Gli autori desiderano ringraziare il Centro di UC Riverside per Gliali-neuronali Interazioni prezioso per la discussione dei protocolli di scala e dati. Gli autori desiderano anche per dare un ringraziamento sincero a Abcam per sponsorizzare la pubblicazione del loro lavoro.

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	<li>Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+acetylcholine+evokes+Ca2++elevations+in+astrocytes+in+hippocampal+slices.">Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices.</a> J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).</li><li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+mediate+neuron-astrocyte+communication.">Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication.</a> Neuron. 57, 883-893 (2008).</li><li>Bekar, L. 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Gli autori desiderano rivelare che la tetrodotossina utilizzato in questi studi è stato acquistato da Abcam. Abcam ha avuto alcun coinvolgimento nelle ipotesi, design, o la raccolta di dati. Tutte le comunicazioni riguardanti la sponsorizzazione dei lavori da parte Abcam si è verificato dopo che il processo di peer review era completa.

I modelli di scala descritti rappresentano metodi pratici per la ricerca di plasticità a lungo termine del gruppo astrocitica I mGluRs. Imaging spontanei ed evocati Ca 2 + eventi offre un test sensibile per variazioni di astrociti attività Gq GPCR di misura, come prova ditta è stato stabilito che astrociti Ca 2 + aumenti si verificano a seguito di rilascio da IP 3 negozi R-sensitive valle di Gq GPCR attivazione di 10, 12, 17, 18. La percentuale degli astrociti nella popolazione risposta al gruppo I mGluR agonista e il modello di tali Ca 2 + risposte segnalano cambiamenti nel gruppo I mGluRs dagli astrociti. La tecnica specifica utilizzata per caricare astrociti con Ca 2 + indicatore è una considerazione importante nella progettazione di esperimenti per cercare variazioni di astrociti attività Gq GPCR. Bolo-carico o-bulk caricare più astrociti, o patch-clamp carico dei singoli astrociti può essere utilizzato per immagine Ca 2 + transitori negli astrociti. Ogni approccio offre alcuni vantaggi e svantaggi. Direttamente riempiendo astrociti con Ca 2 + indicatore tramite patch clamp consente l&#39;identificazione univoca della cella come astrociti, senza bisogno di un marcatore secondario, come SR-101. Consegna Patch-clamp dell&#39;indicatore permette anche la registrazione di Ca 2 + attività da piccoli scomparti astrociti comprese le folte processi sottili, potenzialmente più profonde nella sezione in cui le cellule sono più sani e con più interazioni intatti con sinapsi (a seconda della potenza del laser disponibile). Tuttavia, patch-clamp loading soffre di bassa capacità, come i dati sono raccolti una cella alla volta. Caricamento di massa, al contrario, permette un gran numero di astrociti deve essere caricato con Ca 2 + indicatore e ripreso simultaneamente. Tuttavia, solo gli astrociti in prossimità della superficie (&lt;20 micron) della sezione vengono caricati, con preoccupazione associatas sulla salute delle cellule e sinapsi intatti. Il protocollo bolo-loading contropressione qui presentata offre una via di mezzo, con relativamente elevato throughput e la possibilità di monitorare Ca 2 + attività più profondo all&#39;interno della fetta (40-75 micron). Un aumento significativo della percentuale di astrociti spontaneamente attivi con la tecnica bolo-loading si osserva rispetto al caricamento di massa, suggerendo che le connessioni tra sinapsi neuronali ei processi astrociti sono più completi 15. Con un buon carico, spesso si possono monitorare Ca 2 + attività nelle principali processi di astrociti (dati non riportati) o potenzialmente anche compartimenti più piccoli usando la microscopia a 2 fotoni. Tuttavia, la cura dovrebbe essere esercitata nei assegnare i processi più piccoli ad una particolare astrociti, in quanto i confini si fondono con la colorazione di fondo aspecifica. Un ulteriore problema con l&#39;utilizzo di procedure bulk-caricamento o bolo-caricamento è la necessità di un mar secondariaker per l&#39;identificazione degli astrociti. Mentre è noto da molti anni che gli astrociti preferenzialmente occupano AM estere Ca 2 + indicatori, il marcatore secondario SR-101 è spesso usato per verificare le cellule caricate come astrociti. SR-101 può di per sé modificare l&#39;eccitabilità intrinseca dei neuroni 29. Uso di SR-101 conferma la necessità di eseguire tutte astrociti Ca 2 + misurazioni in TTX per limitare possibili SR-101 effetti sulla eccitabilità neuronale. Supponendo che sia il controllo e gruppi sperimentali includono SR-101, il marcatore di per sé non dovrebbe tener conto degli effetti osservati negli astrociti Ca 2 + segnalazione seguenti manipolazione a lungo termine dei potenziali d&#39;azione neuronali. SR-101 può essere più di una preoccupazione in alto K + esperimenti, tuttavia, come si può ridurre la differenza tra K mM + 2,5 vs 5.0 mM K + se il tasso di cottura basale non è alterata in proporzione. Un approccio molto promettente per fornire Ca 2 + </sup&gt; Indicatore di astrociti è emerso recentemente che offre una valida alternativa agli approcci più tradizionali utilizzando Ca 2 + coloranti. Progressi significativi sono stati compiuti nel corso degli ultimi anni, con indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS) mirati al astrociti 30-32. GeCIS può essere spedito a astrociti in vivo microiniezione di vettori virali adeno-associati in una regione del cervello di interesse come