Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation in concessione # IOS-1025627 e dal National Institutes of Health in concessione # 1R21NS078582-01 a JAW

Questo protocollo utilizza due configurazioni (Figura 1) per acquisire quattro letture differenti raccolti da mosche sottoposte ad una infezione batterica. Queste uscite sono 1) sonno / veglia comportamento, 2) esito di sopravvivenza; 3) carica batterica al volo e 4) misurazione in tempo reale di attività giornalista NFκB in vivo. In combinazione con gli strumenti genetici che sono disponibili in Drosophila, queste misurazioni forniscono informazioni meccanicistica sul legame molecolare tra la funzione immunitaria e comportamento. 1. Misurare l&#39;attività locomotoria e del sonno in mosche <ol><li> La configurazione utilizzata per misurare l&#39;attività locomotoria e dormire mosche, che include il sistema di attività di monitoraggio Drosophila (DAM2, Trikinetics), incubatori, camera oscura, e la preparazione degli animali da esperimento e tubi di attività, è stato descritto in precedenza 6. Lo stesso approccio è utilizzato qui, con qualche piccola modifica. <ol class="lalpha"><li&gt; L&#39;illuminazione del incubatore è controllata dalla stessa incubatore. Pertanto, è importante sincronizzare l&#39;impostazione del tempo tra computer e incubatori. </li><li> Provette dell&#39;attività sono pulite per il riutilizzo mediante ebollizione su piastra calda in acqua deionizzata. Una piccola quantità di detersivo viene aggiunto per primo l&#39;ebollizione, i tubi sono ben sciacquati e bollito altre due volte. Se filato viene utilizzato per collegare il tubo, tubi all&#39;attività usati (contenente cibo, cera, fly e filo) può essere pulito senza previa rimozione del filato. </li></ol></li><li> Prima di iniziare un esperimento, culture posto contenenti tardi pupa in scena mosche in incubatrici per tre o quattro giorni per adattarsi all&#39;illuminazione sperimentale e altre condizioni ambientali. Luce: condizioni di oscurità o la costante sono stati comunemente usati per misurare il comportamento del sonno. In questo esempio, mosche sono acclimatati a luce costante per eliminare l&#39;influenza dell&#39;orologio circadiano sulla risposta immunitaria e comportamento 2,7,8. Come descritto in Figura 1A </strong&gt;, di carico 1-4 mosche giorno di vita nell&#39;attività Trikinetics DAM2 monitor come descritto 6 e record per un minimo di tre giorni prima l&#39;infezione. </li></ol> 2. Infect mosche con un ceppo patogeno di batteri <ol><li> Il protocollo qui descritto è specifico per S. marcescens, che sono facili da coltivare e mantenere. Protocolli per la conservazione a lungo termine e condizioni di coltura per altre specie batteriche possono variare. S. marcescens sono memorizzati in 15-50% glicerolo a -80 ° C. Per preparare per conservazione a lungo termine, mescolare 2 volumi di coltura batterica durante la notte (OD 600 = 0.5 - 1.0) a 1 volume di autoclavato glicerolo al 50% in tubi microcentrifuga da 1,5 ml. Questo si tradurrà in una concentrazione finale di glicerolo 17%. Memorizzare provette a -80 ° C. Per preparare a breve termine in uso fonte di batteri, raschiare il brodo congelato con una sterile 200 microlitri puntale ed eseguire un tre vie striscia su una piastra di agar LB. Incubare la piastra durante la notte a 37 &amp; dad esempio, C per ottenere colonie isolate. Conservare la piastra a 4 ° C. Un giorno prima che l&#39;infezione in programma, scegliere una singola colonia dalla piastra di agar LB con una sterile 200 microlitri puntale e immergere la punta in una provetta contenente 5 ml di terreno LB. Crescere batteri durante la notte, o fino a 16 ore all&#39;interno di un agitatore incubatore a 37 ° C e 250 rpm fino a raggiungere la fase di crescita esponenziale. Misurare la concentrazione con uno spettrofotometro a OD 600. La concentrazione in questa fase va da 0,5 a 1. Se la concentrazione è troppo elevata, eseguire sottocolture i batteri e crescere per altre diverse ore per ottenere una concentrazione ottimale. Eseguire la procedura nei pressi di una sorgente di fiamma. Alcuni ceppi batterici sono progettati per la resistenza antibiotica e vengono coltivate e selezionate per antibiotico appropriato aggiunto al mezzo. S. marcescens (ATCC # 8100) non sono resistenti agli antibiotici e quindi coltivate in mezzo sterile senza antibiotico. Per verificare tecnica sterile, fare un finto culri senza batteri come controllo. La