L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire un metodo pratico per la preparazione di composti fotocagedi con proprietà aggiuntive come solubilità in acqua o capacità di targeting cellulare. Utilizzando una semplice procedura sintetica, questa tecnica può essere utilizzata per espandere il laboratorio su composti in gabbia e per realizzare composti in gabbia con proprietà aggiuntive senza compromettere la loro fotosensibilità. Questa sintesi può essere eseguita in un laboratorio standard in quanto i nostri composti a gabbia cliccabili sono stabili alla fotoirradiazione quando vengono sciolti in solventi organici non nucleofili come il diclorometano o il dimetil solfossido.
A dimostrare la procedura con Hirona Sasaki saranno Akinobu Suzuki, un post-doc, Hanami Aoki e Rei Watahiki, studenti laureati del laboratorio. Iniziare aggiungendo 709,6 milligrammi di metanolo paBhc e 397,6 milligrammi di n n-carbonildiimidazolo in un pallone a fondo rotondo da 30 millilitri. Aggiungere sei millilitri secchi di diclorometano al pallone e mescolare la soluzione a temperatura ambiente per un'ora.
Al termine dell'incubazione, aggiungere 342,8 milligrammi di 4-dimetilaminopiridina e 552 microlitri di carbammato di tert-butil sei-amminoessule e mescolare la soluzione a temperatura ambiente per altre tre ore. Quindi utilizzare un evaporatore rotante sotto vuoto per rimuovere il solvente e altri materiali volatili e utilizzare la cromatografia a colonna flash in gel di silice per purificare direttamente il residuo. Per installare un'unità funzionale nel composto a gabbia cliccabile, sciogliere 249 milligrammi di rame due pentaidrato solfato in 10 millilitri di acqua scambiata con ioni per dare una soluzione di solfato di rame molare 0,1.
Sciogliere otto milligrammi di due primi paBhc mock paclitaxel, 7,5 milligrammi di tris(3-idrossipropiltriazolilmetil)ammina, 162,4 milligrammi di sodio-l-ascorbato e 3,1 milligrammi di 15-cloro-3, 6, 9-triossipentildecil azide in un solvente misto di 2,5 millilitri di tampone di fosfato molare 0,1 e 0,5 millilitri di solfossido di dimetile. Successivamente, aggiungere 81,2 microlitri di soluzione di solfato di rame molare 0.1 alla miscela di reazione e mescolare la miscela a temperatura ambiente per 80 minuti, monitorando l'avanzamento della reazione con HPLC. Al termine della reazione, risolvere i precipitanti con 3,5 millilitri di una soluzione di acqua nitril di acetil al 75% e applicare la soluzione risultante direttamente al sistema HPLC semi-preparatore per purificare il prodotto desiderato.
Per le misurazioni dell'efficienza quantistica, sotto lampade fluorescenti rivestite con filtro di taglio della luce UV, diluire la soluzione del campione in 10 microlitri di solfossido di dimetile con 10 millilitri di tampone KMOPS. Trasferire un'aliquota della soluzione nella stessa provetta utilizzata nella reazione fotografica dell'actinometro chimico. Irradiare la soluzione campione con una luce di 350 nanometri per cinque secondi, rimuovendo periodicamente 50 aliquote di microliter dalla soluzione irradiata per l'analisi da parte dell'HPLC.
Determinare quindi il tempo di irradiazione in secondi in cui il 90% della materia prima ha reagito adattando i posti di osservazione della scomparsa dipendente dal tempo della materia prima. Per il targeting del ligando HaloTag di un composto in gabbia cliccabile, raccogliere la popolazione cellulare bersaglio di interesse con un reagente di dissociazione cellulare appropriato e sospendere nuovamente le cellule in un 2,5 per 10 alla quinta cella per millilitro di concentrazione DMEM. Quindi seminare circa 10 alla quinta parte per piatto in 35 millilitri di vetro per un'incubazione notturna a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica.
La mattina dopo, diluire 14 microgrammi del DNA del PC tre DNA plasmatici del recettore del fattore di crescita epidermico alo in un tubo di micro centrifuga da 1,5 millilitri contenente 700 microlitri di mezzo siero ridotto. Successivamente, aggiungere cinque microlitri del reagente di lipofezione in 150 microlitri di mezzo siero ridotto a ciascuno dei quattro tubi e lasciare riposare i tubi a temperatura ambiente per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 150 microlitri di DNA plasmatico diluito a ciascuno dei campioni diluiti di reagente per lipofezione e incubare i campioni a temperatura ambiente per altri cinque minuti.