l&#39;ippocampo. Espressione di GECIS si raggiunge dopo circa due settimane dopo l&#39;infezione virale 32. Ci sono numerosi vantaggi presentati dall&#39;uso di GeCIS negli astrociti. In primo luogo, i vettori sono mirati ad astrociti utilizzando un promotore specifico astrociti, in modo che le cellule marcate sono astrociti 32. In secondo luogo, il rapporto segnale-rumore-ora sembra paragonabile a quello ottenibile utilizzando consegna patch-clamp di colorante, ma senza l&#39;invasività di aver avuto una pipetta di patch sulla cella 32. In terzo luogo, gli indicatori possono essere delivered ed espresso in tessuti adulti, che è problematico utilizzando metodi di consegna caricamento di massa. Inoltre, l&#39;espressione è mosaico, offrendo la possibilità di differenziare tra più astrociti. Così, molti astrociti possono potenzialmente essere esposte contemporaneamente, mentre anche la registrazione nel soma e ramoscelli sottili allo stesso tempo. Pertanto, potenzialmente una singola tecnica potrebbe essere utilizzata in luogo di tre tecniche separate (caricamento di massa, bolo-carico, e patch-clamp carico) per registrare scalatura attività di astrocitici GPCR Gq, aumentando notevolmente l&#39;efficienza. Un potenziale svantaggio di utilizzare consegna virale-mediata di Ca 2 + indicatori astrociti è il possibile effetto sulla fetta di salute 32. I vettori virali adeno-associati di erogazione dei GeCIS hanno dimostrato in precedenza di causare gliosi reattiva di astrociti 33. Preparazione di fette di cervello in generale probabilmente inizia fasi iniziali della patologia, tra cui il rilascio di inflammatory molecole 10. Pertanto, in combinazione con i tempi di incubazione lunghi necessari per indurre scalatura dei recettori astrociti, uso di GeCIS forniti mediante vettori virali avrebbe bisogno di ricevere ulteriori considerazione nel contesto della salute fetta in questi tipi di esperimenti. Quando impiegando questo protocollo, è importante tenere presente che il tempo di applicazione di agonista per produrre una risposta varierà in funzione della disponibilità recettore. Per una data concentrazione di agonista, il tempo di applicazione dovrà essere più lungo se recettori hanno ridimensionato, e più breve se recettori sono scalati, per il farmaco di raggiungere un&#39;adeguata concentrazione nel tessuto per attivare recettori sufficiente per produrre un Ca 2 + risposta. Pertanto, tempi di applicazione della droga, e, potenzialmente, le loro concentrazioni, possono essere adattate a seconda della direzione prevista del ridimensionamento. Ad esempio, la concentrazione di agonista può essere necessario ridurre in case di TTX per evitare la saturazione risposte e aumentato dopo incubazione fette in alto K + a vedere anche una risposta. In particolare, la concentrazione DHPG stato spostato 5-15 mM dopo il trattamento TTX a 30-50 mM dopo il trattamento 5,0 mM K + per studiare Ca 2 + modelli di risposta, come 5-15 um era spesso troppo bassa per produrre risposte affidabili in astrociti dopo il ridimensionamento del gruppo I mGluRs. Registrazione di astrociti Ca 2 + attività fornisce alcuna prova diretta di inserimento recettore o di internalizzazione da o verso la membrana plasmatica. Tuttavia, sulla base della notevole somiglianza dei dati con i dati provenienti da studi precedenti in vitro che hanno esaminato la relazione diretta tra livelli di espressione Gq GPCR e spontanea ed evocata Ca 2 + transitori 21-24, l&#39;interpretazione più logica delle variazioni di Ca 2 + segnalazione è che i livelli di espressione del recettore di superficie astrociti hannocambiato. Un approccio complementare può essere una considerazione importante se si vuole fornire prove aggiuntive sul locus dell&#39;effetto di Ca 2 + attività. Una strategia che abbiamo usato è stato quello di esaminare l&#39;effetto della TTX incubazione in fettine di ippocampo di topi astrocitiche MrgA1R. Questi topi transgenici esprimono un Gq GPCR estera (MrgA1R) soltanto negli astrociti. Perché questo recettore non è nativo al cervello, non c&#39;è neurotrasmettitore endogeno presente per cambiare i suoi livelli di attività. Il lavoro precedente ha suggerito che questo recettore impegna stesso intracellulare molecole di segnalazione come gruppo endogeno I mGluRs nelle stesse astrociti 34. Dopo incubazione a lungo termine di fette di topi MrgA1R in TTX, differenze nelle risposte MrgA1R agonisti evocata rispetto al controllo littermate incubata fette fornirebbe la prova che l&#39;effetto sulla astrociti Ca 2 + attività è dovuta alle variazioni localizzate al recettore di superficie, in particolare se le risposte gruppo I mGluR sono ancora significativamente migliorato nelle stesse astrociti. Un&#39;alternativa, se la strategia forse più coinvolti sarebbe isolare astrociti dalle fette per analisi Western blot, finché una frazione di membrana potrebbe essere analizzato per modifiche nei livelli di espressione del recettore di superficie. Fluorescence Activated cell sorting (FACS) o citometria a flusso possono essere utili qui. Le possibili applicazioni di questa tecnica per lo studio dei neuroni, astrociti e interazioni astrociti-neuroni sono molti. Nei nostri esperimenti, unico gruppo DHPG evocato I mGluR astrociti Ca 2 + risposte sono state studiate, in isolati fettine di ippocampo acuti di topi giovani. Questa preparazione non solo le afferenze intatti (garanzie reali di Schaffer), ma anche i neuroni che danno origine a loro (cellule piramidali CA3), che permette di manipolare i tassi di cottura di questi neuroni glutamatergici sulle cellule post-sinaptiche (cellule piramidali CA1) e astrociti nello strato radiatum cui processi assoE Con ​​queste sinapsi. La fetta dell&#39;ippocampo acuta può non essere la migliore preparazione per manipolare i tassi di cottura di altri tipi di neuroni, tuttavia, come molte afferenze sono separabili dai neuroni che danno origine a loro. Tuttavia, può essere possibile in taluni preparati fetta di osservare la plasticità di altre astrocitiche sottotipi Gq GPCR. Ad esempio, le fette possono essere preparati con prosencefalo basale neuroni colinergici e le proiezioni per Hippocampus intatto. L&#39;incubazione di queste fette in TTX o elevata K + inciderebbe tassi di cottura basali dei neuroni colinergici, che porta alla scala di mAchRs negli astrociti di Oriens falda, che ricevono una parte significativa degli input colinergici 1. Un approccio alternativo ancora testato per studiare scalatura recettore astrocitaria all&#39;interno di una specifica area del cervello, con tutti i collegamenti intatti mentre si verifica scalatura, potrebbe essere quella di utilizzare un modello in vivo in cui un rilascio prolungato di TTX è ottenuta per impiantazione di un Plastic polimero Elvax 40W sopra la regione di interesse 35. Questo approccio è stato utilizzato in precedenza in uno studio su scala neuronale, ma dovrebbe essere applicabile anche a scala astrociti. Infine, con la giusta lettura, studi futuri potrebbero esaminare altre famiglie GPCR, comprese le variazioni di G s e G I GPCR. Si potrebbe prevedere astrociti GABA B G i GPCR di essere colpiti in seguito l&#39;inibizione di sparare nel proiettare a livello locale interneuroni GABA all&#39;interno di qualsiasi preparazione fetta. Sviluppo di nuovi indicatori di targeting altre molecole di segnalazione, come un indicatore in tempo reale del secondo messaggero cAMP, aprirebbe una nuova area di ricerca sulla comunicazione del recettore neurone-to-astrociti. Scalatura bidirezionale di mGluRs astrocitici dalla manipolazione dei tassi neurone cottura basali fornisce una misura della sensibilità degli astrociti di rilascio AP-mediata di neurotrasmettitore. Gli astrociti possono apparentemente percepire AP spontanee e glutamarilascio di te a Schaffer collaterale-CA1 sinapsi delle cellule piramidali anche quando extracellulare K + è all&#39;interno di un range fisiologico. Mentre l&#39;applicazione acuta di TTX non riduce la frequenza di astrociti spontanea Ca 2 + attività 18, 36, 37, il Ca 2 + attività tra gli astrociti nella popolazione diventa decorrelati 36, fornendo la prova che i recettori astrociti sono rilevatori AP. Questo suggerisce che gli astrociti percepiscono AP neuronali spontanee senza incidere sulla loro attività complessiva Ca 2 +. E &#39;ampiamente accettato che le concentrazioni intracellulari di IP 3 devono raggiungere un livello di soglia per stimolare IP 3 R in misura sufficiente a portare ad un rilevabile Ca 2 + elevazione. Potrebbe AP neuronali spontanee attivare GPCR astrociti senza produrre misurabili Ca 2 + elevazioni? Studi futuri potrebbero utilizzare Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) o un tecn simile<html> ique (come BRET) per esaminare la relazione tra proteina G accoppiamento al recettore (una misura di attivazione del recettore) e Ca 2 + rilascio dai depositi interni. BRET è stato ampiamente utilizzato in vitro per rilevare G accoppiamento 38 proteina-to-GPCR, anche se può essere un po &#39;di tempo prima che questa tecnologia sarà disponibile per l&#39;utilizzo nelle preparazioni dei tessuti intatti. E &#39;possibile che astrociti GPCR Gq vengono attivati ​​molto più frequentemente di quanto può essere registrato utilizzando gli strumenti di Ca 2 + di imaging attualmente disponibili. Oltre a rilevare potenziali d&#39;azione, astrociti GPCR Gq possono anche essere in grado di rilevare in miniatura rilascio quantico di neurotrasmettitori come riportato in un recente studio 39. Il metodo di scala bidirezionale qui descritto può essere usato in studi futuri per fornire una misura del grado in cui GPCR astrociti Gq rilevano quantale rilascio vescicolare del neurotrasmettitore, includendo bafilomycin A1 nel protocollo incubazione. S copi &quot;&gt; Finora, sono solo stati utilizzati i protocolli di scala in fettine di ippocampo di topi giovanile (p12-p18). Pertanto, è attualmente noto se il ridimensionamento del recettore astrociti potrebbe anche essere indotta nei tessuti ottenuti da topi adulti. Un recente studio interessante suggerisce che il gruppo espressione che mGluR negli astrociti diminuisce notevolmente dopo la prima settimana di età e continua a diminuire fino all&#39;età adulta, con bassi livelli di espressione del recettore negli astrociti adulti 40. Sarebbe pertanto interessante per determinare se mGluRs astrociti scala a seguito del lungo- inibizione termine di firing neuronale in adulti fettine di ippocampo di topo a livelli prossimi a quelli osservati negli astrociti dei topi giovani. Questa scoperta suggerisce che l&#39;espressione del recettore astrociti non è statica ad una certa età, ma può cambiare rapidamente a seconda dei livelli di attività neuronale. In contrasto ridotta espressione del gruppo I mGluRs in topi adulti, la prova sta emergendo che i recettori adrenergici, tra cui &amp; #945; 1A, 2A α, β e 1 sottotipi, sono prevalentemente espressi dagli astrociti nel cervello adulto 3, 4. Il adrenergico α 1A Gq GPCR può essere un bersaglio attraente per i futuri studi di comunicazione neurone-to-astrociti, tra questi se questi recettori sono sensibili alle variazioni dei tassi neurone cottura adrenergici.

