Gli autori desiderano ringraziare i membri passati e presenti del laboratorio Kim, Mark Nilan per la cura e la manutenzione zebrafish, il Dr. Robert Wheeler per utili discussioni e la condivisione dei dati, e le sovvenzioni NIH 3RO1GM087308-02S1 e 1P20RR024475-01A2 e il Maine Agricole e Forestali Esperimento Stazione (Numero della pubblicazione 3303) per il finanziamento.

1. Cura e manutenzione Zebrafish <ol><li> Zootecnica: escursione Mass adulto zebrafish come descritto in precedenza 13. Raccogliere gli embrioni generati come descritto in precedenza 14. </li><li> Microiniezione (se desiderato): microinject 1-4 della fase delle cellule di embrioni di zebrafish con oligonucleotidi morpholino al knockdown prodotti genici o mRNA per sovraesprimere prodotti genici come descritto in precedenza 15. <ol><li> Mantenere una piscina adeguata di finto controlli iniettato (almeno 48 che vivono, finto iniettato pesci di controllo e 48 di vita, pesci sperimentalmente manipolato sono necessari per riempire un pozzo micropiastra 96). </li></ol></li><li> Mantenere gli embrioni: crescere gli embrioni in capsule di Petri profonde a 28 ° C in acqua uovo (60 mg / ml Instant Ocean Sea Salt in acqua distillata-autoclavato acqua) fino alla fase di sviluppo desiderato (una risposta burst respiratorio non è rilevabile utilizzando questo protocollo in embrioni di zebrafish età inferiore ai 2 giorni dopo la fecondazione 12). Nota: E &#39;stato observed che la prevenzione pigmentazione in embrioni di zebrafish sia attraverso l&#39;utilizzo di 1-fenil 2-tiourea (PTU) o golden/slc24a5 zebrafish mutanti non altera in maniera significativa l&#39;induzione di fluorescenza da PMA (dati non pubblicati, gli embrioni testati a 48, 72, e 96 hpf). <ol><li> Rimuovere gli embrioni morti al giorno con una pipetta di trasferimento di plastica. </li><li> Decantare attentamente acqua uovo vecchio e riempire con acqua nuova giornaliera di uova. </li></ol></li><li> Embrioni Dechorionate: Il giorno dell&#39;esperimento, gli embrioni dechorionate (se gli embrioni sono ancora nelle loro chorions) come descritto in precedenza con due belle pinze 14 (questo test burst respiratorio possono essere eseguite anche sui reni sezionati da zebrafish adulto 12 e protocolli dettagliati per i reni dissezione di zebrafish adulto sono stati precedentemente descritto 16,17). </li></ol> 2. Soluzione Preparazione <ol><li> Preparare una soluzione stock di H2DCFDA: Pesare 1 mg di H2DCFDA. <ol><li> Dissolve 1 mg di H2DCFDA in 1 ml di dimetilsolfossido (DMSO) per fare un / ml di soluzione 1 mg. </li><li> Fai 22 microlitri aliquote di questa soluzione in 1,7 ml provette da microcentrifuga. </li><li> Avvolgere le aliquote di soluzione di riserva H2DCFDA in un foglio di alluminio e conservare al buio, quando possibile, perché H2DCFDA è sensibile alla luce. </li><li> Conservare H2DCFDA aliquote a -20 ° C per un massimo di 3 mesi. </li></ol></li><li> ATTENZIONE - Preparare una soluzione madre di acetato phorbol myristate (PMA): Pesare 1 mg di PMA con un equipaggiamento di protezione individuale (es. guanti, occhiali e maschera). <ol><li> Sciogliere PMA in 1 ml di DMSO a fare un / ml di soluzione 1 mg. </li><li> Fai 11 microlitri aliquote in 1,7 ml provette da microcentrifuga. </li><li> Il negozio di aliquote di soluzione madre PMA a -80 ° C per un massimo di 3 mesi. </li></ol></li><li> Preparare una soluzione di lavoro di H2DCFDA: Il giorno dell&#39;esperimento, fare una soluzione di lavoro H2DCFDA aggiungendo H2DCFDA soluzione stock 1 a 1 parteDMSO parte (500 mg / ml H2DCFDA concentrazione finale). Ad esempio, aggiungere 20 ml di soluzione stock H2DCFDA e 20 microlitri DMSO ad una lamina avvolto 1,7 ml provetta. </li><li> Preparare una soluzione di lavoro di PMA: Il giorno dell&#39;esperimento, fare una soluzione di lavoro PMA aggiungendo PMA soluzione stock 1 parte a 49 parti di acqua priva di nucleasi (20 mcg / ml PMA concentrazione finale). Ad esempio, diluire 10 ml di soluzione stock PMA