Gli autori ringraziano il Regional College VA-MD di medicina veterinaria per fornire assistenza di base e tecnico per questo progetto. Questo lavoro è supportato da un NIH Career Development Award (K01DK092355).

Tutti gli studi sono stati condotti sotto l&#39;approvazione del Comitato Istituzionale Cura ed uso (IACUC) per Virginia Tech e secondo il National Institutes of Health Guide per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. 1. Endotracheale (it) inoculazione di LPS tramite Amministrazione orofaringea <ol><li> Assicurarsi che ogni animale è identificato in modo univoco utilizzando un punzone orecchio, marchio auricolare, o altro metodo istituzionalmente approvato. </li><li> Registrare il peso corporeo iniziale e la temperatura corporea per ogni animale. </li><li> Preparare il brodo di lavoro di LPS. Ciascun topo riceverà una dose di 50 microlitri di 1 mg / kg di LPS in 1x tampone fosfato salino (PBS). Animali trattati Mock riceveranno una dose di 50 ml di 1x PBS. </li><li> Preparare una camera adeguato per la somministrazione di isoflurano utilizzando il seguente metodo goccia. Linee guida istituzionali variano per quanto riguarda l&#39;uso di isoflurano e di altri agenti anestetici e prima initiatzione eventuali studi, le persone devono contattare il Dipartimento della loro istituzione di animali Cura / Welfare per assicurare le tutte le linee guida siano adeguatamente soddisfatte. Se il metodo goccia dell&#39;isoflurano non è un&#39;opzione, altri agenti anestetici sono alternative accettabili. <ol><li> In un armadietto di sicurezza appropriato, applicare circa 3 ml di isoflurano per un tovagliolo di carta assorbente piegato e posto sul fondo di un bicchiere da 500 ml. </li><li> Mettere un piccolo pezzo di foglio di alluminio sulla parte superiore del tovagliolo di carta e coprire il becher con un coperchio trasparente. </li></ol></li><li> Preparare gli strumenti e reagenti che verranno utilizzati durante la esso inoculazione. Posizionare l&#39;elastico che garantirà gli animali testa sul cavalletto intubazione. Questa procedura richiede un paio di pinze diritte, una coppia di pinze inclinate o curve, e una pipetta p200 con punte. </li><li> Carico 50 ml di LPS nel puntale e posto in un luogo facilmente raggiungibile, accanto allo stand intubazione. </li><li> Anestetizzare il mouseponendo l&#39;animale nella camera di isoflurano e coprendo la camera col coperchio trasparente. Osservare modelli di respirazione dell&#39;animale, che sarà rapida e superficiale quando in primo luogo posto nella camera. L&#39;animale sarà sufficientemente anestetizzati quando i tassi di respirazione avvicinano 1 respiro / 2 sec, che di solito è raggiungibile in 30 secondi di mettere nella camera. Il mouse deve essere anestetizzato come indicato nel protocollo animali approvato con il metodo goccia isoflurano. </li><li> Rimuovere il mouse anestetizzato dalla camera e sospendere l&#39;animale sul intubazione stare dai suoi incisivi anteriori. Assicurare che l&#39;animale è trattenuto in modo sicuro e la bocca e la lingua sono accessibili. </li><li> Garantire delicatamente la lingua con le pinze diritte. Afferrare la linguetta con le pinze ad angolo e tirare delicatamente fuori dalla bocca fino a quando una leggera resistenza. Questa azione è sufficiente a bloccare l&#39;epiglottide e accedere alla trachea. </li><li> Mentre si continua a tenere la lingua inposizione estesa, somministrare la dose da 50 ml di LPS nella parte posteriore della gola e coprire immediatamente narici dell&#39;animale con un dito guantato. L&#39;LPS sarà visibile nella parte posteriore della gola finché il mouse inala. </li><li> Continuare a coprire le narici e tenere la lingua esteso per 5-10 respiri supplementari. </li><li> Rimuovere il mouse dal supporto intubazione e posizionare l&#39;animale torna in una nuova gabbia fino a quando non recupera dall&#39;anestesia. </li><li> Controllo marker associati alla progressione della malattia. Il peso corporeo e la temperatura corporea devono essere monitorati ogni 4-8 ore per la durata dello studio. Allo stesso modo, valutare le caratteristiche comportamentali e dei sintomi clinici associati a un aumento della morbilità. </li><li> Per valutare la progressione della malattia, topi raccolto in specifici punti temporali successivi l&#39;esposizione LPS. Punti temporali tipici per la raccolta a seguito di esposizione LPS includono 0, 6, 12, 18, 24, e 48 hr. Per valutare il recupero e la sopravvivenza, valutare i topi per 7 bisys post-inoculazione. </li></ol> 2. Siero e di lavaggio broncoalveolare Fluid (BALF) Collezione <ol><li> Sacrifica il mouse utilizzando un metodo istituzionalmente riconosciuto. </li><li> Mettere l&#39;animale sul dorso e assicurarlo ad un bordo necroscopia, idealmente 0,5 in (1,27 cm) di altezza. </li><li> Bagnare l&#39;intero mouse con il 70% di etanolo. </li><li> Usando una siringa da 1 ml con un ago 27 G, condurre una puntura cardiaca prima di effettuare qualsiasi incisioni. Dovrebbe essere possibile ritirare 500-800 microlitri di sangue intero da un singolo mouse. </li><li> Rimuovere l&#39;ago dalla siringa e trasferire il sangue intero di un prelabeled provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Per la raccolta del siero, permettono il sangue intero a coagulare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Oltre alla raccolta siero, questa procedura può anche essere modificato incorporando