La ricerca per prevenire la cecità, l&#39;assistenza sperimentale da Takayuki Nagasaki; Questa ricerca è conforme con la dichiarazione ARVO per l&#39;uso di animali in oftalmica e di ricerca visiva. KJW è supportato da sovvenzioni NIH 5T32EY013933 e 5T32DK007647-20. VBM è sostenuto da NIH sovvenzione K08EY020530.

1. Montare dispositivi per l&#39;iniezione sottoretinico <ol><li> Acquistare o fare un ago diametro 100 micron da un tubo capillare di vetro. Questo può essere fatto manualmente utilizzando un Sutter P-97 pipetta estrattore o altre apparecchiature simili. L&#39;estremità del tubo capillare viene riscaldato e tirato fino a raggiungere il diametro desiderato (100 micron). Un ago di diametro più piccolo può essere utilizzato per vettori di terapia genica, tuttavia, questo è il diametro raccomandato per l&#39;iniezione delle cellule senza danni alle cellule o l&#39;occhio. Rispetto agli aghi di acciaio, l&#39;ago capillare di vetro ha una punta molto fine, ma smussato, per consentire la visualizzazione del fluido di iniezione e l&#39;accesso allo spazio sottoretinico senza provocare rotture retiniche. Pulire questi aghi tirati, se necessario, si usa il 70% di etanolo, e conservare in un contenitore sterile. A cm 15 sterile piatto di coltura tissutale con nastro per tenere gli aghi in posizione è un modo in cui per mantenere gli aghi di iniezione coperto e in ambiente sterile. A questo punto, complete il set-up all&#39;interno della sala chirurgica in cui la procedura avrà luogo. E &#39;più facile mantenere tutte le apparecchiature in sala operatoria in ogni momento in modo che esso rimanga sterile, soprattutto se questa procedura viene effettuata all&#39;interno di una struttura barriera. </li><li> Aspirare silicone nell&#39;ago iniezione ed espellere il silicone per lasciare un rivestimento lungo le pareti interne dell&#39;ago. Il rivestimento siliconico massimizza il passaggio di cellule e virus attraverso il foro dell&#39;ago, che altrimenti si attaccano alle pareti interne dei capillari di vetro. </li><li> Ottenere un circa 8 cm di lunghezza del tubo di plastica sterile, tagliando a 25 ¾ calibro di raccolta del sangue insieme con luer-lock nel punto subito dopo l&#39;ago (rimuovere l&#39;ago dal tubo). </li><li> Riempire una ml 1 Sub-Q 26 5/8-gauge slip-siringa con soluzione salina sterile e rimuovere l&#39;ago dalla siringa. </li><li> Attaccare l&#39;ago dell&#39;iniezione al fine taglio del tubo in plastica e collegare la siringa al luer-lock all&#39;altrafine. </li><li> Aspirare soluzione salina sterile per riempire lo spazio morto nel tubo dell&#39;ago e capillare, espellendo alcuni salina attraverso l&#39;ago per assicurare che esso sia collegato correttamente senza perdite. Successivamente, aspirare una piccola, circa 1 quantità microlitri di aria, nella punta dell&#39;ago di iniezione. Questo separerà la soluzione salina dal fluido di iniezione e di fornire un segnale visivo che indica la fine del fluido di iniezione durante la procedura chirurgica. Il dispositivo di iniezione deve essere mantenuto su una superficie pulita pulito con etanolo al 70% durante la procedura chirurgica. Inoltre, tutte le attrezzature usate durante la procedura chirurgica deve essere pulito prima e dopo con etanolo 70%, per l&#39;eccezione degli aghi di iniezione che dovrebbe già essere mantenuta sterile e pronta per l&#39;uso. Questi aghi devono essere smaltiti dopo l&#39;intervento chirurgico, e non riutilizzati. </li><li> Infine, aspirare soluzione iniettabile contenente il desiderato confezionato vettore terapia genica virale o cellule staminali. Questo può essere fattoriprendendo la soluzione iniettabile in una punta di pipetta sterile, quindi pipettare la soluzione sulla superficie di un recipiente sterile coltura cellulare. La soluzione può essere facilmente aspirato nel ago per iniezione con la siringa. La quantità necessaria varierà a seconda dell&#39;età del mouse. Per i nostri scopi usiamo postnatali giorno 5 topi, che può essere iniettato con 0,5-0,8 ml di fluido di iniezione. Piccole quantità, 0,5 microlitri o meno, possono essere utilizzati per topi più giovani e grandi quantità, come 1 ml, può essere utilizzato per topi adulti. Il titolo virale o numero di celle deve essere determinato in base alle cellule / virus viene iniettato e il loro tessuto bersaglio desiderato, come troppe particelle virali o cellule in un piccolo volume può portare a tossicità per le cellule della retina. Nel video, per scopi di visualizzazione, abbiamo utilizzato 1,5 microlitri, una maggiore quantità di colorante del necessario per iniettare nell&#39;occhio. </li></ol> 2. Accesso spazio sottoretinico <ol><li> All&#39;interno della camera sterile chirurgica,stabilizzare o anestetizzare il mouse secondo il protocollo approvato animale localmente manipolazione, che variano per età del mouse. Anestesia comune per topi adulti include l&#39;uso di gas isoflurano o una iniezione intraperitoneale di 0,1 peso corporeo ml/10g di ketamina (100 mg / ml) e xilazina (20 mg / ml) in soluzione fisiologica sterile. Per topi perinatali, tecniche di anestesia comuni includono l&#39;uso di gas isoflurano o cryoanesthesia (ipotermia). Tutte le tecniche di anestesia deve essere approvato dal comitato locale IACUC prima dell&#39;uso. Usiamo tipicamente post-natale giorni (P) 5 topi, sebbene le tecniche simili possono essere applicate a topi giovani come P0 o per topi adulti. La procedura chirurgica non può iniziare fino a quando il mouse ha smesso muovere gli arti e non risponde più ai piedi pizzichi. Per i topi perinatali, diventeranno notevolmente di colore più chiaro in quanto il flusso di sangue rallenta, un altro tasto per sapere che sono completamente sotto anestesia. </li><li> Nei topi perinatali, usare le forbici Vännäs rette a make una incisione di circa 1,5 mm lungo la fessura coperchio chiuso. Fare attenzione a tagliare il rientro, dove l&#39;occhio, naturalmente, aperto in futuro. Questo assicura che i coperchi guarirà e aprire correttamente durante lo sviluppo del mouse. Una lama chirurgica può essere usato per questo scopo, anche se preferiamo forbici Vännäs quanto riducono il rischio di puntura nell&#39;occhio durante questa procedura. Nel video, le forbici sono state utilizzate per perforare e tagliare direttamente lungo il margine palpebrale. Quando imparare questa tecnica, pinza deve essere usato per sollevare la palpebra prima del taglio e ridurre il rischio di danneggiare l&#39;occhio. </li><li> Separare le palpebre con una pinza medicazione curve per proptose l&#39;occhio e pizzicare le palpebre un po &#39;sotto l&#39;occhio di tenerlo proptosed per l&#39;iniezione. Se il coperchio incisione fatta nel passaggio due è troppo