in 490 microlitri acqua priva di nucleasi in una provetta 1,7 ml microcentrifuga. </li><li> Preparare una soluzione di dosaggio di H2DCFDA: Il giorno dell&#39;esperimento, fare una soluzione di dosaggio H2DCFDA con una concentrazione finale di 1 mg / ml in acqua H2DCFDA uovo. I volumi preparate delle soluzioni di dosaggio possono essere modificate a piacimento, ma garantiscono che le concentrazioni finali dei reagenti vengono mantenute. Per reni, al posto dell&#39;acqua uovo, utilizzare lo stesso volume di Dulbecco modificato medium/F-12 Eagle (DMEM 50%, 50% F-12, senza rosso fenolo). Per fare 5 ml di H2DCFDAdosaggio soluzione, utilizzare un 5 ml pipetta sierologica per trasferire 5 ml di acqua uovo (o DMEM/F-12) in una provetta da 15 ml conica avvolto in carta stagnola ed etichettato &#39;H&#39;. <ol><li> Rimuovere 10 ml di acqua uovo (o DMEM/F-12) dalle tubo da 15 ml etichettato &#39;H&#39; e scartare. </li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione di lavoro H2DCFDA nel tubo da 15 ml denominato &#39;H&#39; e vortex per miscelare (questo volume è sufficiente per 48 embrioni oi campioni del rene (la metà di un full 96 ben micropiastra) e questi pozzi fornirà misurazioni del livello di fluorescenza di fondo). </li></ol></li><li> Preparare una soluzione di dosaggio di H2DCFDA + PMA: Il giorno dell&#39;esperimento, fare una soluzione H2DCFDA + PMA dosaggio con concentrazioni finali di: H2DCFDA - 1 ug / ml e PMA - 400 ng / ml. Per fare 5 ml di soluzione di dosaggio H2DCFDA + PMA, utilizzare un 5 ml pipetta sierologica per trasferire 5 ml di acqua uovo (o DMEM/F-12) in un nuovo tubo da 15 ml etichettato &#39;H + P&#39;. <ol><li> Rimuovere 110 _6; l di acqua uovo (o DMEM/F-12) dalle tubo da 15 ml etichettato &#39;H + P&#39; e scartare. </li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione di lavoro H2DCFDA, poi aggiungere 100 ml di soluzione di lavoro PMA nel tubo da 15 ml etichettato &#39;H + P&#39; e agitare per miscelare (questo volume è sufficiente per 48 campioni o l&#39;altra metà di un pieno 96 ben micropiastra ). </li></ol></li><li> Conservare le soluzioni di dosaggio su ghiaccio. </li></ol> 3. Microplate Reader Programmazione <ol><li> Preparare strumento: Accendere il lettore di micropiastre. <ol><li> Riscaldare la sorgente di luce. </li><li> Impostare un programma per leggere la fluorescenza: per es eccitazione: 485 nm, emissione: 528 nm; Ottica Ruolo: top 510 nm; Sensibilità: 65, con 5 sec agitazione passo prima della lettura. </li></ol></li></ol> 4. 96 Beh Microplate Set Up (vedi figura 2) <ol><li> Raccogliere le forniture: Ottenere i piatti con gli embrioni dechorionated, nero 96 ben micropiastra, p200 pipetta esuggerimenti, secchiello per il ghiaccio con H2DCFDA e soluzioni di dosaggio H2DCFDA + PMA, multicanale p200 pipetta, due serbatoi sterili, fogli di alluminio, e forbici. </li><li> Trasferimento di un embrione in ciascun pozzetto di una micropiastra da 96 pozzetti: Usare le forbici per tagliare un puntale tale che gli embrioni oi reni in forma attraverso l&#39;apertura. <ol><li> Impostare una pipetta P200 a 100 microlitri e trasferire un embrione con acqua uovo (o DMEM/F-12) in quanto molti dei pozzetti di una micropiastra a 96 pozzetti nero come desiderato (non è necessario cambiare la punta della pipetta per ogni diverso campione embrione all&#39;interno di una condizione sperimentale, ma può essere necessario cambiare gli aghi tra condizioni sperimentali). Essere sicuri di evitare di trasferire chorions residue, in quanto questi tendono a distorcere i dati raccolti. Per il trasferimento dei reni, una pipetta volume maggiore (impostato a 100 microlitri) può essere utilizzato e punte di pipetta può essere tagliato per ottenere un diametro maggiore, se necessario. Potrebbe essere necessario incorporare pozzetti senza campioni embrione o renali, ma conle soluzioni di dosaggio per il controllo di alcune manipolazioni sperimentali. </li></ol></li><li> Aggiungere le soluzioni di