soluzione di infettare mosche contiene batteri (diluito a OD 600 = 0.1) e coloranti alimentari 1% (blu brillante FCF) in PBS. Preparare una soluzione iniettabile di controllo aggiungendo quantità equivalente di terreno LB utilizzato in soluzione infezione e 1% colorante alimentare blu in PBS. Conservare le soluzioni su ghiaccio. </li><li> Preparare gli aghi per l&#39;iniezione di vetro le mosche. Tirare capillari di vetro (od = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) a una punta fine con un estrattore micropipetta (Narishige). Sotto un microscopio per dissezione, utilizzare una pinza sottile per rompere la punta dell&#39;ago in modo che l&#39;apertura è grande abbastanza da riempire con fluido iniezione aspirazione mediante una siringa, ma abbastanza piccolo per minimizzare i danni al volo durante il processo di iniezione. Dopo la rottura della punta, la grandezza della punta dovrebbe essere di circa 40-50 micron. L&#39;ago di vetro è attaccato ad una siringa di plastica 3 cc con un pezzo di tubo. Il flusso del fluido di iniezione viene controllata manualmente applicando una pressione positiva o suzione con la siringa. Evitare di contaminare il tubo di gomma con iniezione di fluido, come l&#39;apparato siringa viene utilizzata sia per infezione e iniezioni di controllo. </li><li> Anestetizzare mosche mettendoli su un CO 2 pad. CO 2 viene fatto passare attraverso un contenitore sigillato di acqua per umidificare il pad e di ridurre l&#39;elettricità statica, che può complicare la manipolazione di mosche sul pad. Iniettare mosche colpendo l&#39;ago di vetro nella regione al di sopra della scutello del torace dorsale. Il passaggio del mezzo iniezione al volo viene verificata dal colorante alimentare - mosche diventano blu in quanto gli spread coloranti degli alimenti attraverso il sistema. La dose di batteri che ricevono mosche può essere quantificato come descritto nella sezione 3 di seguito. Alcuni disegni sperimentali includono un gruppo di controllo che riceve pregiudizio asettico, iniettando le mosche con coloranti PBS e cibo, ma senza batteri. </li></ol> 3. Determinare la carica batterica Un approccio per evaluating la risposta immunitaria contro l&#39;infezione batterica è determinare l&#39;infezione batterica postale carico. D. melanogaster è un grande modello per determinare questo parametro, perché al volo tutto può essere omogeneizzato per stimare il numero totale di batteri all&#39;interno di un individuo. La logica alla base di questo protocollo è che quando coltivate su un mezzo solido come brodo Luria (LB) agar in una piastra (piastra LB), un singolo batterio forma una colonia visibile distinguibile. Pertanto, omogeneizzando mosche infette in terreno LB liquido, generando diluizioni seriali del omogenato, e diffondere l&#39;omogenato diluito su piastre LB, il numero di cellule batteriche infettare una mosca può essere determinato. Un gruppo di controllo di mosche iniettati con PBS e colorante alimentare ma senza batteri dovrebbero essere utilizzati per verificare che l&#39;infezione non è stato contaminato con altre specie batteriche. Non ci dovrebbero essere colonie sulla piastra LB agar in questa condizione. <ol><li> Autoclavare tutti materiali che saranno utilizzati per questoprocedura prima di eseguire la fase effettiva omogeneizzazione. Questo comprende 200 puntali ul tagliati con le forbici, i media LB, e pestelli utilizzati per la omogeneizzazione. Preparare piatti versando autoclavato LB / agar in media 10 centimetri piatti Petri sterili almeno 1 giorno prima omogeneizzazione mosche. </li><li> Anestetizzare e raccogliere le mosche in provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare le provette su ghiaccio. </li><li> Eseguire l&#39;omogeneizzazione nei pressi di una fiamma per evitare la contaminazione. Una omogeneizzazione di controllo contenente le mosche senza infezione è consigliabile soprattutto quando si utilizza un ceppo batterico, come S. marcescens, che non sono resistenti agli antibiotici. Omogeneizzare un minimo di 2 gruppi di 10 mosche per ogni condizione sperimentale. Il numero di mosche utilizzati per omogenato è determinata dallo sperimentatore. Alcuni gruppi hanno utilizzato una mosca per omogeneizzato, che è utile per valutare la variazione della carica batterica tra le mosche singole 8, mentre altri ricercatori hanno utilizzato 3-10 mosche per omogenatodi confrontare tra genotipo o dalla condizione sperimentale 