grande, l&#39;occhio scivolare indietro sotto le palpebre e impedire l&#39;esposizione adeguata durante la procedura di iniezione. Per i topi adulti, applicando una leggera pressione intorno all&#39;occhio con il dressing pinza può tenere l&#39;occhio proptosed per l&#39;iniezione. </li><li> Fai una piccola incisione sclerale uguale o posteriore al equatore del globo da parte di graffiare la superficie con una lama di 15 gradi microchirurgia. Questa incisione dovrebbe essere solo abbastanza grande per passare la punta dell&#39;ago di iniezione, ma non più grande di questo. Se preferito, un piccolo ago appuntito come un ago di agopuntura può essere usato per fare questa incisione nello spazio sottoretinico posto della lama microchirurgia. Negli animali scura, un marrone scuro pigmentato tessuto (coroide-dell&#39;epitelio pigmentato retinico) diventerà visibile nel punto di incisione. In più leggeri topi pigmentati o albino, una penna chirurgica marcatura può essere applicato alla punta della lama microchirurgia lasciare un posto inchiostro indica il sito di incisione. Se chiare (vitreo) riflussi di fluido dal sito di incisione, la lama è stata posta troppo in profondità ed è entrato nella cavità vitrea e il virus terapeutico o cellule possono entrare nello spazio durante l&#39;iniezione intravitreale. Per visualizatisulla scopi, abbiamo fatto l&#39;incisione a questo punto del video. È ancora possibile eseguire una iniezione sottoretinico in questo caso però il distacco di retina causato dalla presenza del liquido di iniezione non può guarire completamente in questo mouse. Pertanto, occorre prestare attenzione a tagliare solo la superficie esterna dell&#39;occhio e non attraverso la retina prima dell&#39;iniezione. </li><li> Inserire con attenzione l&#39;ago iniezione nel sito di incisione e farlo avanzare parallelamente alla parete esterna dell&#39;occhio per entrare nello spazio sottoretinico. Avanzando troppo vicino alla parete esterna o troppo in profondità all&#39;interno dell&#39;occhio dirigerà l&#39;iniezione nella posizione sbagliata. Il metodo migliore per capire se l&#39;ago si trova nella posizione corretta è quello di praticare la tecnica. Praticare su topi leggermente pigmentate o albino può contribuire a rendere iniezioni precisi ed accurati nello spazio sottoretinico. Questo perché il fluido dell&#39;ago e l&#39;iniezione è visibile all&#39;interno di questi occhi. </li><li> Applicare una leggera pressione lo stantuffo della siringa e di esseregin iniezione del fluido desiderato. Se l&#39;ago è posizionato correttamente nello spazio sottoretinico, contropressione moderato si faranno sentire. Se l&#39;ago si trova all&#39;interno del vitreo, ci sarà significativamente meno contropressione e potenzialmente alcuni riflusso del fluido durante l&#39;iniezione. In caso di contropressione significativa, tenere l&#39;ago in posizione per almeno altri 15 secondi prima di estrarre l&#39;ago lentamente. Ciò permetterà l&#39;alta pressione intraoculare per equalizzare anziché riflusso del virus o cellule iniettate indietro il sito di incisione. Parte dell&#39;aria e soluzione salina può essere iniettato nello spazio sottoretinico a causa della maggiore pressione richiesta durante la procedura di iniezione. Si deve prestare attenzione a non sovra iniettare aria o soluzione salina, poiché può scovare iniettato il virus o cellule dall&#39;occhio. È anche possibile far sì permanenti distacco di retina dalla presenza di liquidi troppo iniettato nello spazio sottoretinico. Per scopi di visualizzazione, il colorante in eccesso e l&#39;aria è stata iniettata into spazio sottoretinico nel video. Si vede chiaramente come alcuni del colorante viene lavata posteriore dallo spazio sottoretinico se troppo è iniettato, ma anche come la bolla d&#39;aria rimane all&#39;interno dello spazio sottoretinico e non scompare nel vitreo. Questo è stato usato per sottolineare che queste iniezioni erano tutti nella corretta posizione degli occhi, così si può visualizzare come l&#39;ago deve entrare nel sito di incisione. Tutte le iniezioni nello spazio sottoretinico provocare un distacco della retina temporanea per la presenza del liquido di iniezione. Se la procedura di iniezione è completato correttamente, questo distacco di retina temporanea guarirà entro 24 ore e topi possono essere utilizzati per tutti i successivi esperimenti. L&#39;occhio può rimanere morbido per circa una settimana a causa della procedura chirurgica, quindi una seconda iniezione deve essere evitato durante questo periodo di tempo. </li><li> Per i topi neonati, utilizzare le pinze medicazione curve per spingere delicatamente l&#39;occhio dietro le palpebre e nell&#39;orbita. Può essere utileattendere per un minuto al fine di consentire al virus di stabilirsi nello spazio sottoretinico e non farla essere lavata dal sito di incisione quando spingendo leggermente l&#39;occhio nella sua orbita. Dopo l&#39;intervento chirurgico, una goccia di bupivacaina 0,5% (Marcaine) diluito al 0,25% in soluzione salina sterile da un ago calibro 25 può essere posizionato nel sito di iniezione. I topi non mostrano evidenti segni di sofferenza dopo l&#39;intervento chirurgico sottoretinico e l&#39;uso di bupivacaina come una lunga durata d&#39;azione analgesico topico è stato sufficiente per i tre anni precedenti. I topi devono sempre essere monitorati dopo l&#39;intervento chirurgico alla ricerca di eventuali segni di sofferenza, come infezioni, gonfiore, o una diminuzione delle attività quotidiane del mouse. Se questi si verificano, il veterinario deve essere notificata e altri farmaci per il dolore come la buprenorfina (0,05 mg / kg) può essere somministrato con una iniezione intraperitoneale. </li><li> Wake il mouse dall&#39;anestesia secondo il protocollo animale localmente riconosciuto. Il mouse deve essere mantenuto su una p riscaldamentoannuncio a mantenere la temperatura corporea normale, come si sveglia dall&#39;anestesia. La procedura chirurgica dovrebbe richiedere meno di cinque minuti per completare, senza contare il tempo per il mouse a subire l&#39;anestesia. Pertanto, una piastra elettrica non è necessario durante la procedura attuale, ma può essere necessaria quando si sta imparando la tecnica come la procedura potrebbe richiedere un periodo di tempo più lungo. Il mouse non deve essere rimesso in una gabbia pulita fino a quando non ha cominciato a muoversi da solo. Per i neonati, pizzichi punta dolci per aiuterà a recuperare pienamente l&#39;anestesia, e dovrebbero riprendere il loro colore rosa e il movimento prima di essere indietro con la madre. I topi devono essere monitorati nel tempo per rilevare eventuali segni di sofferenza come indicato in precedenza. </li></ol>

