soluzione di etichettatura CuAAC, che è stata deossigenata secondo la fase 5,4. Lasciare la reazione per 12 hr all&#39;interno del sacchetto guanto. </li><li> Purificare il virus etichettati conformemente al punto 6. </li></ol> 6. Purificazione e lo stoccaggio delle particelle virali con etichetta <ol><li> Purificare i campioni di virus etichettati con Centri-Sep gel filtrazione di spin columns equilibrata con tampone Virus Storage, secondo le linee guida del produttore. </li><li> In alternativa, la purificazione può essere effettuata da dialisi contro tampone Virus stoccaggio. </li><li> Le particelle virali etichetta deve essere conservato a -80 ° C. </li></ol> 7. SDS-PAGE di Adenovirus etichetta Scanning &amp; Gel fluorescente <ol><li> Aggiungere 20 l tampone campione Laemmli (2 ×) a 20 microlitri di virus purificato etichettati e far bollire per 10 min. Centrifugare i campioni per 30 secondi per eliminare eventuali precipitati insolubili. Se il rame è presente residuo dopo purificazione, ebollizione il campione può risultare in strisce spessore di proteine ​​sul gel SDS-PAGE, causando difficoltà durante la visualizzazione. In questo caso, rinunciare ebollizione del campione in questa fase. </li><li> Fissare la cassetta gel elettroforesi alla cella e aggiungere tampone di corsa. Caricare il numero richiesto di pozzetti con i campioni di proteine ​​virali. Utilizzare un pozzetto per caricare pre-STAImarcatori di peso molecolare niti. Eseguire il gel per 1 ora a 200 V. Mantenere la cella elettroforesi coperto con un foglio di alluminio durante l&#39;intero periodo di ridurre fotodegradazione dell&#39;etichetta fluoroforo. </li><li> Per una migliore risoluzione e di rimuovere tutti fluoroforo libero, permettono il colorante tracking per esaurimento del gel durante l&#39;elettroforesi. Fermare il elettroforesi e trasferire rapidamente il gel ad un gel fluorescente e scanner eseguire la scansione del gel per l&#39;emissione di fluorescenza alla lunghezza d&#39;onda appropriata (574 nm per TAMRA). </li><li> Il numero di molecole di colorante coniugati a ciascuna particella virale può essere quantificato misurando la fluorescenza di diverse concentrazioni Tamra standard e confronto con il campione dal passaggio 7,3. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi I risultati osservati di SDS-PAGE e la scansione di gel fluorescente TAMRA-coniugati Ad5 sono mostrati nella Figura 3. Sebbene queste scansioni gel fluorescenti sono state eseguite su campioni modicato via CuAAC, i risultati dovrebbero essere comparabili, quando le sonde vengono legati via SPAAC. Queste scansioni gel indicano che i risultati in materia di etichettatura Aha nella modificazione dei tre Ad5 proteine ​​del capside (esone, Penton, e fibra), mentre l&#39;etichettatura di zucchero modifica solo la proteina del capside Fiber. Inoltre, un aumento della concentrazione di Aha (4 mm vs 32 mm) si traduce in un maggior grado di incorporazione Aha, ma ha anche dimostrato di ridurre l&#39;infettività. 