un anticoagulante nel tubo e siringa, prima di raccogliere il sangue intero, per studiare cellule immunitarie circolanti. </li><li> Effettuare una incisione orizzontale aattraversare la lunghezza della cavità peritoneale e una incisione verticale dalla cavità peritoneale alla mascella inferiore del mouse. </li><li> Utilizzando pinze, afferrare entrambi i lati della incisione e tirare delicatamente la pelle dalla cavità peritoneale e toracica sottostanti. </li><li> Fare una grande incisione lungo la lunghezza della cavità peritoneale dai genitali allo sterno, avendo cura di evitare di tagliare il diaframma. Spostare delicatamente l&#39;intestino nella cavità peritoneale per consentire l&#39;accesso a uno dei reni. </li><li> Tagliare la vena renale che porta al rene per servire come un punto di drenaggio per perfusione. </li><li> Nick diaframma usando forbici, avendo cura di evitare i polmoni e il cuore, per esporre il lato sinistro del cuore. </li><li> Perfusione manualmente cuore utilizzando una siringa da 10 ml con un ago 27 G e soluzione PBS 1x. Evitare di applicare una forza eccessiva durante la perfusione per garantire che la soluzione salina non è costretto nei polmoni. Il sangue residuo deve defluire dalla incisione della vena porta.</li><li> Tagliare con cautela la cassa toracica lungo lo sterno usando contundenti / forbici spuntate, avendo cura di evitare di tagliare il cuore ei polmoni. Accidentalmente taglio polmoni durante questa procedura riduce significativamente la quantità di BALF raccolti e si tradurrà in una incapacità di gonfiare correttamente polmoni con fissativo. </li><li> Isolare delicatamente il cuore ed i polmoni di distanza dalla gabbia toracica con pinze. Tagliare con cautela ogni sezione della gabbia toracica con le forbici smussate / smussato il più vicino alla colonna vertebrale come possibile e rimuovere completamente entrambe le sezioni. </li><li> Separare le ghiandole salivari con pinze o rimuoverli con le forbici, per esporre la trachea. </li><li> Tagliare con cura i muscoli che si sovrappongono la trachea con le forbici. È essenziale che la trachea non essere tagliata durante questo processo. </li><li> Utilizzando le forbici, separare la clavicola sovrastante la trachea. </li><li> Afferrare il timo con pinze e sollevare il tessuto lontano dal cuore. Togliere il timo con le forbici, avendo cura dievitare di tagliare il cuore oi polmoni. </li><li> Fai una piccola incisione orizzontale nella trachea 1-2 anelli sotto la laringe con le forbici angolate (45-90 º angolo, tagliente / sharp). L&#39;incisione dovrebbe essere grande abbastanza per fissare saldamente la cannula. </li><li> Inserire la cannula in modo che l&#39;estremità rastremata estende 2-3 anelli tracheali sotto l&#39;incisione e fissare la cannula in posizione con una sutura di seta. Assicurarsi che la sutura passa tra la trachea e l&#39;esofago ed è ben teso sulla cannula. </li><li> Riempire una siringa da 1 ml di 1 ml di soluzione salina tamponata Hanks (HBSS) e inserire delicatamente la sua luer nella cannula. </li><li> Con un movimento lento, ma costante, iniettare ~ 900 microlitri nella trachea, gonfiando i polmoni, e ritirare immediatamente la HBSS. Posizionare il BALF recuperato in un tubo da 15 ml. </li><li> Ripetere questo lavaggio 2 volte supplementari per raccogliere circa 3 ml di BALF per analisi future. Conservare il BALF su ghiaccio oppure a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol><ol><li> Inserire una siringa da 10 ml in stand inflazione polmone. Assemblare il tubo al luer, il luer al rubinetto, e il rubinetto alla siringa. Assicurarsi che il rubinetto è in posizione chiusa. La siringa 10 ml servirà come un serbatoio a gravità. Il serbatoio deve essere fissato al basamento inflazione 4,75 in sopra l&#39;animale e la parte superiore del serbatoio deve estendersi 10.5 sopra l&#39;animale. </li><li> Riempire la siringa con soluzione neutra formalina tamponata. Assicurarsi che la siringa è completamente riempito con il fissativo. </li><li> Inserire un telo assorbente sotto l&#39;estremità aperta del tubo e aprire il rubinetto per consentire il fissativo per riempire il tubo. Una volta che il fissativo inizia a scorrere dal tubo, chiudere immediatamente il rubinetto e riempire la siringa verso l&#39;alto con fissativo. E &#39;importante che la siringa sia completamente riempito di fornire la giusta quantità di pressione per il gonfiaggio polmonare. </li><li&gt; Passare delicatamente un secondo pezzo di filo di sutura sotto la trachea, circa 1-2 anelli tracheali sotto dell&#39;estremità della cannula. </li><li> Legare un unico nodo sciolto nella sutura; tuttavia, non tirare il nodo stretto. </li><li> Inserire il tubo dalla inflazione del mouse stare nella cannula. </li><li> Aprire il rubinetto e permettono ai polmoni di riempirsi dall&#39;inflazione gravità. </li><li> Una volta che i polmoni raggiungono il loro massimo livello di inflazione, tirare la sutura stretto e legare un secondo nodo. </li><li> Chiudere il rubinetto e rimuovere il tubo dalla cannula. </li><li> Rimuovere delicatamente la cannula dalla trachea afferrando la sutura con un paio di pinze e tenendo la cannula con le dita. Saldamente tirare la sutura verso la cavità toracica e la cannula indietro verso il naso del mouse. </li><li> Afferrare la trachea o le suture con una pinza e sollevare la trachea lontano dalla cavità del collo. </li><li> Sever caudale trachea