9-12. <ol class="lalpha"><li> Aggiungere 400 microlitri LB medio a ciascuna provetta contenente mosche e omogeneizzare con un piccolo motore e pestello (Kontes). </li><li> Utilizzando sterilizzati puntali tagliati, di serie diluire 1:10 omogeneizzato con l&#39;aggiunta di 20 pl omogeneizzato LB / media batterica a 1,5 microprovetta microlitri contenente 180 microlitri media LB. Consigli per il taglio pipette prevenendo l&#39;ostruzione da detriti volanti e assicura che un volume adeguato in fase di trasferimento. </li><li> Fattore di diluizione viene determinato empiricamente e dipende dal genotipo della mosca, il ceppo batterico utilizzato, e condizione sperimentale. Per il tipo selvatico vola infettati con S. marcescens, utilizzare diluizioni di 1:10 2 o 1:10 3 per le mosche omogeneizzati immediatamente dopo l&#39;infezione, e le diluizioni di 1:10 4 o 1:10 5 per mosche omogeneizzato 24 ore dopo l&#39;infezione. </li><li> Aggiungere 100 microlitri LB / media batterica dal microfonotubi rocentrifuge contenenti la diluizione finale e la diffusione del mezzo su una piastra di LB con sfere di vetro (VWR) per garantire una distribuzione uniforme. </li><li> Eliminare le palle di vetro in 100% EtOH soluzione. Posizionare le piastre LB in un incubatore a 37 ° C durante la notte. </li><li> Come passaggio facoltativo, utilizzare un sistema di imaging con luce visiva per ottenere un&#39;immagine delle piastre LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Contare il numero di colonie o sulla stessa piastra o dall&#39;immagine della piastra utilizzando lo strumento conta su Photoshop software (Adobe Photoshop CS3). </li><li> Calcolare il numero di unità formanti colonia per volo usando la formula: [N / (N * D * v)] * V, dove n = numero di colonie cresciute sulla piastra LB; N = numero delle mosche riunito in un unico provetta, D = fattore di diluizione, e v = volume della soluzione si diffuse su ogni piatto; V = volume iniziale del omogeneizzato. </li></ol></li></ol> 4. Valutare sonno e durata di sopravvivenza dopo l&#39;infezione <ol><li> Permosche che non sono raccolte per misurare carica batterica, continuare a monitorare il comportamento per altri 7-10 giorni. Durata sopravvivenza è influenzata dal genotipo della mosca, condizioni ambientali, e le specie batteriche utilizzate per l&#39;infezione. </li><li> Dopo circa 10 giorni, interrompere l&#39;esperimento, scaricare ed elaborare i dati comportamentali come descritto in precedenza 6. Insomniac2 software personalizzato, che si basa in Matlab, viene utilizzato per analizzare i parametri del sonno. È importante eliminare mosche morte dall&#39;analisi comportamentale. Normalmente, questo limita analisi entro il primo giorno dopo l&#39;infezione, a seconda del tipo di infezione e genotipo mosca. Morte nel saggio è indicata dal tempo tutti i conteggi attività arrivato a zero. Per facilitare l&#39;analisi della sopravvivenza, Drosonex, software personalizzato scritto in Microsoft Visual C + + 6.0, viene utilizzato per elaborare file di dati dal sistema DAM Trikinetics. Le relazioni software come file di Excel, la durata di sopravvivenza di ogni volo (in ore), compila attività datuna da tutti i monitor in un foglio singolo, e riporta la percentuale vola sopravvivere nel tempo impostato dall&#39;utente. I file di Excel sono progettati per integrarsi in altri pacchetti software statistici per ulteriori analisi. </li></ol> 5. Misurare l&#39;attività NFκB durante l&#39;infezione usando un saggio Luciferase Reporter Transgenico kB-luc mosche utilizzato in questa analisi sono stati generati come descritto in precedenza Kuo et al., 2010 2. Brevemente, il kB-luc giornalista contiene 8 ripetizioni di una sequenza NFκB vincolante che sono stati inseriti in un promotore a monte di una cornice di lettura aperta luciferasi. <ol><li> Regolare mosche alle condizioni di illuminazione sperimentali, come descritto nella sezione 1.2. In questo esempio, 1-4 giorni vecchi kB-luc mosche sono alloggiati in fiale contenenti meno di 5%, 2% agar e terreno alimentare messo in luce costante (LL) per 2 giorni per raggiungere la stessa età di altre mosche durante l&#39;infezione. </li><li> Preparare una micropiastra a 96 pozzetti per le mosche. Ogni pozzetto contiene due strati di supporto alimentare (figura 2), lo strato superiore contiene luciferina, il substrato di luciferasi. Aggiungere 300 pl di un 5% di saccarosio, soluzione di agar al 2% in ogni pozzetto e lasciare