7 risultati precedenti indicano che, per Ad5 prodotta in 4mM Aha, circa il 5% dei siti esposti metionina TAMRA sono modificati, con questo numero crescente al 10% quando 32 mm Aha viene utilizzato. Ciò corrisponde a circa 280 e 510, rispettivamente, coloranti marcati siti per Ad5 particelle. Analisi di zucchero-etichettatura 1 ha indicato che circa 22 dei 36 siti di glicosilazione su Ad5 sono occupati da uno zucchero azido e successivamente etichettati con TAMRA. Se dieci piastre di coltura tissutale sono utilizzati per produrre azide-modificato come descritto Ad5<html> in questo protocollo, 200-300 pl di azide virus-modified dovrebbe essere ottenuta dalla banda bianca raccolto nella fase 3,6, con un titolo di circa 1,5 × 10 12 particelle / ml. Una difficoltà comune di questa procedura è l&#39;assenza di una banda virale in questa fase di purificazione, che può essere attribuita a basso titolo virale. Questo è generalmente il risultato di infettare le cellule che sono o sovra-o sotto-confluenti, o lavando via le cellule - che diventano allentato dalla piastra dopo l&#39;infezione - durante il risciacquo durante la fase 1. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Protocollo panoramica. Azide contenente Aha o GalNAz viene dapprima inserito in particelle di adenovirus. Legatura con una sonda fluorescente alchino viene quindi eseguita mediante chimica &quot;click&quot;. Infine, SDS-PAGE è usato per dimostrare legatura della sonda fluorescente. IGURA 2 &quot;/&gt; Figura 2. Legatura di sonda alchino su azide-virus modificato tramite (a) SPAAC, (b) CuAAC sotto de-ossigenazione e (c) atmosfera ossigenata. <img src="/files/ftp_upload/4246/4246fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Scansioni fluorescenti di SDS-PAGE di azide-marcato adenovirus di tipo 5 (Ad5) dopo coniugazione con CuAAC TAMRA-acetilenici. (A) Aha-marcato Ad5, usando due concentrazioni di Aha. Etichettatura sembra verificarsi il esone adenovirus, Penton e fibra proteine ​​del capside, con l&#39;estensione dell&#39;etichettatura crescente con maggiore concentrazione di Aha. (B) Ac 4 adenovirus GalNAz-marcato sembra essere etichettati solo la proteina del capside fibra. <table border="1"><tbody><tr><td> Soluzione </td><td> Preparazione </td><td> Note </td></tr><tr><td> Ad5 di accumulo </td><td> 5 mM Tris-HCl (pH 8,0) contenente 0,5 mM MgCl 2, 50 mM NaCl, 25% (v / v) glicerolo, e 0,05% (w / v) albumina di siero bovino (BSA) </td><td> Conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Ad5 infezione tampone </td><td> 2% (v / v) di siero di vitello bovino, 1 × soluzione TC, Ad5 in tampone di conservazione (volume determinato utilizzando un MOI di 10 PFU / cella e un indice di infettività 1:20). Portare la soluzione al volume finale utilizzando TD tampone </td><td> Ad5 concentrazione può essere determinata attraverso l&#39;assorbimento UV. </td></tr><tr><td> TC soluzione (200 ×) </td><td> 136 mM CaCl 2, 100 mM MgCl 2 </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> TD tampone </td><td> 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,07 mM Na 2 HPO 4, e 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> HEK 293 cellule mezzo di crescita </td><td> Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM) supplementato con 10% (v / v) siero di vitello bovino (BCS) e 1% (v / v) Pen Strep </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td> Soluzione madre di Cys (100 ×) </td><td> DMEM (Met-/-Cys) supplementato con 200 mM L-cisteina </td><td> Preparare fresco e filtro con uno 0,2 micron filtro per siringa sterile prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> Aha soluzione stock (25 ×) </td><td> DMEM (-Met /-Cys) integrato con 100 mM L-Azidohomoalanine </td><td> Preparare fresco e filtro con uno 0,2 micron filtro