dosaggio: Versare la soluzione di dosaggio H2DCFDA in una sterile 25 ml serbatoio. <ol><li> Utilizzare un p200 pipetta multicanale e otto suggerimenti per pipetta contemporaneamente 100 ml di soluzione di dosaggio H2DCFDA in una colonna sul pozzo micropiastra 96 ​​(500 ng concentrazione finale ml / di H2DCFDA). </li><li> Ripetere questo (cambiando punte non è necessario) per il numero di colonne desiderato (di solito sei colonne o 48 pozzetti se riempire un&#39;intera micropiastra a 96 pozzetti). Aggiungere questa soluzione alla metà dei campioni embrioni controllo e la metà dei campioni embrioni manipolati sperimentalmente (esempio 96 ben micropiastre impostato è mostrato in Figura 2, questi pozzi (colore arancione) fornirà dati di fluorescenza di fondo in campioni non indotte con PMA) . </li><li> Versare la soluzione di dosaggio H2DCFDA + PMA in un nuovo, sterile serbatoio 25 ml. </li><li> Utilizzare un p200 pipetta multicanale e otto suggerimenti per simultaneously pipetta 100 microlitri della soluzione di dosaggio H2DCFDA + PMA nelle restanti colonne (di colore rosso in figura 2) del pozzo micropiastra 96 (cambiando punte non è necessario, concentrazioni finali di H2DCFDA-500 ng / ml e PMA-200 ng / ml) . </li></ol></li><li> Coprire la micropiastra con il foglio di alluminio. </li><li> Agitare la micropiastra per circa 20 sec a 150 rpm per omogeneizzare le soluzioni in ciascun pozzetto. </li><li> Incubare la micropiastra a 28 ° C quando non viene letto. </li></ol> 5. Fluorescenza Quantificazione <ol><li> Leggere la micropiastra al tempo = 0 ore dopo l&#39;aggiunta di PMA utilizzando i parametri descritti al punto 3.1.2. <ol><li> Continuare le misurazioni ogni pochi minuti per l&#39;intervallo di tempo desiderato o incubare la pellicola avvolta micropiastra a 28 ° C fino a un punto secondo tempo e prendere una misura endpoint all&#39;ora desiderata (ad esempio 4 ore dopo l&#39;aggiunta di PMA). </li></ol></li><li> Utilizzare una plastica transfer pipetta per recuperare gli embrioni dai pozzetti. </li><li> Euthanize gli embrioni in base alla vostra cura degli animali e il protocollo di utilizzo, ad esempio, l&#39;immersione in tricaine MS222. </li><li> Smaltire la microplacca e altri materiali usa e getta nel contenitore rifiuti a rischio biologico. </li></ol> 6. Analisi dei dati <ol><li> Decidere il punto ora in cui si desidera confrontare valori di fluorescenza (es. 4 ore dopo l&#39;aggiunta di PMA, tabella 1). </li><li> Sottrarre il valore di fluorescenza del gruppo media di controllo non-indotta dai valori di fluorescenza del singolo gruppo di controllo PMA-indotta. </li><li> Ripetere questa operazione per il gruppo sperimentale con e senza PMA. </li><li> Memorizzare questi valori di fluorescenza normalizzate in due colonne, il controllo + gruppo PMA e il gruppo sperimentale + PMA (Tabella 2). </li><li> Calcolare le medie e le deviazioni standard per i valori di fluorescenza normalizzati del controllo + PMA Group e il gruppo + PMA sperimentale. </li><li> Confrontare i valori di fluorescenza normalizzati utilizzando un t-test per dati non appaiati per determinare la significatività statistica (Tabella 2). </li><li> Grafico i mezzi di controllo + gruppo PMA e il gruppo sperimentale + PMA con barre di errore riflettono le opportune deviazioni standard. </li><li> Registrare il livello di significatività sul grafico e nella figura legenda (Figura 2). </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La funzione primaria di fagociti è quello di rilevare, inghiottire e distruggere gli agenti patogeni. La capacità dei fagociti di produrre un burst respiratorio adeguato è fondamentale per questa funzione. Pertanto, la quantificazione della risposta burst respiratorio è un metodo per permettere il confronto di salute generale e la funzione immunitaria innata tra gruppi di individui e / o in risposta a manipolazioni sperimentali. Qui, descriviamo un protocollo per indurre, quantificare e confrontare la risposta burst...