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	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questa tecnica video fornisce istruzioni su come completare la procedura chirurgica sottoretinico iniezione successo, e garantire che il vettore terapia genica o le cellule staminali sono collocati nella posizione necessaria per trattare efficacemente la malattia oftalmica. Questa tecnica permette di targeting di cellule retiniche quali la RPE o fotorecettori, in quanto pone i vettori per terapia genica o cellule staminali derivate da tessuti in prossimità di queste cellule. I metodi precedenti coinvolti iniezioni intr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> 0,8-1,10 x 100 mm Tubo capillare (vetro) </td><td> Kimble Glass, Inc. </td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipetta Puller </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td><td> Narishige microforgia può essere utilizzato in sostituzione. Catalog # MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td> Silicone </td></tr><tr><td> Fosfato Dubecco di soluzione salina tamponata con cloruro di calcio e cloruro di magnesio </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> Sicurezza-Lok 25 3/4G x 12 &quot;; Imposta il prelievo di sangue </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Sub-Q 265/8G Slip-Tip Siringa </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5-10 ul Finnpipette II-Volume regolabile pipettatura </td><td> FISHERBRAND </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1-200 ul Consigli naturali smussati </td><td> USA Scientific, Inc. </td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 Microscopio Stereo </td><td> Zeiss </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm Stile trattato cellulare Dish polistirene Cultura </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> Forbici Vännäs dritti </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> Pinze curve Dressing con dentellature Delicate </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15 Tipo Coltello Microchirurgia </td><td> Wilssu oftalmica Corp. </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamina </td><td> Ketaset III </td><td> NADA # 45-290 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazina </td><td> Lloyd Laboratories </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivacaina (Marcaine) </td><td> AstraZeneca </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