solidificare. Successivamente, aggiungere un 50 microlitri strato superiore ad ogni saccarosio e contenente il 5%, 1% agar, e 2 mM luciferina (Gold Biotechnology, Inc.). Concentrazioni luciferina utilizzati per attività reporter di misurazione in Drosophila hanno variato in letteratura, e sono stati a partire da 100 pM 13. La concentrazione richiesta può essere determinato empiricamente. Tra gli strati erogazione alimentari, coprire la piastra con un panno maglia fine per facilitare l&#39;asciugatura mantenendo la sterilità. La piastra deve essere permesso di asciugare completamente, fino a un&#39;ora, in modo da evitare che le mosche di rimanere bloccati in goccioline di condensa. Perché luciferina è sensibile alla luce, evitare di esporre le piastre alla luce più del necessario. </li><li> Applicare un film trasparente adesivo (Top-Seal-A; Perkin Elmer) ad una piastra da 96 pozzetti micropozzetti e perforare con un ago fine in una quantità di 2 fori per pozzetto. Questi buchi non solo permetterà ricambio d&#39;aria in ogni pozzetto, ma fornirà anche un modo per anestetizzare le mosche su base individuale. Utilizzando una lama affilata e regolo, introdurre un taglio tra ogni colonna. Ciò fornirà un modo semplice per caricare / scaricare mosche in gruppi di 8 alla volta. Per caricare mosche nella piastra Elisa, togliere i flaconcini dal termostato e vola anestetizzare un CO 2 pad. Carico vola uno ad uno ad ogni pozzetto colonna per colonna. Se una mosca inavvertitamente si blocca al sigillo adesivo, lasciare al volo da solo in quanto sono spesso in grado di liberarsi senza l&#39;intervento. Riportare la micropiastra per l&#39;incubatrice in LL per 8-24 ore di adattarsi al nuovo ambiente e di consumare il substrato luciferina. </li><li> Batteri Cultura, S. marcescens, e preparare una soluzione di infezione come descritto sopra. </li><li> Anestetizzare tvola utilizzando una punta micropipetta collegato a una bassa pressione di CO 2 righe. Posizionare la punta della micropipetta direttamente sopra i fori di ventilazione realizzati per ciascun pozzetto. Fare attenzione per assicurare che la pressione di CO 2 è sufficientemente elevata per anestetizzare il volo, ma abbastanza basso per evitare lesioni al volo. In gruppi di otto, singolarmente trasferire ciascun volo a un pad CO 2, e infettare come descritto sopra. Dopo l&#39;infezione, ritornare ogni mosca al suo originale bene e sigillare la micropiastra. </li><li> Misura luminescenza (TopCount NXT-Luminescenza e contatore a scintillazione, Perkin-Elmer). Il contatore luminescenza TopCount contiene una cassetta di impilamento dei piatti, che consente per le letture programmate e automatico continuo con incrementi desiderati per un certo periodo di tempo (di solito fino a cinque giorni). Questa funzione non è disponibile su tutti gli strumenti, e la raccolta di dati per esperimenti eseguiti con altri strumenti possono essere quindi meno frequenti. Il contatore luminescenza è alloggiato in un room a temperatura controllata e pianificazione illuminazione. Sistemare i piatti nel cassetto di impilamento, impilare le tavole contenenti le mosche tra chiari lastre vuote per far sì che le mosche ricevere luce. Programmare il luminometro secondo le specifiche del produttore di raccogliere le letture ogni ora per un minimo di 24 ore. In questo esempio, i rilevatori sono programmati per leggere ogni pozzetto per 10 sec e per esprimere il risultato come conteggi (unità arbitrarie) al secondo. Questo valore è una media su 3 letture al bene. Esportare i file di dati in un foglio di calcolo e di eseguire una analisi standard, graficamente i risultati di luminescenza. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+photoreceptive+circadian+clocks+throughout+Drosophila.">Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila.</a> Science. 278, 1632-1635 (1997).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster.">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27, 628-639 (2004).</li><li>Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+method+to+study+Drosophila+sleep.">A video method to study Drosophila sleep.</a> Sleep. 31, 1587-1598 (2008).</li><li>Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+in+sleep+and+other+pathophysiological+sequelae+of+influenza+virus+infection+in+naive+and+immunized+mice.">Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice.</a> J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).