Abbiamo gentilmente Ringraziamo il Dott. John Hayes per gli script, Drs. Eric Bradley e Christopher Del Negro per l&#39;assistenza con la microscopia confocale, Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, e Liz MacMurray per il loro lavoro nello sviluppo del progetto e la fornitura di dati preliminari, il dottor Greg Smith per suggerimenti utili per l&#39;analisi statistica. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del NIH (NINDS IR15N5067566-01) per MSS e un Howard Hughes Medical Institute Science Education Sovvenzione al College of William and Mary.

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Con i suoi tipi di cellule ben caratterizzati che si conservano in tutti i vertebrati, la retina fornisce un modello utile per lo studio dei processi molecolari-cellulari che regolano tipo di specifica e la differenziazione cellulare. Coltura cellulare primaria offre un metodo potente per indagare un&#39;ampia gamma di processi tra espressione genica, dinamica della proteina, e di calcio e attività elettrica a livello di singola cellula risoluzione. Qui vi presentiamo una tecnica semplice per colture cellulari primarie...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Per le dissezioni e coltivando </td></tr><tr><td> BD Falcon Facile Grip tessuti piatti Cultura, 35 mm </td><td> Pescatore </td><td> 08-772A </td><td></td></tr><tr><td> Monouso in polistirolo piastre di Petri, 60 x 15 mm </td><td> Pescatore </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35 millimetri di superficie Nunclon piastre Petri (con Airvent) </td><td> Pescatore </td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont fine Pinza (Dumostar # 55) </td><td> Pescatore </td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellattice Micro-governato coprioggetto in plastica, 25 mm </td><td> Pescatore </td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td> Ethyl-m-aminobenzoate metansolfonato Salt (MS-222) </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina solfato </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> 380-003-G025 </td><td></td></tr><tr><td> Gibco tripsina (1:250) in polvere </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi B da Clostridium histolyticum </td><td> Roche </td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-Streptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Nilo Azzurro Solfato (opzionale) </td><td> Pfaltz &amp; Bauer </td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> 500 ml vuoto filtro / System Storage bottiglia, 0,22 micron pori 33,2 centimetri 2 membrana CN </td><td> Corning </td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td> Per Imaging di calcio </td></tr><tr><td> Fluo-4 AM 1 Soluzione mM in DMSO, Cell permanente </td><td> Life Technologies </td><td> F-14217 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione Pluronic F-127 10% in acqua </td><td> Life Technologies </td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 Sistema microscopio confocale </td><td> Zeiss </td><td> Modello fuori produzione </td><td></td></tr><tr><td> Reagente Bloccante </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Per ibridazione fluorescente in situ (FISH) </td></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin-POD, Frammenti Fab </td><td> Roche </td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-DNP-HRP Anticorpo </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3NHS estere </td><td> GE Healthcare </td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-Fluoresceina </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46409 </td><td></td></tr><tr><td> Formammide, deionizzata </td><td> Amresco </td><td> 0606-950ml </td><td></td></tr><tr><td> Torula RNA, Tipo IX </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td> Sale di sodio eparina, dalla mucosa intestinale suina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabella 2. Reagenti e attrezzature specifiche. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Soluzione </td><td> Riferimento </td><td> Contenuto </td></tr><tr><td> Cella Cultura Media </td><td> Chang e Spitzer, 2009 54 </td><td> 116 mM di NaCl 0,67 mM KCl 2 mM CaCl 2 1,31 mM MgSO4 4,6 mM Tris 1% (v: v) di penicillina / streptomicina Regolare il pH a 7,8 con HCl. Filtrare sterilizzare passando attraverso un filtro 0,22 micron CN. Conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Calcio-Magnesio gratuita Media (CMF) </td><td> Gu et al, 1994 42,. Gu e Spitzer, 1995 55 </td><td> 116 mM di NaCl 0,67 mM KCl 4,6 mM Tris 0,4 mM EDTA 1% (v: v) di penicillina / streptomicina Regolare il pH a 7,8 con HCl. Filtrare sterilizzare passando attraverso un filtro 0,22 micron CN. Conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Acid Buffer maleico (MAB) </td><td> SIVE et al., 2000 53 </td><td> 100 mM di acido maleico 150 mM NaCl (pH 7,5). </td></tr><tr><td> Marc Ringers Modified (MMR), 10X </td><td> SIVE et al., 2000 53 </td><td> 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO4 2 mM CaCl 2 5 mM HEPES pH regolato a 7,4 con NaOH 0,1 X. MMR contiene inoltre 50 mg / ml gentamicina solfato e si corregge il pH a 7,4 con NaOH. </td></tr><tr><td> Soluzione MEMFA, 10X </td><td> SIVE et al., 2000 53 </td><td> MOPS 0,1 M (pH 7,4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 3,7% di formaldeide Una soluzione 10X, senza formaldeide, può essere conservato a 4 ° C. La formaldeide è aggiunto il fresco (1/10 del volume di una madre standard 37%). </td></tr><tr><td> In tampone di ibridazione in situ </td><td> SivE et al., 2000 53 </td><td> 50% formammide 5X SSC 1 mg / ml di RNA Torula 100 mg / ml di eparina Soluzione 1X Denhart di 0,1% Tween 20 0,1% CHAPS 10 mM EDTA. </td></tr></tbody></table> Solutions. * Gentamicina, un antibiotico, è utilizzato nelle nostre soluzioni MMR, mentre la penicillina e la streptomicina sono utilizzate nelle nostre terreni di coltura. </td></tr></tbody></table>

dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue

Il processo attraverso il quale la regione anteriore della piastra neurale dà luogo alla retina dei vertebrati continua ad essere uno degli obiettivi principali della ricerca, sia clinica e di base. Oltre alla ovvia rilevanza medica per capire e trattare malattie retiniche, lo sviluppo della retina dei vertebrati continua a servire come sistema modello importante ed elegante per la determinazione neuronale tipo comprensione e differenziazione 1-16. La retina neurale si compone di sei tipi di cellule discrete (ganglio, fotorecettori amacrine, orizzontale,, cellule bipolari e cellule gliali Müller) disposte a strati stereotipati, un modello che è in gran parte conservata tra tutti i vertebrati 12,14-18. Mentre studiava la retina di un embrione in via di sviluppo è chiaramente intatta necessario per capire come questo organo complesso si sviluppa da una sporgenza del prosencefalo in una struttura a strati, ci sono molte domande che beneficiano from impiegando approcci utilizzando colture primarie di cellule presunte cellule retiniche 7,19-23. Ad esempio, analizzando le cellule da tessuti rimossi e dissociati in diverse fasi permette di distinguere lo stato di specificazione di singole cellule a diversi stadi di sviluppo, cioè, il destino delle cellule in assenza di interazioni con i tessuti vicini 8,19-22 ,24-33. Coltura cellulare primaria permette anche al ricercatore di trattare la cultura con reagenti specifici e analizzare i risultati a livello di singola cellula 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, un sistema classico modello per lo studio dei prime fasi dello sviluppo neurale 19,27,29,31-32,40-42, serve come un sistema particolarmente adatto per coltura di cellule della retina primario 10,38,43-45. Presunto tessuto retinico è accessibile sin dalle prime fasi di sviluppo, subito dopo l&#39;induzione neurale 25,38,43. Inoltre, dato thad ogni cellula nell&#39;embrione contiene una fornitura di tuorlo, cellule retiniche possono essere coltivate in un mezzo molto semplici definiti costituiti da una soluzione salina tamponata, eliminando così gli effetti confondenti di incubazione o altri prodotti a base di sieri 10,24,44-45 . Tuttavia, l&#39;isolamento del tessuto retinico dai tessuti circostanti e la successiva elaborazione è impegnativo. Qui, presentiamo un metodo per la dissezione e la dissociazione di cellule retiniche in Xenopus laevis che verranno utilizzati per preparare colture cellulari primarie che, a sua volta, essere analizzati per attività di calcio e l&#39;espressione genica a risoluzione di singole cellule. Mentre l&#39;argomento presentato in questo documento è l&#39;analisi di transienti di calcio spontanee, la tecnica è ampiamente applicabile ad una vasta gamma di domande di ricerca e approcci (Figura 1).

Esempi di successo sezionati vescicole ottiche (fase 25) e retine (fase 35) sono mostrati nelle figure 2E e 2J. Mentre questo protocollo può essere utilizzato in diverse fasi di sviluppo, è fondamentale per ottenere solo tessuto retinico per assicurare la precisione per ulteriori esperimenti. Rimuovere con cura l&#39;epidermide in tutte le fasi e garantire che i pinza non forare la retina. In fase di 35 anni o più, la lente può essere vista come uno strato trasparente sopra la retina e può essere r...

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Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis fornisce un sistema modello ideale per studiare il destino specificazione delle cellule e la funzione fisiologica delle singole cellule retiniche in colture cellulari primarie. Presentiamo qui una tecnica per la dissezione e la generazione di tessuti retinici colture cellulari primarie che vengono esposte ad attività calcio e analizzati mediante ibridazione in situ.

Dissezione, Cultura, e analisi di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tessuto embrionale della retina

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

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Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

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