Gli astrociti rispondono pochi secondi alla stimolazione dei neuroni o assoni neuronali con aumenti in citoplasmatica di Ca 2 + derivanti quasi esclusivamente dalla attivazione di astrocitiche GPCR Gq. Ad esempio, i recettori muscarinici 1, recettori dei cannabinoidi 2, α 1A recettori adrenergici 3, 4, e il gruppo I mGluRs (vedi sotto) sono tutti astrociti sottotipi Gq GPCR che acutamente rispondono all&#39;attività neuronale. Attivazione del gruppo astrociti I mGluRs è stata dimostrata più ampiamente, in seguito a stimolazione di afferenze neuronali glutammatergici in situ (come fettine ippocampali acute) 5-7, nonché in adulto corteccia topo in vivo dopo stimolazione sensoriale 8. L&#39;esito di attivazione di astrociti Gq GPCR segnalazione sulla biologia e fisiologia degli astrociti, neuroni, astrociti o interazioni dei neuroni è stato oggetto di dibattito 9-12. Sarà some tempo prima che la funzione di segnalazione dei recettori dei neuroni-to-astrociti è pienamente apprezzato. Mentre è chiaro che i neuroni possono attivare i recettori astrociti utilizzando protocolli sperimentali, ci sono aspetti della comunicazione neurone recettore-to-astrociti che rimangono poco conosciute. In primo luogo, la quantità effettiva di attività neuronale necessaria per attivare astrociti Gq GPCR non è ben definito, e in secondo luogo, la capacità dei recettori astrocitiche di esporre uso-dipendente plasticità ha ricevuto scarsa attenzione. Per cominciare a rispondere a queste domande, abbiamo recentemente sviluppato un protocollo per indurre scala bidirezionale di gruppo astrociti I mGluRs in fettine di ippocampo giovanili acute in risposta a cambiamenti a lungo termine nel potenziale d&#39;azione neuronale (AP)-dipendente l&#39;attività sinaptica. Analogamente a quanto è stato scoperto per bidirezionale plasticità omeostatica delle neuronali recettori del glutammato ionotropici 13, 14, gruppo astrociti I mGluRs scalare following blocco dei potenziali d&#39;azione neuronali e scala verso il basso quando l&#39;azione neuronale potenziale frequenza è aumentata 15. Questi cambiamenti compensativi recettori astrociti possono essere misurati registrando spontanea e evocate astrociti Ca 2 + transitori e confrontando le proprietà di questi eventi a quelli di astrociti in condizioni di controllo. In questo manoscritto, si descrive la metodologia completa per l&#39;utilizzo di questo protocollo, compresa la preparazione di fettine di ippocampo, condizioni acute di incubazione di indurre scala recettore astrociti, astrociti Ca 2 + colorante indicatore di carico, Ca 2 + tecniche di imaging utilizzando la microscopia confocale, e degli effetti attesi su astrociti attività Gq GPCR. Effetti prevedibili sulla astrociti Ca 2 + proprietà di segnalazione - che corrispondono a quelli registrati in precedenza in cellule in coltura trasfettate con diversi livelli di espressione di GPCR Gq - fornire una &quot;roadmap&quot; che può essere usato in studi futuri per eseguire il test per le modifiche comeespressione GPCR trocytic. Le ramificazioni e potenziali applicazioni per l&#39;uso di questa tecnica contribuiranno alla nostra comprensione delle interazioni astrociti-neuroni nel cervello sano e malato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Chamber Supplies</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:163px;">Brinkmann pipette storage container</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">03-491</td>
			<td style="width:159px;">Use the drawer portion as the incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:163px;">Electrical drill</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Flexible tubing</td>
			<td style="width:135px;">Tygon</td>
			<td style="width:131px;">R-3603</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Silicone seam sealant&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">Also called aquarium seam sealer</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Gas tank</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">95% oxygen, 5% carbon dioxide</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">Natural beveled pipette tip</td>
			<td style="width:135px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:131px;">1111-1000</td>
			<td style="width:159px;">Cut-to-fit to connect oxygenate lines</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">One-to-six lines manifold</td>
			<td style="width:135px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:131px;">64-0210 &#160;(MP-6)</td>
			<td style="width:159px;">For the microloader-manifold apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="65" rowspan="2" style="height:65px;width:163px;">Eppendorf microloader</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Eppendorf</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">5242 956.003</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit</td>
		</tr>
		<tr height="6">
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Floating Bubble Rack</td>
			<td style="width:135px;">Bel Art Scienceware</td>
			<td style="width:131px;">F18875-0400</td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">600 micron Sefar Nitex nylon mesh</td>
			<td style="width:135px;">ELKO filtering Co.</td>
			<td style="width:131px;">&#160;06-600/51</td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Krazy Glue</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:135px;">Baxter</td>
			<td style="width:131px;">1001936060</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">NaCl</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S271-3</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">P333-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:163px;">CaCl2</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">C79-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:163px;">MgCl2</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">M33-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:163px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S369-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S233-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:131px;">53188-07-1</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:131px;">401471000</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Tetrodotoxin citrate (TTX)</td>
			<td style="width:135px;">Ascent Scientific</td>
			<td style="width:131px;">Asc-055</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Sulforhodamine 101 (SR-101)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">284912</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">D128-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Pluronic Acid F-127</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td style="width:131px;">P6867</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:163px;">Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td style="width:131px;">O6807</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td style="width:135px;">Ascent</td>
			<td style="width:131px;">Asc-020</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Histamine</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">H7125</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">Carbamoylcholine chloride (Carbachol)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">C4382</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:163px;">Adenosine 5&#8217;-ATP disodium (Na-ATP)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A7699</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Dissection Tools</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Single-edge razor blade&#160;</td>
			<td style="width:135px;">GEM</td>
			<td style="width:131px;">62-0161</td>
			<td style="width:159px;">For bisection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Double edge razor blade</td>
			<td style="width:135px;">TED PELLA, INC.</td>
			<td style="width:131px;">121-6</td>
			<td style="width:159px;">For cutting slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Mayo Scissors, supercut</td>
			<td style="width:135px;">WPI</td>
			<td style="width:131px;">14010-15</td>
			<td style="width:159px;">For decapitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Fine iris scissors, straight</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">14094-11</td>
			<td style="width:159px;">For cutting the skull</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Iris forceps, curved</td>
			<td style="width:135px;">WPI</td>
			<td style="width:131px;">15915</td>
			<td style="width:159px;">To remove the skin and skull</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:163px;">Small spatula</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">To remove/transfer the brain</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11295-10</td>
			<td style="width:159px;">For hippocampus dissection</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Glass Pasteur pipette</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">13-678-20B</td>
			<td style="width:159px;">For transferring brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Pasteur pipette rubber bulb</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">03-448-22</td>
			<td style="width:159px;">For transferring brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Polystyrene 100-mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">25020</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Equipment</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Vibratome</td>
			<td style="width:135px;">Leica</td>
			<td style="width:131px;">VT 1200S</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="23" rowspan="2" style="height:23px;width:163px;">Water bath</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Fisher</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">ISOTEMP 210</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For warm incubation</td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:163px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:135px;">Narishige</td>
			<td style="width:131px;">PC-10</td>
			<td style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:131px;">Olympus Fluoview 1000</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:163px;">Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform</td>
			<td style="width:135px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:131px;">RC-26GLP</td>
			<td style="width:159px;">diamond bath with low profile</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Borosilicate glass pipette</td>
			<td style="width:135px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:131px;">TW150F-4</td>
			<td style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="25" rowspan="2" style="height:25px;width:163px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Sutter instrument</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">ROE-200</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:163px;">Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 &#181;m cellulose acetate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Costar</td>
			<td style="width:131px;">8161</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing plasticity of astrocytic receptors by manipulation of neuronal firing rates