alla sutura legato con le forbici spuntate. </li><li> Una volta che la tracheostomiaa è libero dai tessuti sottostanti, cominciano a tirare la trachea lontano dal mouse. Sollevare delicatamente i polmoni dalla cavità toracica. </li><li> Tagliare con cautela il tessuto connettivo che tiene i polmoni nella cavità toracica. Continuare a tirare la trachea lontano dal corpo del mouse e applicare una forza costante verso l&#39;alto mentre il taglio dei collegamenti sottostanti. Fare attenzione a non tagliare i polmoni. Si noti che il cuore deve essere lasciato attaccato ai polmoni utilizzando questo metodo. </li><li> Una volta che i polmoni sono stati rimossi, metterli in 10 ml di formalina. </li><li> Rimuovere una sezione di coda di topo per la genotipizzazione. </li><li> Smaltire la carcassa del mouse seguendo le linee guida istituzionali appropriati. </li></ol> 4. Valutazione citochine <ol><li> Centrifugare il sangue intero, raccolto sotto passo 2.5, a 12.000 xg per 5 min a isolare il siero. Trasferire il siero di un prelabeled 1,5 ml provetta da microcentrifuga e conservare a -80 ° C. </li><li> Valutare il Serui livelli di citochine m di ELISA o un kit simile. Diluire il siero 1:05-01:20 in un tampone di diluizione appropriata, a seconda del dosaggio, seguendo le istruzioni del fabbricante. Le diluizioni devono essere empiricamente determinato prima di eseguire la maggior parte dei campioni. </li><li> A causa del basso volume di siero raccolti, ridurre il volume del campione caricato sulla piastra ELISA metà. Ad esempio, la maggior parte dei test ELISA commerciali utilizzano 100 volumi microlitri di standard e campioni. Per conservare i campioni, carico 50 ml di standard e siero diluito per bene. </li><li> Centrifugare la BALF in una centrifuga da tavolo refrigerata a 200 xg per 5 min. Trasferire il surnatante libero cella in due prelabeled provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -80 ° C. </li><li> Valutare citochine BALF da ELISA o un kit simile senza diluire. </li><li> Conservare siero inutilizzato e BALF a -80 ° C. </li></ol> 5. La colorazione differenziale e BAL Cellularità valutazione <ol><li> Dopo BALF centrifugazione e rimozione completa HBSS, la lisi dei globuli rossi pellet con soluzione salina ipotonica. Risospendere le cellule in 900 ml di acqua distillata. Aggiungere immediatamente 100 ml di 10x PBS. </li><li> Lisi singolarmente ogni campione. Se i campioni contengono quantità eccessive di globuli rossi, le cellule possono essere in pellet nella centrifuga da tavolo a 400 xg per 5 min e il protocollo sangue rosso lisi cellulare può essere ripetuto. </li><li> Determinare la cellularità BALF totale della sospensione 1 ml utilizzando un emocitometro sotto 10X o 20 ingrandimenti con Trypan Blue colorazione. Valutare e presentare questi dati come cellule / ml. </li><li> Preparare i materiali per la cytospin e colorazione differenziale. Etichettare vetrini da microscopio standard, con una matita o una penna resistente ai solventi. Fissare le diapositive in una staffa cytospin e imbuto. Fissare il gruppo di scorrimento nel rotore cytospin. </li><li> Cytospin 150 ml di BALF a 100 xg per 5 min. Se la densità cellulare è troppo grande per efficacementevalutare la morfologia cellulare, ridurre il volume filata giù sui fogli. Lasciare i vetrini all&#39;aria secca durante la notte. </li><li> Macchia differenziale le diapositive seguendo i protocolli manufatti. Lasciare i vetrini all&#39;aria secca durante la notte. I vetrini coprioggetto utilizzando Permount e valutare i vetrini con un microscopio dotato di un obiettivo 20X e 40X. </li><li> Raccogliere le restanti cellule per analisi successive, come FACS, microscopia elettronica, microscopia confocale, estrazione di RNA per la valutazione dell&#39;espressione genica, e / o estrazione di proteine ​​per western blot. </li></ol> 6. Valutazione Istopatologia <ol><li> Preparare i polmoni per la valutazione istopatologica. Dopo 24-48 ore di fissazione in formalina, ventralmente orientare l&#39;intero polmoni gonfiati ed inclusi in paraffina. Tagliare i blocchi risultanti per esporre la principale vie di conduzione. </li><li> Per migliorare la precisione di punteggio, posizionare i polmoni nella stessa posizione e tagliare ogni blocco di cedere la visualizzazione longitudinale massima di tegli intrapolmonare principale vie aeree assiale. Da questo punto, tagliate 5 micron sezioni seriali e macchia con ematossilina ed eosina (H &amp; E). Sezioni aggiuntive possono essere tagliati e preparati per l&#39;ibridazione in situ utilizzando protocolli standard. </li><li> Valutare istopatologia utilizzando un sistema di punteggio semiquantitativo basato sui seguenti parametri infiammatori, intaccate tra 0 (assente) e 3 (grave): mononucleare polimorfonucleati e infiltrazione di cellule; Airway iperplasia delle cellule epiteliali e lesioni; stravaso; perivascolare e cuffing peribroncheolar; e la percentuale del polmone coinvolto con infiammazione. Polmone esame istopatologico dovrebbe essere valutato da un esperto patologo. </li><li> Media di tutti i punteggi dei parametri per generare un punteggio totale istopatologia o utilizzare i punteggi individuali per quantificare aspetti specifici della progressione della malattia. Condurre tutti segnando in doppio cieco, con revisori cieco sia il genotipo e il trattamento. Questo sistema di punteggio è stato precedente ay descritto 6,7,10. </li></ol>