per siringa sterile prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> Aha etichettatura media </td><td> DMEM (Met-/-Cys) supplementato con il 10% BCS, Aha soluzione madre (1 ×), 2 mM L-cisteina </td><td> Preparare fresco prima dell&#39;uso. Ciò corrisponde a un mM 4 concentration di Aha, ma le concentrazioni possono essere utilizzati diversi (vedi risultati rappresentativi). </td></tr><tr><td> Met soluzione stock (25 ×) </td><td> DMEM (Met-/-Cys) supplementato con 100 mM L-metionina </td><td> Preparare fresco e filtro con uno 0,2 micron filtro per siringa sterile prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> Met controllo del mezzo </td><td> DMEM (Met-/-Cys) supplementato con il 10% BCS, Met soluzione madre (1 ×), 2 mM L-cisteina </td><td> Preparare fresco prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> Ac 4 GalNAz soluzione stock (1.000 ×) </td><td> 50 mM peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) in metanolo </td><td> Conservare a 4 ° C. Ac 4 GalNAz è un precursore metabolico GlcNAz. </td></tr><tr><td> Azido di zucchero etichettatura media </td><td> 100 pl Ac 4 GalNAz soluzione madre, 100 ml HEK 293 la crescita delle cellule medie </td><td> Lasciare metanolo evaporare prima di aggiungere HEK 293 mezzo di crescita cellulare. </td></tr><tr><td> Soluzioni di cloruro di cesio </td><td> CsCl sciolto in tampone TD: 1,25 g / ml (18,08 g / 50 ml H 2 O) 1,35 g / ml (25,60 g / 50 ml H 2 O) 1,40 g / ml (31,00 g / 50 ml H 2 O) </td><td> Gradienti di densità per ultracentrifugazione </td></tr><tr><td> Virus di accumulo </td><td> Soluzione salina tamponata (PBS), pH 7,2, contenente 0,5 mM CaCl 2, 0,9 mM MgCl 2, e 10% (v / v) glicerolo </td><td> Conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> TAMRA-BCN (SPAAC) soluzione di etichettatura </td><td> TAMRA-BCN in DMSO: <ol><li> Utilizzare UV absorbance (OD 260 Assay) per determinare il titolo della soluzione di virus nella fase 4,1 </li><li> Determinare il numero totale di particelle virali in aliquota 50 microlitri (N Ad5) </li><li> Il TAMRA-BCN molarità (in M) è determinato utilizzando: c BCN = 4 × 10 8 × (N Ad5 / N Avo) Avo N = 6,022 × 10 23 (In modo che la miscela di reazione preparata al punto 4 contiene 100 sonde alchino per virione) </li></ol></td><td> Strain-promosso sonda alkyne Per SDS-PAGE, un titolo virale di circa 10 12 particelle / ml viene suggerito </td></tr><tr><td> TAMRA-alchini (CuAAC) soluzione di etichettatura </td><td> 50 pl di azide-modified Ad5 in tampone di virus di memorizzazione (N Ad5 determinato come sopra), 1,5 mM Batho<html> fenantrolina disolfonato (cioè 1,5 × concentrazione CuBr finale), TAMRA-acetilenici. TAMRA-alchini molarità (in M) è determinato utilizzando: c Alk = 2 × 10 6 × (N Ad5 / N Avo) (In modo che la miscela di reazione preparata al punto 5 contiene 100 sonde alchino per virione) </td><td> Tampone Tris è noto per essere un ligando competitiva e inibitoria di rame. 8 </td></tr><tr><td> Laemmli tampone campione (2 ×) </td><td> 125 mM Tris-HCl (pH 6,8), 4% (w / v) SDS, 20% (v / v) glicerolo, 10% (v / v) 2-mercaptoetanolo, e 0,004% (w / v) blu di bromofenolo </td><td></td></tr><tr><td> Il tampone di corsa </td><td> 187 mM glicina, 19 mM Tris-HCl, 3,5 mM SDS in H 2 O </td><td> Conservare a 4 ° C </td></tr></tbody></table>t &quot;&gt; Tabella 1. Preparazione dei tamponi e le soluzioni richieste dal presente protocollo.