Al termine dell'incubazione, sciacquare le cellule con due millilitri di PBS per piatto e aggiungere 1,5 millilitri di mezzo siero ridotto ad ogni coltura. Aggiungere 150 microlitri del complesso di reagenti lipofezione plasmide ad ogni piatto e riportare le cellule all'incubatore di coltura cellulare per 48 ore. Al termine dell'incubazione, aspirare i supernaganti e aggiungere un millilitro di DMEM appena preparato integrato con due alo di esagono micromolare per ogni piatto.
Dopo 30 minuti a 37 gradi Celsius, aspirare il mezzo contenente il composto in gabbia e sciacquare le cellule due volte con un millilitro di PBS più per rimuovere eventuali composti non abbondati. Aggiungere 500 microlitri di mezzo siero ridotto ad ogni piatto e riportare le cellule all'incubatore di coltura cellulare per altri 30 minuti per rimuovere i composti che sono entrati nelle cellule. Alla fine dell'incubazione, sciacquare le cellule due volte con un millilitro di PBS più per piatto e aggiungere un millilitro di mezzo senza rosso fenolo ad ogni coltura.
Quindi registrare le immagini di florescence mediante microscopia a florescence confocale a scansione laser. Per la modulazione foto-mediata della localizzazione della chinasi utilizzando un composto a gabbia cliccabile, seminare circa cinque volte 10 alla quinta cellule TOC-A-one in due millilitri del mezzo F12 di Ham per piatto inferiore in vetro da 35 millilitri. Il giorno dopo, trasfetto le cellule con la codifica plasmide per GFP diacilglycerrolo chinasi gamma per 48 ore come appena dimostrato.
Dopo la fine della trasfezione, sostituire il supernatante di trasfezione con due millilitri di mezzo siebro ridotto. Aggiungere 20 microlitri di soluzione di lavoro 100 volte paBhcAA alle cellule per un'incubazione da cinque a 60 minuti a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, posizionare il piatto sullo stadio oggettivo di un microscopio fluorescente invertito dotato di un illuminatore a doppia sorgente luminosa a fluorescenza.
Immagini le cellule ogni 10 secondi per 10 minuti mentre irradiano le cellule nei punti di tempo sperimentali appropriati e nelle lunghezze d'onda secondo il protocollo sperimentale. Utilizzando questo metodo come dimostrato, i composti in gabbia cliccabili di alcune molecole biologicamente interessanti, tra cui paclitaxel e acido arachidonico, possono essere sintetizzati con successo. Proprietà aggiuntive come la solubilità in acqua e la capacità di targeting cellulare possono essere introdotte nel paBhc mock paclitaxel attraverso quello in rame catalizzato reazione di clic di ciclizzazione.
Questi paclitaxel in gabbia cliccabili possono quindi essere fotolizzati per produrre i loro composti genitori dopo l'irradiazione a 350 nanometri. Le proprietà fisiche e fotochimiche dei composti a gabbia cliccabili sono riassunte nella tabella. Negli esperimenti sulle cellule vive, il targeting dell'esx fitzi halo paBhc verso cellule di mammifero coltivate che esprimono transitoriamente una proteina halotagged e un recettore del fattore di crescita epidermico induce un segnale di florescence verde dalla fluoresceina moiety PAHBHC hex fitzi halo sulla membrana cellulare.
Inoltre, il trattamento delle cellule CHO-K1 che esprimono transitoriamente GFP diacil glicerolo chinasi gamma con acido arachidonico provoca la modulazione della localizzazione subcellulare della diacil glicerolo chinasi gamma. Cambiamenti simili nella localizzazione gamma della glicerolo chinasi diacil si osservano anche nelle cellule trattate con paBhc-AA dopo l'esposizione alla luce UV. Quando si eseguono gli esperimenti di permanenza in gabbia in soluzioni acquose aumentando il mezzo di coltura, assicurarsi di lavorare sempre sotto lampada fluorescente con filtro limitato a lunghezza d'onda corta.
Seguendo questa procedura, è possibile studiare composti in gabbia che sono stati abbondanti per l'uso in esperimenti biologici a causa della mancanza di solubilità in acqua, permeabilità alla membrana o capacità di targeting cellulare.