<ol>
	<li>Matute-Bello, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+official+American+Thoracic+Society+workshop+report:+features+and+measurements+of+experimental+acute+lung+injury+in+animals.">An official American Thoracic Society workshop report: features and measurements of experimental acute lung injury in animals.</a> Am. J. respir. Cell Mol. Biol. 44, 725-738 (2011).</li><li>Egger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+of+bleomycin+via+the+oropharyngeal+aspiration+route+leads+to+sustained+lung+fibrosis+in+mice+and+rats+as+quantified+by+UTE-MRI+and+histology.">Administration of bleomycin via the oropharyngeal aspiration route leads to sustained lung fibrosis in mice and rats as quantified by UTE-MRI and histology.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Rayamajhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsurgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry.">Nonsurgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Revelli, D. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+NLRP12+during+the+in+vivo+host+immune+response+to+Klebsiella+pneumoniae+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Characterization of NLRP12 during the in vivo host immune response to Klebsiella pneumoniae and Mycobacterium tuberculosis.</a> PloS one. , (2013).</li><li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+NPSR1/GPRA+in+the+lung+before+and+after+induction+of+asthma-like+disease.">Expression and function of NPSR1/GPRA in the lung before and after induction of asthma-like disease.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NLRP3+(NALP3,+Cryopyrin)+facilitates+in+vivo+caspase-1+activation,+necrosis,+and+HMGB1+release+via+inflammasome-dependent+and+-independent+pathways.">NLRP3 (NALP3, Cryopyrin) facilitates in vivo caspase-1 activation, necrosis, and HMGB1 release via inflammasome-dependent and -independent pathways.</a> J. Immunol. 183, 2008-2015 (2009).</li><li>Kline, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+airway+responsiveness+to+inhaled+lipopolysaccharide.">Variable airway responsiveness to inhaled lipopolysaccharide.</a> Am. J. Respir. Crit. Med. 160, 297-303 (1999).</li><li>Cressman, V. L., Hicks, E. M., Funkhouser, W. K., Backlund, D. C., Koller, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+of+chronic+mucin+secretion+to+airway+disease+in+normal+and+CFTR-deficient+mice.">The relationship of chronic mucin secretion to airway disease in normal and CFTR-deficient mice.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19, 853-866 (1998).</li></ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