</li><li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state.">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li><li>Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila.">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31, 465-472 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo delinea un approccio per studiare come comportamento, particolarmente dormire, è connesso a parametri di risposta immunitaria. Questi parametri includono la carica batterica, esito di sopravvivenza, e l&#39;attività NFκB come misurato da un reporter luciferasi in vivo. Insieme essi danno informazioni su quanto bene una mosca in grado di combattere l&#39;infezione. Carica batterica e dei risultati di sopravvivenza sono parametri di risposta immunitaria che comportano una misura semplice in <...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Attrezzatura </td></tr><tr><td> Incubatori </td><td> Percival Scientific, Inc. </td><td> I30BLLC8 I36VLC8 </td><td> Ogni incubatore in grado di eseguire luce programmato / orari di temperatura è appropriato. </td></tr><tr><td> Drosophila attività il Monitor </td><td> Trikinetics Inc., Waltham, MA </td><td> DAM2 </td><td> Come descritto altrove 6, questo sistema richiede un interfaccia con il computer, il software e altri accessori. </td></tr><tr><td> Tubi di vetro Pyrex </td><td> Trikinetics Inc., Waltham, MA </td><td> PGT-5x65 </td><td></td></tr><tr><td> Micropiastre scintillazione e contro luminescenza </td><td>Perkin Elmer </td><td> TopCount NXT 12 Rilevatore </td><td> Qualsiasi micropiastre in grado di rilevare luminescenza può essere utilizzato per questo tipo di saggio reporter. TopCount contiene rivelatori multipli e un impilatore automatico, è in grado di essere programmato per leggere continuamente da piastre multiple. </td></tr><tr><td> FluorChem 8900 </td><td> Alpha Innotech </td><td></td><td> Imaging di colture batteriche è facoltativo; qualsiasi sistema di imaging digitale con capacità di luce visibile è sufficiente. </td></tr><tr><td> Micropipetta Puller </td><td> Tritech Research, Inc. </td><td> Narishige PC-10 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Forniture </td></tr><tr><td> Vetro borosilicato Capillari </td><td> Mondo Precision Instrument Inc. </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml Siringa </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305482 </td><td></td></tr><tr><td> Aghi per siringhe </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305196 </td><td> G 18 - tagliare la punta dell&#39;ago per evitare di danneggiare il tubo. </td></tr><tr><td> Tubo in silicone, id (0,030 &quot;) od (0,065&quot;) Spessore parete (0.018 &quot;) </td><td> VWR </td><td> 60985-706 </td><td> Usato per fissare aghi capillare di vetro ad una siringa </td></tr><tr><td> Rubinetto a 3 vie </td><td> Azienda americana Pharmaseal </td><td> K75 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes pellet Pestello motore a batteria </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749540-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes pellet Pestello </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> Palle di vetro da 3 mm </td><td> VWR </td><td> 26396-630 </td><td></td></tr><tr><td> Micropiastre Microlite 1 + </td><td> Thermo Scientific </td><td> 7571 </td><td> Select piastre da 96 pozzetti che sono appropriati per luminescenza - devono essere opachi. </td></tr><tr><td> TopSeal-A :96-pozzetti </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005185 </td><td> Micropiastre Press-On Film di tenuta adesiva </td></tr><tr><td> D-Luciferin, sale di potassio </td><td> Oro Biotechnology, Inc. </td><td> Lucna </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Software </td></tr><tr><td> Insomniac2 </td><td> Disponibile su richiesta agli autori </td><td> personalizzato, scritto da Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) </td><td> Matlab software basato che è stato utilizzato per l&#39;analisi di routine del sonno 2,6,11 </td></tr><tr><td> Drosonex </td><td> Disponibile su richiesta agli autori </td><td> personalizzato, scritto da Thomas Coradetti (Software Sidewalk) </td><td> Un MSVC6 programma per PC utilizzato per l&#39;analisi della sopravvivenza da file di dati grezzi raccolti con laTrikinetics sistema </td></tr><tr><td> Photoshop CS3 </td><td> Adobe </td><td></td><td> Utile per ottenere il numero di ufc / piastra da immagini digitali (opzionale) </td></tr></tbody></table>