Vicino a due decenni di ricerca ha stabilito che gli astrociti in situ e in vivo esprimono numerosi recettori accoppiati alla proteina G (GPCR) che possono essere stimolati da trasmettitore neuronally rilasciato. Tuttavia, la capacità dei recettori astrocitici esporre plasticità in risposta ai cambiamenti nell&#39;attività neuronale ha ricevuto scarsa attenzione. Qui si descrive un modello di sistema che può essere usato per scalare a livello globale su o giù gruppo astrocitaria I metabotropici recettori del glutammato (mGluRs) in fettine di cervello acuto. Incluso sono metodi su come preparare fettine di ippocampo parasagittali, costruire camere adatte fetta di incubazione a lungo termine, bidirezionale manipolare azione neuronale potenziale di frequenza, astrociti carico e processi astrociti con fluorescente Ca 2 + indicatore e misurare le variazioni di astrociti attività Gq GPCR per la registrazione astrociti spontanea ed evocata Ca 2 + eventi utilizzando la microscopia confocale. In sostanza, un &quot;calcio roadmap &quot;è previsto come misurare la plasticità del astrocitiche GPCR Gq. Applicazioni della tecnica per lo studio di astrociti sono discussi. Avere una comprensione di come la segnalazione del recettore astrociti è influenzato da cambiamenti nell&#39;attività neuronale ha importanti implicazioni sia per la normale funzione sinaptica, così come i processi sottostanti disturbi neurologici e malattie neurodegenerative.