I passaggi più critici per valutare correttamente la risposta immunitaria nei polmoni del mouse è il seguente: 1) scegliere il ceppo del mouse appropriato e sesso per il modello in corso di valutazione; 2) ottimizzare la consegna PAMP ai polmoni; 3) raccogliere ed elaborare correttamente il BALF; e 4) correttamente correggere e preparare i polmoni per le valutazioni istopatologiche. La scelta del ceppo di topo è un fattore importante per la valutazione della risposta immunitaria dell&#39;...

Infezioni polmonari associate a batteri patogeni specie sono una causa comune di morbilità e mortalità a livello mondiale. Determinare i meccanismi che guidano la risposta immunitaria a questi agenti patogeni promuoverà lo sviluppo di strategie di prevenzione e nuovi agenti terapeutici che attenuare l&#39;impatto di queste infezioni. L&#39;obiettivo generale del protocollo qui descritto è di fornire all&#39;utente un metodo flessibile per valutare l&#39;host risposta immunitaria innata all&#39;infezione patogeno utilizzando un modello patogeno associato molecolare (PAMP) come surrogato batteri vivi. La maggior parte degli studi precedenti che valutano l&#39;host innata risposta immunitaria ai batteri si sono concentrati su modelli peritoneali causa della relativa facilità di esecuzione. Anche se questi modelli sono molto utili e hanno portato a significativi progressi nel campo delle interazioni ospite-patogeno e infiammazione sistemica, i dati generati da questi modelli non sono sempre appropriati per gli studi involving il sistema respiratorio. Qui, un modello polmonare di infiammazione polmonare acuta si propone come un ampliamento pratico e clinicamente rilevante delle intraperitoneale (ip) modelli ad iniezione classici. La tecnica proposta consente la valutazione locale della risposta immunitaria innata in un sistema modello specifico organo. I metodi qui descritti sono progettati per fornire una tecnica semplice e robusto per consentire agli utenti di valutare la risposta immunitaria a LPS, che è un PAMP comune. I metodi sono basati su endotracheale (it) instillazione di LPS, che induce una risposta immunitaria innata robusto nei polmoni dei topi e imita molte delle caratteristiche fisiopatologiche osservate in pazienti umani affetti da infezioni respiratorie e danno polmonare acuto 1. Un vantaggio principale di questa tecnica è che permette all&#39;utente di valutare la risposta immunitaria senza i fattori di confusione e problemi di sicurezza associati alla realizzazione di studi in vivoutilizzando batteri vivi. Allo stesso modo, la via orofaringea che la somministrazione di esposizione descritto in questo protocollo ha vantaggi significativi rispetto ad altre tecniche comunemente utilizzate, tra cui intranasale (in) amministrazione e l&#39;amministrazione è chirurgica. Ad esempio, la somministrazione è orofaringea permette dosaggio in vasca relativamente accurato e deposizione polmonare rispetto al somministrazione, che soffre tipicamente da una maggiore variabilità di deposizione polmonare dovuta alla perdita di agenti nella cavità nasale e dei seni 2-4. L&#39;instradamento somministrazione elude queste cavità e consente l&#39;accesso diretto alla trachea e vie aeree. Allo stesso modo, l&#39;approccio chirurgico si tratta di un metodo di gestione molto più morboso e richiede una formazione da padroneggiare. I protocolli descritti qui includono anche una descrizione delle tecniche più comuni e marcatori surrogati utilizzati per valutare la progressione infiammazione e terminare con un protocollo che descrive le tecniche adeguate per la preparazione del luNGS per la valutazione istopatologica. Questi protocolli sono focalizzati sulla riduzione del numero di topi richiesti per ciascuno studio massimizzando i dati generati da ogni singolo animale. I protocolli descritti sono estremamente flessibili e possono essere facilmente modificati per valutare una diversa PAMPs gamma e modelli molecolari di danno associato (smorza). Inoltre, con alcune modifiche supplementari, questi protocolli possono essere applicati anche a studi che hanno valutato la progressione della malattia delle vie respiratorie allergiche o interazioni ospite-patogeno con batteri vivi, virus o funghi 5-10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:269px;">C57Bl/6J</td>
			<td style="width:181px;">The Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:147px;">Stock 000664</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:269px;">Compact Scale</td>
			<td style="width:181px;">Ohaus Scale Corporation</td>
			<td style="width:147px;">71142845</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Small Animal Rectal Thermometer</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">TH 5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Rectal Probe for Rodents</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">RET 3</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ear Punch</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">EP-S 901</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Lipopolysaccharide from E. coli 0111:B4</td>
			<td style="width:181px;">InvivoGen</td>
			<td style="width:147px;">LPS-EB</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">1x Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:181px;">Baxter</td>
			<td style="width:147px;">40032609</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Intratrachael Administration and Lung Inflation Stand</td>
			<td style="width:181px;">ICAP Manufacturing</td>
			<td style="width:147px;">n/a</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td style="width:181px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:147px;">RIS 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors (blunt/sharp)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">13-806-2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">forceps (straight)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-327-379</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">forceps (45&#186;, curved)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-275</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors (blunt/blunt)</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08-940</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Pipette (200 &#181;l Capacity)</td>
			<td style="width:181px;">Gilson</td>
			<td style="width:147px;">F123601</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Ethanol</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">459844</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">&#160;1 ml Syringe</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">301025</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">10 ml Syringe</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">301604</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">27 G x 0.5 in. needle</td>
			<td style="width:181px;">BD Medical</td>
			<td style="width:147px;">305109</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Refrigerated Microcentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">13-100-676</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">1.2 mm Tracheal Cannulae with Luer-adapter</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">732836</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">14025-076</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">4-0 Silk Braided Surgical Suture</td>
			<td style="width:181px;">Ethicon</td>
			<td style="width:147px;">A183</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Luer to Tube Connector Kits</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">721406</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Luer Stopcock Kit</td>
			<td style="width:181px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">721664</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Tygon formula E-3603 laboratory tubing</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">R-3603</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:181px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">HT501128-4L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse IL-1&#946; OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">559603</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse IL-6 OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">550950</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Mouse TNF-&#945; OptEIA ELISA Kit</td>
			<td style="width:181px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:147px;">560478</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:181px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:147px;">3520</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Hemacytometer Cover Glasses</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">22-021-801&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SV3008401</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytology Funel Clips</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-357</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytology Funels</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-354</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filter Cards</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22-030-410</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Microscope Slides</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">12-544-1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cover Glasses</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">12-540A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Cytospin Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">A78300003&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Diff Quick Staining Kit</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">47733150</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Permount Mounting Medium</td>
			<td style="width:181px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">SP15-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utilization of oropharyngeal intratracheal pamp administration and bronchoalveolar lavage to evaluate the host immune response in mice