quantitative measurement of the immune response and sleep in drosophila

Una complessa interazione tra la risposta immunitaria e comportamento host è stato descritto in una vasta gamma di specie. Sonno eccesso, in particolare, si verifica come risposta a infezione nei mammiferi e 1 è stata recentemente descritta in Drosophila melanogaster 2. E &#39;generalmente accettato che il sonno è vantaggioso per l&#39;host durante un&#39;infezione e che è importante per il mantenimento di un robusto sistema immunitario 3,4. Tuttavia, prove sperimentali che supporta questa ipotesi è limitata 4, e la funzione del sonno eccesso durante una risposta immunitaria è chiaro. Abbiamo usato un approccio multidisciplinare per affrontare questo problema complesso, e hanno condotto studi nel sistema semplice modello genetico, il moscerino della frutta Drosophila melanogaster. Usiamo un test standard per misurare il comportamento locomotorio e dormire in mosche, e dimostrare come questo test viene utilizzato per misurare il comportamento di mosche infected con un ceppo di batteri patogeni. Questo saggio è utile anche per monitorare la durata della sopravvivenza in mosche singoli durante un&#39;infezione. Ulteriori misure della funzione immunitaria includono la capacità di mosche per cancellare una infezione e l&#39;attivazione di NFκB, un fattore di trascrizione chiave che è fondamentale per la risposta immunitaria innata in Drosophila. Sia esito di sopravvivenza e la clearance batterica durante l&#39;infezione insieme sono indicatori di resistenza e tolleranza alle infezioni. Resistenza si riferisce alla capacità di mosche per cancellare un&#39;infezione, mentre la tolleranza viene definita come la capacità di accoglienza per limitare i danni di un&#39;infezione e quindi sopravvivere nonostante alti livelli di patogeni all&#39;interno del sistema 5. Monitoraggio in tempo reale delle attività in corso di infezione NFκB permette di comprendere un meccanismo molecolare di sopravvivenza durante l&#39;infezione. L&#39;uso di Drosophila in questi saggi semplici facilita le analisi genetiche e molecolari di sonnoe la risposta immunitaria e come questi due sistemi complessi sono reciprocamente influenzati.

