In questo video, dimostriamo come esprimere costrutti di DNA esogeni nei neuroni ottici e come immaginiamo i singoli pergoli assonali ottici che esprimono GFP in girini xenopus laevis intatti e viventi. Questa è una procedura semplice ed economica per la transgenesi transiente specifica delle cellule che consente la determinazione della funzione genica autonoma cellulare nei singoli pergolati assonali ottici, sviluppandosi in un sistema modello di vertebrato vivente. A dimostrare la procedura saranno io, Sophia Dao, assistente di ricerca, e la dott.ssa Tamira Elul, investigatore principale del laboratorio.
Per iniziare, ritagliare delicatamente la punta di una pipetta micro capillare in vetro tirato con forcette fini. Riempire di nuovo la pipetta micro capillare di vetro con olio minerale utilizzando un MICROFIL in modo tale che una piccola goccia di olio minerale appaia sulla punta ritagliata della micro pipetta. Riempire la pipetta micro capillare in vetro a metà strada con olio minerale.
In un iniettore, espellere lo stantuffo a metà strada e caricare la pipetta micro capillare in vetro tirato nel supporto di iniezione. Quindi estendere lo stantuffo in tutta la misura per confermare che la pipetta micro capillare è fortemente attaccata all'iniettore e non si muove con l'estensione dello stantuffo. Trasferire una goccia di tre microliter della miscela DNA/DOTAP su un foglio quadrato di carta paraffina da un pollice.
Al microscopio stereo sezionato, spostare la punta della pipetta micro capillare in vetro nella goccia DNA/DOTAP. Utilizzare l'opzione di riempimento sull'apparato di iniezione, succhiare lentamente la goccia DNA/DOTAP nella pipetta micro capillare in vetro. Il confine tra l'olio minerale e la soluzione DNA/DOTAP è visibile nella pipetta micro capillare in vetro a causa della leggera opacità della soluzione DNA/DOTAP.
Se necessario, interrompere periodicamente il riempimento della pipetta micro capillare per consentire la ricalibrazione della pressione nella pipetta micro capillare in vetro. In primo luogo, in una piastra di Petri da 10 millilitri riempita con MMR 0,1X, de-vitellinizzare manualmente 10 embrioni di xenopus da 20 a 24 stadio con forcep fini. Afferrare la busta vitellina in vita per evitare di ferire gli embrioni.
Con le forcep sia nella mano sinistra che in quella destra dello sperimentatore, fai scoppiare la bolla dell'involucro vitellino e rilascia l'embrione dall'involucro vitellino. Fare attenzione a non ferire gli embrioni quando si rimuove la busta di vitellina. Quindi utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica con una punta tagliata per trasferire da cinque a 10 embrioni di stadio de-vitellinizzato da 22 a 24 in una piastra di Petri da 10 millilitri riempita con MMR 1X.
Al microscopio stereo, afferrare uno degli embrioni de-vitellinizzati nella piastra di Petri con le forcep e disporre l'embrione in modo che il suo polo anteriore sia puntato nel campo visivo. Quindi orientare l'embrione in modo che giace lateralmente e uno dei suoi germogli di occhio da sinistra a destra sia rivolto verso l'alto. Tenere l'embrione con le forcep nella mano non dominante dello sperimentatore e con la mano dominante dello sperimentatore, introdurre la punta della micro pipetta di vetro dal lato ventrale o dorsale appena sotto l'epidermide nel bocciolo oculare.
Iniettare da 70 a 210 nanolitri della soluzione DNA/DOTAP. Quindi ruotare l'embrione ed eseguire la stessa micro iniezione nell'altra papille oculare sul lato conlaterale dell'embrione. Iniettare entrambi i boccioli degli occhi da sei a 10 embrioni in ogni esperimento.
Dopo la micro iniezione, conservare gli embrioni in una piastra di Petri con 1X MMR per circa 30 minuti per facilitare la guarigione delle ferite. Dopo 30 minuti, trasferire gli embrioni iniettati con una pipetta di trasferimento in plastica in una soluzione MMR 0,1X con 0,001% di agente sbiancante feniltiocarbamide per ridurre la pigmentazione. Coprire la piastra di Petri con un coperchio per coltura degli embrioni per circa cinque giorni fino a quando gli embrioni si sono sviluppati in girini nelle fasi da 46 a 47.
Questo protocollo produce un tasso di successo dal 30 al 60% degli embrioni xenopus iniettati che esprimono GFP in uno o 10 pergolati assonali ottici. Immagini confocali rappresentative della GFP mostrano il controllo espresso e gli arbori assonali ottici mutanti nei girini xenopus intatti. Due mutanti di dominio di APC, APCNTERM e APBbeta-cat sono stati clonati in plasmidi pCS2.
Sono state ricostruite le immagini della serie Z del controllo GFP e degli arbori assonali ottici mutanti APC. I grafici del numero di rami, della lunghezza totale del ramo del pergolato e della lunghezza media del ramo confermano le differenze osservate tra il controllo e il mutante APC che esprime pergole assonali. Ulteriori grafici a dispersione del numero di rami rispetto alla lunghezza media del ramo con linee di regressione mostrano una correlazione inversa tra questi parametri e gli arbori assonali ottici che esprimono domini APC.
La punta della pipetta micro capillare deve essere inserita correttamente in modo molto superficiale nella papille oculare in modo che l'epidermide grigia sovrascriva il bocciolo oculare si gonfia durante ogni micro iniezione. Questa procedura può essere utilizzata sia per etichettare che alterare la funzione genetica specifica nei neuroni ottici mentre si valuta la crescita, il targeting e la ramificazione degli assoni da questi neuroni ottici. Questa tecnica di micro iniezione e lipofezione del DNA ha permesso ai ricercatori in neurobiologia dello sviluppo di studiare meccanismi molecolari autonomi cellulari che regolano l'arborizzazione dell'assone ottico in girini Xenopus laevis intatti e viventi.