<ol>
	<li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Attachment+of+Small+Molecule+Effector+Functionality+to+Human+Adenoviruses+Facilitates+Gene+Delivery+to+Cancer+Cells.">Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoselective+Modification+of+Viral+Proteins+Bearing+Metabolically+Introduced+"Clickable"+Amino+Acids+and+Sugars.">Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced "Clickable" Amino Acids and Sugars.</a> Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).</li><li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy.">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).</li><li>Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Retargeting+of+Adenovirus+Vectors:+Functionality+of+Targeting+Ligands+and+Their+Influence+on+Virus+Viability.">Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability.</a> J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).</li><li>Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+Type+5+Fiber+Knob+Domain+has+a+Critical+Role+in+Fiber+Protein+Synthesis+and+Encapsidation.">Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation.</a> J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).</li><li>Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+fluorescence+imaging+of+dynamic+S-acylation+and+protein+turnover.">Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).</li><li>Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unnatural+amino+acid+incorporation+onto+adenoviral+(Ad)+coat+proteins+facilitates+chemoselective+modification+and+retargeting+of+Ad+type+5+vectors.">Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors.</a> J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).</li><li>Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+Optimization+of+Copper-Catalyzed+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Bioconjugation.">Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).</li><li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions:+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules.">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li><li>Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Strain-Promoted+[3+++2]+Azide-Alkyne+Cycloaddition+for+Covalent+Modification+of+Biomolecules+in+Living+Systems.">A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems.</a> J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).</li><li>Dommerholt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Readily+Accessible+Bicyclononynes+for+Bioorthogonal+Labeling+and+Three-Dimensional+Imaging+of+Living+Cells.">Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).</li><li>Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+the+functionalizable+methionine+surrogate+azidohomoalanine+via+copper-catalyzed+diazotransfer.">Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer.</a> Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Lo sviluppo di reazioni click chemoselective e bioorthogonal, compresi quelli di azidi, è un settore in rapida evoluzione della ricerca, e successivamente vi è un numero crescente di queste reazioni da scegliere per le applicazioni bioconiugazione. Abbiamo ristretto il campo di applicazione di questo protocollo per includere solo due metodi che sono stati scelti per la loro utilità nel nostro laboratorio proprio e la disponibilità commerciale di tutti i reagenti. Nel primo percorso tale ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Adenovirus di tipo 5 (Ad5) contenente un transgene GFP </td><td> BCBC </td><td> 391 </td></tr><tr><td> Rene umano embrionale (HEK 293) cellule </td><td> ATCC </td><td> CRL-1573 </td></tr><tr><td> Dulbeccòs Modified Eaglès Medium (DMEM), Glucosio alto </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-092 </td></tr><tr><td> Dulbeccòs Modified Eaglès Medium, no metionina, cisteina no (DMEM-Met /-Cys), Glucosio alto </td><td> Invitrogen </td><td> 21013-024 </td></tr><tr><td> Bovine di siero di vitello </td><td> Invitrogen </td><td> 16170-078 </td></tr><tr><td> Penicillina - streptomicina 100 × Solution (Pen Strep) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> 0,5% tripsina-EDTA (10 ×) </td><td&gt; Invitrogen </td><td> 15400-054 </td></tr><tr><td> 100 millimetri Culture Dish cellula, tessuto-cultura polistirene trattata </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Coltura cellulare CO 2 incubatore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biosicurezza cabinet </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sterile filtro a siringa (0,2 um, acetato di cellulosa) </td><td> VWR </td><td> 28145-477 (NA), 514-0061 (Europa) </td></tr><tr><td> Avanti JE centrifuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 369001 </td></tr><tr><td> Provette coniche (50 ml, sterile) </td><td> BD Falcon </td><td> 352098 </td></tr><tr><td> Tube, pareti sottili, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td></tr><tr><td> Ultracentrifuga dotato di un 41 SW e SW 60 rOTOR </td><td> Beckman </td><td></td></tr><tr><td> Biopur Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 ml </td><td> Eppendorf </td><td> 0030 121.589 </td></tr><tr><td> Centrifugare 5418 </td><td> Eppendorf </td><td> 5418 </td></tr><tr><td> Centri-Sep gel filtrazione di spin colonne </td><td> Princeton separazioni </td><td> CS-901 </td></tr><tr><td> Ago sterile, 18 gauge </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Borsa azoto guanto (se CuAAC deossigenata deve essere eseguito) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dewar pallone </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L&#39;azoto liquido </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elettroforesi delle cellule </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gel fluorescente all&#39;interno dello scanner </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pronta Gel Tris-HCl Gel </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-1105 </td></tr><tr><td> L-Azidohomoalanine </td><td> AnaSpec </td><td> 63669 </td></tr><tr><td> Jena Biosciences </td><td> CLK-AA005 </td><td></td></tr><tr><td> Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac 4 GalNAz) </td><td> Invitrogen </td><td> C33365 </td></tr><tr><td> Thermo Scientific </td><td> 88905 </td><td></td></tr><tr><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7480 </td><td></td></tr><tr><td> Bathophenanthroline disolfonico (BDA) sale disodico </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0215011201 </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido (DMSO) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metanolo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tris base (tris (idrossimetil) amminometano) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Disodico fosfato (Na2 HPO 4) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Soluzione salina tamponata (PBS) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1M HCl </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-cisteina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L-metionina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SDS (dodecil solfato di sodio) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2-mercaptoetanolo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glycine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Blu di bromofenolo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di cesio (CsCl) </td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> Di rame (I), bromuro (CuBr) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di calcio (CaCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di potassio (KCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Magnesio cloruro (MgCl 2) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Alchino sonda per * CuAAC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA acetilenici </td><td> Invitrogen </td><td> T10183 </td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr><tr><td> Strained Sonda alchino per * SPAAC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> TAMRA Dibo acetilenici </td><td> Invitrogen </td><td> C10410 </td></tr></tbody></table> * I venditori notevoli di reagenti chimici clic e kit includono Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Fare clic su Strumenti Chimica e Baseclick. Una varietà di coloranti alchino e ligandi di targeting possono essere trovati nei cataloghi di questi venditori.

