Questo metodo che consente di risparmiare tempo riduce la variabilità tra cicli di procedure immunoistochimiche negli studi di neuroscienze per ottimizzare la visualizzazione dell'anatomia e delle proteine e dei tessuti locali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che riduce il tempo necessario per la criosezione e montare il tessuto cerebrale combinando più cervelli in un unico blocco congelato. Mentre questa tecnica è ottimizzata per sezioni coronali del cervello dei roditori, può essere adattata a sezioni sagittali o trasversali o diversi tipi di tessuti come muscoli o fegato.
A seguito di una perfusione trascardica riuscita, post-fissare il cervello degli animali in una fiala da 25 millilitri del 4% di paraformaldeide in PBS per 24 ore. Dopo questo, usa le forcep con punta smussata per rimuovere il cervello dalla paraformaldeide. Trasferire il cervello in una fiala con circa 20 millilitri di soluzione di saccarosio al 30% in TBS.
Mantenere il cervello e la soluzione fino a quando non affondano sul fondo del flaconcino. Quindi, metti un bicchiere di vetro da 500 millilitri su un letto di ghiaccio secco in un secchio di ghiaccio. Quindi versare da 300 a 400 millilitri di isopentane nel becher.
Mantenere l'isopentane tra -45 e -50 gradi Celsius. Sul piano del banco, riempire uno stampo di incorporamento monouso approssimativamente a metà pieno con temperatura di taglio ottimale o composto OCT. Utilizzare un ago per rimuovere eventuali bolle d'aria dallo stampo.
Utilizzare le forcep smussate per rimuovere il primo cervello dalla soluzione di saccarosio. Quindi utilizzare una nuova lama di rasoio per rimuovere il cervelletto e i bulbi olfattivi prima di separare gli emisferi. Quindi, dai al cervello un sistema di denominazione numerica.
Usa le forcep smussate, raccogli il cervello per essere posizionato in posizione due e orientalo con il lato da tagliare prima rivolto verso l'alto. Abbassare il cervello nello Strumento di personalizzazione di Office e utilizzare le pinzette per regolarne la posizione fino a quando non si trova in modo indipendente. Una modifica chiave di questa tecnica è lo spazio vuoto in posizione uno.
Questo spazio è designato per consentire una facile identificazione dell'orientamento dei megabrain e quindi identificare l'animale associato a ciascun cervello. Dopo che tutti i cervelli sono stati posizionati nello stampo, aggiungere un OCT sufficiente per coprire la parte superiore del cervello, quindi utilizzare un ago per rimuovere eventuali bolle d'aria. Tenere l'angolo dello stampo con le forcep assicurando che le forcep non diventino parzialmente sommerse nello Strumento di personalizzazione di Office.
Quindi, abbassare lo stampo nell'isopentane in modo che il terzo inferiore dello stampo sia sommerso. Dopo 30 secondi, abbassare l'intero stampo nell'isopentane e rilasciarlo dalle forcep. Dopo tre minuti, utilizzare le forcep per rimuovere lo stampo dall'isopentane.
Avvolgere immediatamente lo stampo e il suo contenuto in un foglio di alluminio ed etichettarlo in modo appropriato. Trasferire il megabrain in un congelatore negativo di 20 gradi Celsius per un minimo di 24 ore. In primo luogo, impostare la temperatura dell'armadio criostato su -19 gradi Celsius.
Rimuovere il megabrain dal congelatore e posizionare nel criostato. Quindi posizionare un mandrino e due sottili pennelli con punta nel criostato. Successivamente, etichettare le diapositive con il numero di identificazione del megabrain e il numero di diapositiva e posare le diapositive sullo scaldas vetrino.
Quindi, scartare il megabrain e utilizzare una lama di rasoio per tagliare gli angoli dello stampo. Distribuire un sottile strato di OCT sul mandrino. Quindi posizionare rapidamente il megabrain sul mandrino.
Dopo che lo Strumento di personalizzazione di Office è completamente congelato, applicare uno strato di due millimetri di OCT intorno ai lati del megabrain e consentirgli di correre lungo i lati sul mandrino. Utilizzare una lama di rasoio per rimuovere qualsiasi OCT in eccesso dai lati e dal fondo del mandrino. Per prima cosa, posizionare il mandrino montato con il megabrain sulla testa del mandrino del criostato.
Quindi impostare il criostato allo spessore desiderato. Tagliare lo PTOM e il tessuto in base alle esigenze per raggiungere la regione cerebrale desiderata per la raccolta dei tessuti. Quindi abbassare la piastra antirollio fino a quando non si appoggia sul palco e ruotare la maniglia del criostato per prendere una singola sezione.
Sollevare lentamente la piastra antirollio, facendo attenzione che la sezione tissutale non venga toccata. Utilizzare delicatamente i pennelli per srotolare la sezione del tessuto fino a quando non è piatta. Se necessario, tenere piatto lo Strumento di personalizzazione di Office utilizzando i pennelli per evitare la laminazione.
Quindi rimuovere la diapositiva dallo scaldascivole e posizionare il puntatore del mouse sul lato dell'etichetta della diapositiva verso il basso sulla sezione del megabrain e consentirgli di attenersi alla diapositiva. Applicare rapidamente una goccia di PBS alla sezione tissutale. Utilizzando un pennello a punta fine immerso in PBS, spazzolare eventuali bolle nella sezione del tessuto e aprire il tessuto in modo che sia piatto sullo scivolo.
Infine, posizionare la diapositiva sullo scaldascivolo per asciugare per 45 minuti e conservare la diapositiva a -80 gradi Celsius. In questo protocollo, il tessuto cerebrale di nove animali è stato preparato e criosezione contemporaneamente. Dopo la criosezione, è possibile effettuare la colorazione H&E per valutare la qualità della crioprotezione.
Risultati rappresentativi della molecola di adattatore di legante calcio ionizzato una o colorazione Iba1 di microglia mostrano una colorazione coerente tra ogni cervello di studio su un singolo megabraina. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di monitorare costantemente la temperatura congelando il megabrain per evitare crepe o scongelarsi e quindi ricongelare il tessuto che porta a un'integrità anomala del tessuto. Non è consigliabile separare diversi gruppi di trattamento in megabraine separate in quanto ciò può creare varianza tra i gruppi durante la colorazione e ridurre la distorsione e la soggettività durante l'imaging e l'analisi.
Non dimenticare che lavorare con la paraformaldeide può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare PBE e lavorare in un cappuccio devono sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