Il sistema immunitario è costituito da due rami: immunità innata e adattativa. L&#39;immunità innata è evolutivamente più antica di immunità adattativa. Gli invertebrati sono attualmente pensa di avere solo l&#39;immunità innata, mentre i vertebrati possiedono entrambi i rami innata e adattativa. Mentre l&#39;immunità adattativa conferisce l&#39;immunità specifica e di lunga durata a certi agenti patogeni, immunità innata è una risposta immediata ai batteri invasori, virus e funghi. Un aspetto cruciale della risposta immunitaria innata comporta il rilascio di citochine e chemochine, che si traduce in infiammazione e il reclutamento dei fagociti (es. macrofagi, neutrofili) per inghiottire e distruggere gli invasori stranieri. Risposte immunitarie innate di successo riguardano: (1) il riconoscimento di microrganismi invasori, (2) induzione di cascate di segnalazione adeguati (ad esempio rilascio di citochine e chemochine), (3) lo sviluppo corretto / numero adeguato di fagociti; (4) La migrazione dei fagociti a siti di infezione; (5) fagocitazione di agenti patogeni, e (6) la distruzione dei microrganismi inghiottito. Una carenza in uno qualsiasi di questi passi potrebbe portare per l&#39;host di essere sopraffatti da, e soccombere, l&#39;infezione. Una risposta immunitaria innata robusta è vitale per la salute degli organismi perché è la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni in tutte le piante e animali. Nei vertebrati, potenzia anche la risposta immunitaria adattativa 1. Pertanto, è fondamentale che siamo in grado di valutare tutti gli aspetti della risposta immunitaria innata per comprendere meglio e per ottimizzare la sua funzione. Molti organismi modello sono utilizzati per studiare l&#39;immunità innata, che vanno da Arabadopsis a C. elegans di Drosophila a topi di cellule umane in coltura. Un vantaggio di utilizzare il pesce zebra (Danio rerio) sistema modello per studiare l&#39;immunità innata è che il zebrafish è un vertebrato, con im sia innata e adattativaComunità, ma lo sviluppo dell&#39;immunità innata e adattativa sono temporalmente separati. Zebrafish fare affidamento esclusivamente sulle immunità innata per la protezione contro l&#39;infezione fino a quando l&#39;immunità adattativa diventa pienamente funzionale, che si verifica circa 4-6 settimane dopo la fecondazione 2. Oltre agli strumenti per la manipolazione genetica, chiarezza ottica e rapido, sviluppo esterno, l&#39;immunità innata come modalità principio di difesa in embrioni di zebrafish fornisce un modello semplificato in cui studiare la complessità della risposta immunitaria innata in vivo. Sono stati sviluppati protocolli multipli per valutare diversi aspetti della risposta immunitaria innata in embrioni di zebrafish. Microarrays e RNAseq hanno confermato che i profili delle citochine indotte dalla risposta immunitaria innata zebrafish sono simili a quello umano e hanno anche suggerito il coinvolgimento di geni inattese immunità innata 3,4. La trasparenza del zebrafish e fluorescenti, transgenderic ceppi di patogeni e zebrafish permettono la visualizzazione delle interazioni ospite-patogeno dinamici in vivo in tempo reale. Embrioni di zebrafish transgenici esprimenti GFP sotto il controllo del specifico neutrofili mieloperossidasi promotore 5,6 o la specifica-macrofago MPEG1 promotore 7 hanno permesso di visualizzare e quantificare la migrazione dei fagociti a siti di infezioni localizzate 8 nonché di visualizzare fagocitosi e distruzione di fluorescente patogeni 8,9. Embrioni di zebrafish sono anche suscettibili alla generazione di saggi high-throughput e schermi chimici. Di conseguenza, sono stati recentemente sviluppati metodi high-throughput di analisi del trascrittoma al momento dell&#39;infezione 10 e la migrazione dei fagociti a siti di lesione indotta chimicamente 11. Delle tecniche sopra elencate, nessuna valutare quantitativamente la fase finale di distruzione patogeno dai fagociti. Questa fase finalecomporta un burst respiratorio (ossia la produzione di ROS e di altri composti tossici), che uccidono gli agenti patogeni inghiottito. L&#39;enzima NADPH ossidasi è una delle principali fonti di ROS in fagociti. Assemblaggio delle subunità dei NADPH ossidasi risultati degli enzimi nel trasferimento di elettroni all&#39;ossigeno, generando anioni superossido. Attraverso successive reazioni enzimatiche, superossido può quindi essere convertito in perossido di idrogeno e acido ipocloroso (Figura 1A). È il burst respiratorio dei fagociti che uccide i patogeni e quindi, la quantificazione del potenziale burst respiratorio di embrioni di zebrafish è indicativo della salute immunitaria innata generale. Abbiamo sviluppato un saggio basato sulla fluorescenza per quantificare il burst respiratorio in gruppi di singoli embrioni di zebrafish 12. Questa analisi utilizza la non fluorescente, forma ridotta di un colorante cellula-permeabile disponibile in commercio. Questo colorante, 2 &#39;, 7&#39;-diclorodiidrofluoresceina diacetato (H2DCFDA), viene convertito nelle fluorescenticomposto cent, 2 &#39;, 7&#39;-diclorofluoresceina (DCF), in seguito all&#39;ossidazione. Le diverse ROS generati dal burst respiratorio dei fagociti possono ossidare H2DCFDA e generare la fluorescenza 24. La comparsa di fluorescenza può essere utilizzato per quantificare e confrontare la risposta burst respiratorio tra gruppi di zebrafish. La proteina chinasi C acetato agonista forbolo miristato (PMA) viene usato per indurre chimicamente NADPH ossidasi per produrre ROS e quindi aumentare letture della fluorescenza (Figura 1B). Qui, forniamo un protocollo dettagliato di una versione modificata ed ottimizzata di questo zebrafish embrione respiratorio saggio burst. Questo test può essere utilizzato per confrontare il burst respiratorio tra gruppi di singoli embrioni di zebrafish nel tempo e / o in risposta a manipolazioni sperimentali (ad esempio morfolino-mediata knockdown proteine). L&#39;utilizzo di questo metodo, in collaborazione con altri zebrafish saggi dell&#39;immunità innata, fornirà un quadro più completo del complesso e criticorisposta immunitaria innata.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Instant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>H2DCFDA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>35845-1G</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PMA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP6851</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-5X10ML</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine S MS222</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>100 grams</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM/F-12, No Phenol Red </td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11039-021</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Deep Petri Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89107-632</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>#5 Dumont Forceps</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72700-D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1.7 ml Micro Centrifuge Tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>10011-724</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>15 ml Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-918</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5 ml Serological Pipettes</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>606180</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Contact BioTek</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Black 96 Well Microplate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-728</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>25 ml Sterile Reservoirs</td>
			<td>VistaLab</td>
			<td>3054-2003</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>P200 Pipettor</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Multichannel Pipettor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-948</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipette Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-478</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