chemoselective modification of viral surfaces via bioorthogonal click chemistry

La modifica di particelle virali ha ricevuto una quantità significativa di attenzione per il suo potenziale impatto enorme per terapia genica, le applicazioni oncolitici e sviluppo di vaccini. 1,2,3 attuali approcci per modificare le superfici virali, che sono prevalentemente a base genetica, spesso soffrono di attenuazione della produzione di virus, l&#39;infettività e cellulari di trasduzione. 4,5 utilizzando la chimica chemoselective click, abbiamo sviluppato un approccio diretto alternativo che evita questi problemi, pur rimanendo allo stesso tempo estremamente flessibile e accessibile. 1,2 L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare l&#39;efficacia di utilizzare la chimica bioorthogonal click per modificare la superficie di particelle di adenovirus di tipo 5. Questo processo a due fasi può essere utilizzato sia terapeuticamente 1 o analiticamente, 2,6 quanto consente di ligazione chemoselective di molecole targeting, coloranti o altre molecole di interesse su proteinepre-etichettati con tag azide. I tre principali vantaggi di questo metodo sono che (1) etichettatura metabolica dimostra poco o nessun impatto sulla fitness virale, 1,7 (2) una vasta gamma di leganti effettrici può essere utilizzato, e (3) è notevolmente veloce, affidabile e di facile accesso. 1,2,7 Nella prima fase di questo procedimento, le particelle di adenovirus sono prodotti tenendo sia azidohomoalanine (Ah, un surrogato metionina) o zucchero innaturale O-legato N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), entrambi i quali contengono l&#39;azide (N-3) funzionali gruppo. Dopo purificazione dei azide modificati particelle virali, una sonda alchino contenente la parte fluorescente TAMRA è ligato in modo chemoselective alle proteine ​​pre-marcate o glicoproteine. Infine, un SDS-PAGE analisi viene eseguita per dimostrare la legatura successo della sonda sulle proteine ​​del capside virale. Incorporazione Aha è mostrato per etichettare tutti i capside viraleproteine ​​(esone, Penton e fibra), mentre O-GlcNAz risultati incorporazione di etichettatura di Fiber solo. In questo campo in continua evoluzione, diversi metodi per azide-alchino legatura sono stati sviluppati con successo, ma solo i due che abbiamo trovato per essere più conveniente sono qui dimostrato - strain-promosso azide-alchino cicloaddizione (SPAAC) e rame-catalizzata azide-alchino cicloaddizione (CuAAC) in atmosfera deossigenata.

Watch this Scientific Journal Video about Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry at JoVE.com

Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

Particelle di adenovirus sono progettati per contenere l&#39;innaturale azidohomoalanine analogo dell&#39;acido amino o lo zucchero azido<em&gt; O</em&gt;-GlcNAz. Il gruppo azide di ciascuno è legato chemoselectively via &quot;scattano&quot; le reazioni di chimica come mezzo di modifica della superficie virale.

Modifica Chemoselective delle superfici virali tramite Chimica Click Bioorthogonal

The modification of virus particles has received a significant amount of attention for its tremendous potential for impacting gene therapy, oncolytic ...

chemoselective-modification-viral-surfaces-via-bioorthogonal-click

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.8K Views.  Stony Brook University. Particelle di adenovirus sono progettati per contenere l'innaturale azidohomoalanine analogo dell'acido amino o lo zucchero azido O-GlcNAz. Il gruppo azide di ciascuno è legato chemoselectively via "scattano" le reazioni di chimica come mezzo di modifica della superficie virale.

Video: Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolamento di varianti di virus RNA Fidelity e caratterizzazione di frequenza Virus Mutation

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Estrazione di DNA virale da nucleocapsidi

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposon modifica del sistema di cellule primarie umane T

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Creazione di un liquido coperto Cultura polarizzata Airway epiteliali umane Calu-3 celle per studio cellulare risposta dell&#39;ospite agli agenti patogeni delle vie respiratorie<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Utilizzando Clicca Chimica per misurare l&#39;effetto dell&#39;infezione virale sulla cellula ospite RNA Sintesi

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Tampone Metodo di campionamento per la rilevazione di Norovirus umana sulle superfici

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Test di rilascio di Caseum che prevede la penetrazione di farmaci nelle lesioni della tubercolosi

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...