La risposta immunitaria agli agenti patogeni è un processo biologico complesso. La maggior parte degli studi in vivo impiegato classico per caratterizzare le interazioni ospite-patogeno approfittano di iniezioni intraperitoneali di selezionare batteri o modelli molecolari patogeni associati (PAMPs) nei topi. Anche se queste tecniche hanno prodotto dati enormi associati con infettiva patobiologia malattia, modelli iniezione intraperitoneale non sono sempre appropriati per studi di interazione ospite-patogeno nel polmone. Utilizzando un polmone modello infiammazione acuta nel topo, è possibile condurre una analisi ad alta risoluzione della risposta immunitaria innata utilizzando lipopolisaccaride (LPS). Qui, descriviamo i metodi per amministrare LPS utilizzando chirurgico orofaringea somministrazione endotracheale, monitorare i parametri clinici associati alla patogenesi della malattia, e utilizzare liquido di lavaggio broncoalveolare di valutare la risposta immunitaria dell&#39;ospite. Le tecniche descrittesono ampiamente applicabile per studiare l&#39;host innata risposta immunitaria ad una gamma diversificata di PAMPs e patogeni. Analogamente, con piccole modifiche, queste tecniche possono essere applicate anche in studi che valutano allergica infiammazione delle vie aeree e nelle applicazioni farmacologiche.