La perdita della vista colpisce circa 3,4 milioni di persone negli Stati Uniti e dovrebbe aumentare nei prossimi anni. 1 Recentemente, la terapia genica e trapianto di cellule staminali sono diventate fondamentali strumenti terapeutici per la cura della cecità derivante da malattie degenerative della retina. Diverse forme di trapianto autologo di età degenerazione maculare (AMD), come il trapianto di cellule del pigmento epiteliale dell&#39;iride, hanno dato risultati incoraggianti, e studi clinici hanno iniziato ad altre forme di terapie geniche e cellulari staminali. 2 Questi includono RPE65 sostituzione del gene terapia in pazienti con amaurosi congenita di Leber e un trapianto di cellule RPE utilizzando umane staminali embrionali (ES) cellule nella malattia di Stargardt. 3-4 Ora che sono vettori di terapia genica e cellule staminali disponibili per il trattamento di pazienti con malattie retiniche, è importante verificare questi potenziali terapie in modelli animali prima di applicarezione in studi sull&#39;uomo. Il mouse è diventato un importante modello scientifico per testare l&#39;efficacia terapeutica di vettori di terapia genica e trapianto di cellule staminali negli occhi. 5-8 questo articolo video, vi presentiamo una tecnica per iniettare vettori di terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico di l&#39;occhio del mouse riducendo i danni al tessuto circostante.

Un disegno dell&#39;occhio del mouse viene visualizzata con le strutture principali etichettati come riferimento, con le frecce che mostrano le posizioni per le procedure di iniezione sia intravitreali e sottoretinico chirurgici (punte di freccia, figura 1). Vettori di terapia genica, quali il vettore lentivirale lacZ (Figura 2), può essere iniettato usando queste posizioni. Inoltre, le cellule staminali di topo, come le cellule staminali embrionali (Figura 3),</strong...

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Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Questa tecnica chirurgica illustra l&#39;iniezione di vettori di terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico dell&#39;occhio mouse.

Iniezione sottoretinico di vettori di terapia genica e cellule staminali nel Eye mouse

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

subretinal-injection-gene-therapy-vectors-stem-cells-perinatal-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

32.9K Views.  Columbia University. Questa tecnica chirurgica illustra l'iniezione di vettori di terapia genica e cellule staminali nello spazio sottoretinico dell'occhio mouse.

Video: Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

Ad alta efficienza di trasduzione delle cellule tumorali del fegato da adeno-associato ricombinante sierotipo Virus 3 Vettori

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

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Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Istituzione e Propagazione dei Tumori retinoblastoma umani in topi privi di sistema immunitario

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

Produzione e di rilevamento di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) in Cancro

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Un nuovo approccio chirurgico per somministrazione endotracheale di agenti bioattivi in ​​un modello murino fetale

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Distacco della retina Modello in Roditori da iniezione sottoretinico di ialuronato di sodio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

Trapianto subretinale di cellule precursori del fotorecettore purificato MACS nella retina del topo adulto

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Esecuzione sottoretinico Iniezioni in roditori di agire cellule retiniche epitelio pigmentato in sospensione

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Sviluppo di un Rat modello Alfa-sinucleina per la malattia di Parkinson mediante iniezione stereotassica di un ricombinante vettore virale adeno-associato

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Un passo per passo protocollo per la chirurgia sottoretinico in Conigli

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...