<ol><li> Infezione favorisce il sonno. In questo esempio, Canton-S (CS) mosche wild type e mosche mutanti privi di un gene NFκB, Relish (Rel E20) 14, sono stati caricati in due DAM2 controlla l&#39;attività (n = 32 per ogni genotipo) ed infettati come descritto sopra. Mosche sono stati mantenuti in luce costante per eliminare l&#39;influenza dell&#39;orologio circadiano sul comportamento e infezione 2,7,8. I mutanti sono stati E20 Rel isogenized al CS come descritto in precedenza <su...

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Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Per comprendere un collegamento tra la risposta immunitaria e il comportamento, si descrive un metodo per misurare il comportamento motorio in<em&gt; Drosophila</em&gt; Durante l&#39;infezione batterica, nonché la capacità di mosche di montare una risposta immunitaria per la sopravvivenza di controllo, carica batterica, e in tempo reale delle attività di un regolatore chiave dell&#39;immunità innata, NFκB.

Misurazione quantitativa della risposta immunitaria e nel sonno<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

15.3K Views.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. Per comprendere un collegamento tra la risposta immunitaria e il comportamento, si descrive un metodo per misurare il comportamento motorio in Drosophila Durante l'infezione batterica, nonché la capacità di mosche di montare una risposta immunitaria per la sopravvivenza di controllo, carica batterica, e in tempo reale delle attività di un regolatore chiave dell'immunità innata, NFκB.

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Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development of vaccines and therapeutics1,2,3. Here, we describe a method for the detailed phenotypic and functional analyses of cellular immune responses, specifically intracellular cytokine production by CD4+ and CD8+ T cells as well as the individual memory subsets. We obtained precise quantitative and qualitative measures for the production of interferon gamma (INF-) and interleukin (IL) -2 in both CD4+ and CD8+ T cells from the rhesus macaque PBMC stimulated with PMA plus ionomycin (PMA+I). The cytokine profiles were different in the different subsets of memory cells. Furthermore, this protocol provided us the sensitivity to demonstrate even minor fractions of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell subsets within the PBMC samples from rhesus macaques immunized with an HIV envelope peptide cocktail vaccine developed in our laboratory. The multicolor flow cytometry technique is a powerful tool to precisely identify different populations of T cells 4,5 with cytokine-producing capability6 following non-specific or antigen-specific stimulation 5,7.

We demonstrate the utility of multicolor flow cytometry for detailed phenotypic and functional characterization of total as well as memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in rhesus macaques, the ideal model for HIV/AIDS vaccine studies.

Multicolor Citometria a Flusso di analisi Cellular risposta immunitaria in macachi Rhesus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

An Introduction to vespe parassite di<em&gt; Drosophila</em&gt; E la risposta immunitaria antiparassitari

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Quantificazione della risposta Burst respiratoria come un indicatore di Innate Immune Salute in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

L&#39;utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

In Analisi Vitro di Myd88 mediata Cellular Immune Response to West Nile virus mutante Strain Infezione

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infezione

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Analisi qualitativa e quantitativa della sinapsi Immune nel sistema umano utilizzando Imaging citometria a flusso

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

Due-fotone videomicroscopia Imaging dei leucociti durante la risposta immunitaria nel fegato Lipopolysaccharide-trattati del topo

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...