Le pareti cellulari di batteri gram-negativi sono composti da LPS, che è molto abbondante nell&#39;ambiente. L&#39;inalazione di LPS in popolazioni umane sensibili aggrava reattività delle vie aeree ed è capace di innescare un response11 immunitaria robusta. LPS è anche un PAMP comune utilizzato in modelli murini per suscitare una risposta immunitaria innata robusta. Nel protocollo qui descritto, i topi hanno ricevuto una dose di LPS è isolato da E. coli (sierotipo 0111: B4) utilizzando l&#39;amministrazio...

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The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

La risposta immunitaria dell&#39;ospite all&#39;infezione patogeno è un processo strettamente regolata. Utilizzando un polmone modello di esposizione lipopolisaccaride nei topi, è possibile effettuare valutazioni ad alta risoluzione dei complessi meccanismi associati alla patogenesi della malattia.

L&#39;utilizzo di orofaringea intratracheale PAMP Amministrazione e lavaggio broncoalveolare per valutare la risposta immunitaria nei topi Host

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

the-utilization-oropharyngeal-intratracheal-pamp-administration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.5K Views.  Virginia Polytechnic Institute and State University.  La risposta immunitaria dell'ospite all'infezione patogeno è un processo strettamente regolata. Utilizzando un polmone modello di esposizione lipopolisaccaride nei topi, è possibile effettuare valutazioni ad alta risoluzione dei complessi meccanismi associati alla patogenesi della malattia. 

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Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Misurazione della carica batterica e Risposte immunitarie in topi infettati con Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

An Introduction to vespe parassite di<em&gt; Drosophila</em&gt; E la risposta immunitaria antiparassitari

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Misurazione quantitativa della risposta immunitaria e nel sonno<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Quantificazione della risposta Burst respiratoria come un indicatore di Innate Immune Salute in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

In Analisi Vitro di Myd88 mediata Cellular Immune Response to West Nile virus mutante Strain Infezione

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

L&#39;efficacia e la protezione polmonare risposta immunitaria seguito sottocutanea e intranasale BCG Amministrazione nei topi

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

inoculando<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Le zanzare con perline di indurre e misurare la risposta immunitaria melanizzazione

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

Lavaggio broncoalveolare murini di polmoni per analizzare infiammatoria infiltrazione cellulare

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.