quantification of the respiratory burst response as an indicator of innate immune health in zebrafish

Il burst respiratorio dei fagociti è parte della risposta immunitaria innata all&#39;infezione patogeno e comporta la produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS). ROS sono tossici e la funzione di uccidere i microrganismi fagocitati. In vivo quantificazione dei fagociti di derivazione ROS fornisce informazioni per quanto riguarda la capacità di un organismo di montare una risposta immunitaria innata robusto. Qui si descrive un protocollo per quantificare e confrontare i ROS in interi embrioni di zebrafish dopo induzione chimica del burst respiratorio dei fagociti. Questo metodo fa uso di un composto non fluorescente che diventa fluorescente durante l&#39;ossidazione da ROS. I singoli embrioni di zebrafish sono aggiunti nei pozzetti di una micropiastra e incubate in questo substrato fluorogenico con o senza un induttore chimico del burst respiratorio. Fluorescenza in ogni pozzetto è quantificato in momenti desiderati utilizzando un lettore di micropiastre. Letture di fluorescenza sono rettificati per eliminare fluorescenza di fondo e poi compared utilizzando un t-test per dati non appaiati. Questo metodo permette la comparazione del potenziale burst respiratorio di zebrafish embrioni a diversi stadi di sviluppo e in risposta a manipolazioni sperimentali come proteina smontabile, sovraespressione, o trattamento con agenti farmacologici. Questo metodo può anche essere usato per monitorare la risposta burst respiratorio in interi reni sezionato o preparazioni di cellule di rene di zebrafish adulti e alcune altre specie ittiche. Crediamo che la relativa semplicità e adattabilità di questo protocollo si integrano protocolli esistenti e sarà di interesse per i ricercatori che cercano di comprendere meglio la risposta immunitaria innata.