Risultati rappresentativi in Figura 3 mostrano l&#39;effetto di incubazione di acuta fettine ippocampali di topo in TTX per 4-6 ore in astrociti sr Ca 2 + attività. I dati comprendono sia spontanee Ca 2 + transitori e di gruppo DHPG evocato I mGluR Ca 2 + risposte, dalle fette incubati in controllo ACSF vs ACSF più TTX. Altro che caratteristiche morfologiche tipiche di base, assemblaggio processo stellate e di piccole dimensioni soma (~ 10 micron), astrociti sono identificati nella sr dalla sovrapposizione del Ca 2 + indicatore di OGB-01:00 con il marcatore astrociti selettiva SR-101 19 20 ( Figura 3A). Le caselle numerate oltre corpi cellulari di astrociti corrispondono alla fluorescenza numerata su tracce di tempo mostrati in figura 3B. Il gruppo 1 mGluR agonista (RS)-3.5-DHPG viene applicato per determinare gli effetti di scala specifici sul gruppo 1 mGluRs negli astrociti. Per discriminare tra Physiology nella specificità dell&#39;effetto di scala al gruppo 1 mGluRs contro altri GPCR GQ, un cocktail di agonisti viene applicato al termine di ogni dell&#39;esperimento. Qui abbiamo usato 10 micron ciascuno di Gq GPCR agoniste istamina, cloruro carbamylcholine (carbachol) e adenosina 5&#39;-ATP sodio (Na-ATP). Il cocktail agonista serve anche come controllo positivo per identificare vitali, gli astrociti reattivi nel caso in cui le cellule non rispondono alle DHPG, presumibilmente perché tali astrociti particolari non esprimono una quantità sufficiente di recettore per suscitare una risposta a DHPG. Abbiamo utilizzato diverse concentrazioni di DHPG, tra cui 5 micron e 15 micron (Figura 3B), così come 30 micron e 50 micron (Figura 4A) per assistere a rivelare cambiamenti nel gruppo astrocitica I mGluRs. Il rapporto tra cellulari Ca 2 + risposte e livelli di espressione Gq GPCR è stato esaminato in precedenza in vitro 21-24. In primo luogo, lasoglia di rispondere ad una particolare concentrazione agonista dipende dalla densità di recettori espressi da ciascuna cella. In una popolazione di cellule, più celle rispondono con un Ca 2 + elevazione di una data concentrazione di agonista quando le cellule vengono trasfettate con maggiore densità di recettori. Dopo aver incubato fette in TTX, la percentuale di astrociti nella popolazione rispondere ad una concentrazione fissa di aumenti agonisti (Figure 3B e 3C). Abbiamo scoperto che 5 micron e 15 micron DHPG rivelano evidenti differenze nella percentuale di astrociti reattivi tra il controllo e cellule trattate TTX, mentre il 30 e 50 micron DHPG sono tenuti a confrontare gruppi di risposte che ho mGluR a 5,0 K mm + trattati vs controllo cellule (Figura 4A). Il rapporto tra modelli di Ca 2 + risposta astrociti e la concentrazione agonista è stato esaminato anche in situ. Aumentare l&#39;agonistaconcentrazione sposta il modello del Ca 2 + risposta in astrociti dal singolo picco Ca 2 + elevazioni per multipeak e plateau Ca 2 + elevazioni 25-27. Sulla base di questi risultati precedenti, abbiamo previsto che il modello di risposta ad una singola concentrazione di agonista si sposterà se ci sono cambiamenti nel livello di espressione del recettore. Quindi, a seconda di quale dei due metodi di ridimensionamento viene utilizzata (inibizione neuronale o aumentando), la concentrazione di agonista necessaria per produrre un particolare modello di risposta aumenta o diminuisce. Ad esempio, astrociti incubate in TTX spostare la loro DHPG-evocato Ca 2 + modello di risposta a più plateau di tipo Ca 2 + elevazioni e rispondere ad abbassare le concentrazioni di agonisti rispetto ai controlli astrociti (Figura 3C). Tenendo conto dei precedenti studi, queste osservazioni suggeriscono che il gruppo mi mGluR livelli di espressione del recettore in astrociti è aumentato. Tempo di salita e insorgenza (latenza) di Ca 2 + prospetti sono stati anche dimostrato di correlare direttamente ai cambiamenti nei livelli di espressione Gq GPCR in cellule in coltura 22-24. Elevati livelli di espressione del recettore determinano latenze di risposta brevi e tempi di salita più veloci, riduzione della densità dei recettori produce l&#39;effetto opposto. Per astrociti incubate in TTX, Ca 2 + transitori evocati dalla applicazione di DHPG hanno significativamente più veloce salire volte rispetto al astrociti incubate nel controllo ACSF (Figura 3D). Come precedentemente accennato, ampiezze di Ca 2 + risposte agonisti evocati rimangono invariati indipendentemente dalla concentrazione di agonista o il modello di scala 15 (Figura 3D). Oltre ai cambiamenti osservati attivando direttamente gruppo I mGluRs con DHPG, astrociti spontanea Ca 2 + attività è significativamente influenzata da questa manipolazione. Osserviamoaumento da 2,26 volte della percentuale di astrociti spontaneamente attivi incubate in TTX contro controllo. Si tratta di un aumento da solo il 12,9% degli astrociti controllo espositrici attività spontanea nel soma al 42,1% nel TTX incubato astrociti (Figura 3E). Poiché è noto che l&#39;attività GPCR mostra &quot;intrinseca&quot; o costitutiva in assenza di agonista 21, 26, 28, e che il livello di questa intrinseche attività aumenta con l&#39;aumentare dei livelli di espressione del recettore, questi dati suggeriscono che la densità di astrocitici aumenti Gq GPCR seguente riduzione a lungo termine in azione neuronale potenziale cottura. Simile alle risposte agonisti evocati, i tempi di salita dei spontanee Ca 2 + prospetti sono anche aumentati (Figura 3E). Dati rappresentativi che utilizzano il secondo protocollo, incubazione in elevati di potassio extracellulare (5,0 mm), è raffigurato in Figura 4. Un aumento del K + extracellulare 2,5-5,0 mM risultati in un aumento significativo basale azione neuroni CA3 potenziale frequenza 15. Sono necessari Concentrazioni più elevate di DHPG (30 mM e 50 mM) per evocare il gruppo I mGluR di Ca 2 + risposte dagli astrociti incubati in alta potassio (Figure 4A e 4B). Questo è coerente con un livello ridotto di gruppo I mGluR reattività in astrociti a seguito di un aumento a lungo termine in potenziali d&#39;azione neuronali. Inoltre, il modello di risposta evocata ad una concentrazione fissa di DHPG sposta dalle risposte plateau simile a deboli risposte singolo picco (Figura 4B). Esaminando la percentuale di astrociti spontaneamente attivi nelle due condizioni di potassio rivela che meno astrociti incubate in alto K + sono spontaneamente attiva rispetto alla condizione di controllo (Figura 4C). Questo effetto è in opposite direzione della condizione TTX in cui viene aumentata la percentuale di astrociti esibiscono spontanee Ca 2 + elevazioni. Infine, sia evocata e spontanee Ca 2 + elevazioni avere tempi di salita più lenta negli astrociti incubate in alto K + contro la condizione di controllo (Figure 4C e 4D). Complessivamente questi dati suggeriscono che astrociti livelli di espressione Gq GPCR scala bidirezionale a seconda del livello di potenziale azione attività neuronale nel corso di un periodo di tempo prolungato. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Fabbricazione fetta camera di incubazione e configurare. (A) La porzione cassetto di un contenitore di stoccaggio pipetta Brinkmann insieme con il suo coperchio a tenuta d&#39;aria viene utilizzato per costruire la camera di incubazione fetta. (B) Druscello un foro nel lato del contenitore circa 1 ¼ dalla parte superiore e ¼ dal lato. Montare in un pezzo di tubo flessibile. (C) Collegare l&#39;apparecchio microloader-collettore alla estremità interna del tubo flessibile. Nota cut-to-fit naturale punta di pipetta 200 microlitri (freccia bianca). (D) sei 20 microlitri Eppendorf microloaders sono tagliati da posa di un collettore linea uno a sei per creare un apparato microloader-collettore. (E) Eseguire due piccoli fori sul coperchio. (F) Un galleggiante Bubble Rack per fare il titolare fetta. (G) Le &quot;gambe&quot; inferiore della bolla cremagliera mobile vengono rimossi in modo che un pezzo di materiale di nylon mesh può essere incollato al fondo. (H) Riempire la camera di incubazione con sufficiente quantità di ACSF in modo che i carri titolare fetta. Regolare la lunghezza del tubo in modo che le punte delle microloaders possono riposare in un angolo del pavimento della camera. Quando si posiziona la camera di incubazione inbagnomaria, il livello dell&#39;acqua nella vasca deve essere allo stesso livello come il ACSF nella camera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" target="_blank">clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Stima della salute slice. (A) Una fetta ippocampo aspetto sano con contrasto di interferenza differenziale (DIC) ottica. Fette sani hanno una superficie liscia, aspetto vellutato e una percentuale elevata di neuroni CA1 piramidali sani. Nota: i dendriti apicali sporgenti in falda radiatum. Patch-clamp di neuroni che assomigliano a quelli mostrati qui rivelano un basso potenziale di membrana a riposo (-61 a -62 mV) in standard da 2,5 mm K + ACSF con pochi potenziali d&#39;azione spontanea. Potenziale di membrana e cottura tariffe variano in funzione della exextracellulare K + (Xie et al. 15.) Le frecce indicano astrociti putativi. Abbreviazioni: sr, strato radiatum; s.py., strato pyramidale. Barra della scala, 10 micron. (B) fette malsano avranno un alta percentuale di morti neuroni CA1 piramidale, che hanno l&#39;aspetto di uova fritte (frecce bianche indicano nuclei di neuroni morti - il &quot;tuorlo&quot; dell&#39;uovo fritto). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Registrazione amplificato attività Gq GPCR e gruppo evocata I mGluR Ca 2 + risposte dopo inibizione a lungo termine di AP neuronali mediante incubazione in TTX. (A) Immagini rappresentative di cellule nel campo di registrazione incubate in control condizioni (pannelli superiori) o in TTX (pannelli inferiori) che hanno preso Oregon Verde BAPTA-01:00 Ca 2 + colorante indicatore (pannelli a sinistra) e SR-101 (pannelli centrali). Barra della scala è di 10 micron. Sovrapposizione di entrambi i segnali (&quot;merge&quot;) indica che gli astrociti carico con Ca 2 + indicatore. Le scatole sono disegnati sopra individuo soma astrociti registrare intensità di fluorescenza nel tempo del canale verde per monitorare Ca 2 + attività negli astrociti. (B) le tracce del campione dalle caselle di registrazione in A) di Ca 2 + attività negli astrociti. Gli astrociti incubate in TTX mostra un aumento dell&#39;attività spontanea e più robusto gruppo evocata I mGluR Ca 2 + risposte come evidenziato dai cambiamenti nel modello di risposta. Esempi di unico picco (cerchio), multipeak (rettangolo), e plateau (rettangolo punteggiato) sono mostrati Ca 2 + transitori. (C) I cambiamenti nei modelli di risposta sono particolarmente evidenti utilizzando diversi concentrazioni del gruppo I mGluR agonista DHPG. Più multipeak e plateau risposte sono evidenti dopo incubazione in TTX rispetto al controllo ad una data concentrazione agonista. (D) Aumento tempi di Ca 2 + risposte DHPG evocati sono più veloci negli astrociti incubate in TTX rispetto al controllo (pannello superiore), mentre le ampiezze non cambiano (pannello inferiore), indicativo di &quot;tutto-o-none&quot; ampiezze di risposta una volta la soglia di rispondere è stato raggiunto. (E) tempi di astrociti spontanea salita Ca 2 + transitori sono anche più veloce in TTX incubate vs controllo incubato astrociti (pannello superiore), mentre la percentuale di astrociti nella popolazione esporre spontanee Gq GPCR di Ca 2 + aumenta l&#39;attività (pannello inferiore). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 4. Registrazione astrociti diminuita attività Gq GPCR e di gruppo evocato io mGluR Ca 2 + risposte seguenti aumento a lungo termine in AP neuronali mediante incubazione in elevata di potassio extracellulare. (A) tracce rappresentativi di astrociti Ca 2 + registrazioni da fettine incubate in 5,0 mm K + ACSF a depolarizzare neuroni e aumentare la loro frequenza di scarica basale rispetto ai controlli ACSF (2,5 mm K + ACSF). Astrociti incubati con 5.0 mM K + ACSF mostra meno spontanee somatiche Ca 2 + transitori e più debole DHPG evocati risposte rispetto al astrociti incubate nel controllo ACSF. (B) Un confronto tra modelli di risposte evocate a più concentrazioni di DHPG rivela tipi di risposta più deboli dopo l&#39;aumento a lungo termine in AP neuronali. (C) una riduzione della percentuale di astrociti nel POlazione esibendo spontanea Ca 2 + attività si osserva dopo incubazione a lungo termine ed elevata a K + rispetto ai controlli ACSF (pannello superiore), mentre i tempi di salita dell&#39;attività spontanea diventano più lenti (pannello inferiore). (D) Aumento tempi di astrociti evocati Ca 2 + risposte a diverse concentrazioni di DHPG diventato più lento successivo trattamento 5.0 mM K + rispetto ad astrociti incubate nel controllo ACSF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a>