Qui, forniamo i dati confrontando la risposta burst respiratorio in embrioni di zebrafish (wild-type, AB sfondo) a 48 e 72 ore dopo la fecondazione (HPF). Le 48 embrioni HPF agito come il nostro gruppo di controllo e 72 HPF embrioni come il nostro gruppo sperimentale. La dimensione del campione utilizzato è stato di 24 embrioni non-indotta e 24 embrioni PMA-indotta per ogni fase di sviluppo. Letture della fluorescenza prime (in unità di fluorescenza relativa (RFU)) sono stati ottenuti leggendo la micropiastra 4 ore do...

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Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

La risposta immunitaria innata protegge contro l&#39;infezione da organismi patogeni. Una componente fondamentale della risposta immunitaria innata, il burst respiratorio dei fagociti, genera specie reattive dell&#39;ossigeno che uccidono i microrganismi invasori. Descriviamo un saggio burst respiratorio che quantifica specie reattive dell&#39;ossigeno prodotte quando la risposta immunitaria innata è indotta chimicamente.

Quantificazione della risposta Burst respiratoria come un indicatore di Innate Immune Salute in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

quantification-respiratory-burst-response-as-an-indicator-innate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.5K Views.  University of Maine.  La risposta immunitaria innata protegge contro l'infezione da organismi patogeni. Una componente fondamentale della risposta immunitaria innata, il burst respiratorio dei fagociti, genera specie reattive dell'ossigeno che uccidono i microrganismi invasori. Descriviamo un saggio burst respiratorio che quantifica specie reattive dell'ossigeno prodotte quando la risposta immunitaria innata è indotta chimicamente. 

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Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Umano In Vitro</emSoppressione> come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

An Introduction to vespe parassite di<em&gt; Drosophila</em&gt; E la risposta immunitaria antiparassitari

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Misurazione quantitativa della risposta immunitaria e nel sonno<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Dissezione Innate Immune Signaling in Evasion virale di produzione di citochine

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Usando RNA-interferenza per Indagare sulla risposta immunitaria innata in mouse macrofagi

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

In Analisi Vitro di Myd88 mediata Cellular Immune Response to West Nile virus mutante Strain Infezione

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Imaging non invasiva della risposta immunitaria innata in un modello di Zebrafish larvale<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infezione

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Campionamento non invasivo del rivestimento mucoso fluido per la quantificazione dei livelli di Immune-mediatore In Vivo delle vie respiratorie superiore

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

Un modello di topo per valutare risposta immunitaria innata per infezione da Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...