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Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Qui si descrive un adattamento dei protocolli usati per indurre plasticità omeostatica nei neuroni per lo studio della plasticità dei recettori accoppiati a proteina G astrociti. Utilizzati di recente per esaminare i cambiamenti nel gruppo astrociti I mGluRs nei topi giovani, il metodo può essere applicato per misurare il ridimensionamento di diversi GPCR astrocitiche, in tessuto dai topi adulti in situ e in vivo, e di ottenere un migliore apprezzamento della sensibilità dei recettori astrocitici a cambiamenti nell&#39;attività neuronale.

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

inducing-plasticity-astrocytic-receptors-manipulation-neuronal-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K Views.  University of California Riverside.  Qui si descrive un adattamento dei protocolli usati per indurre plasticità omeostatica nei neuroni per lo studio della plasticità dei recettori accoppiati a proteina G astrociti. Utilizzati di recente per esaminare i cambiamenti nel gruppo astrociti I mGluRs nei topi giovani, il metodo può essere applicato per misurare il ridimensionamento di diversi GPCR astrocitiche, in tessuto dai topi adulti in situ e in vivo, e di ottenere un migliore apprezzame...

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Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Preparazione di oligomeriche β-amiloide 1-42 E induzione di Impairment plasticità sinaptica in fettine di ippocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Ricerca

Neuroscienze

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

Mappatura dei circuiti neuronali inibitori da fotostimolazione scansione laser

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Diffusione laterale e esocitosi delle proteine ​​di membrana in neuroni in coltura valutata utilizzando Recovery fluorescenza e fluorescenza-loss photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Elettroencefalografia simultanea, in tempo reale misura della concentrazione di lattato e la manipolazione Optogenetic di attività neuronale nella corteccia cerebrale Rodentia

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Derivando La durata di Liquidazione glutammato con una analisi Deconvoluzione delle Correnti Transporter astrociti

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

Un<em&gt; In Vitro</emPreparazione muscolare-nervosa&gt; Adult mouse per studiare le proprietà di cottura delle afferenze muscolari

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high dose, whereas sequential injections of a subconvulsive dose have been used for the development of chemical kindling, an epilepsy model. A single low-dose injection of PTZ induces a mild seizure without convulsion. However, repetitive low-dose injections of PTZ decrease the threshold to evoke a convulsive seizure. Finally, continuous low-dose administration of PTZ induces a severe tonic-clonic seizure. This method is simple and widely applicable to investigate the pathophysiology of epilepsy, which is defined as a chronic disease that involves repetitive seizures. This chemical kindling protocol causes repetitive seizures in animals. With this method, vulnerability to PTZ-mediated seizures or the degree of aggravation of epileptic seizures was estimated. These advantages have led to the use of this method for screening anti-epileptic drugs and epilepsy-related genes. In addition, this method has been used to investigate neuronal damage after epileptic seizures because the histological changes observed in the brains of epileptic patients also appear in the brains of chemical-kindled animals. Thus, this protocol is useful for conveniently producing animal models of epilepsy.

This protocol describes a method of chemical kindling with pentylenetetrazole and provides a mouse model of epilepsy. This protocol can also be used to investigate vulnerability to seizure induction and pathogenesis after epileptic seizures in mice.

Modello di topo indotta da pentylenetetrazole accensione

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADDs) have become the most popular chemogenetic approach used in modern neuroscience. Most studies deliver the ligand clozapine-N-oxide (CNO) using a single intraperitoneal injection, which is suitable for the acute activation/inhibition of the targeted neuronal population. There are, however, only a few examples of strategies for chronic modulation of DREADD-controlled neurons, the majority of which rely on the use of delivery systems that require surgical intervention. Here, we expand on two non-invasive strategies for delivering the ligand CNO to chronically manipulate neural population in mice. CNO was administered either by using repetitive (daily) eye-drops, or chronically through the animal&#39;s drinking water. These non-invasive paradigms result in robust activation of the designer receptors that persisted throughout the CNO treatments. The methods described here offer alternatives for the chronic DREADD-mediated control of neuronal activity and may be useful for experiments designed to evaluate behavior in freely moving animals, focusing on less-invasive CNO delivery methods.

Here we describe two non-invasive methods to chronically control neuronal activity using chemogenetics in mice. Eye-drops were used to deliver clozapine-N-oxide (CNO) daily. We also describe two methods for prolonged administration of CNO in drinking water. These strategies for chronic neuronal control require minimal intervention reducing animals&#8217; stress.

Strategie non invasive per la manipolazione cronica dell'attività neuronale controllata da DREADD

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...