Wir huldvoll danken Dr. John Hayes für Skripte; Drs. Eric Bradley und Christopher Del Negro für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie, Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, und Liz MacMurray für ihre Arbeit bei der Entwicklung des Projekts und die Bereitstellung vorläufige Daten; Dr. Greg Smith für Anregungen auf einer statistischen Analyse. Diese Arbeit wurde durch ein NIH (NINDS IR15N5067566-01), um MSS und Howard Hughes Medical Institute Science Education Grant zum College of William and Mary unterstützt.

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Mit seinen gut charakterisierten Zelltypen, die in allen Wirbeltieren konserviert sind, bietet die Netzhaut ein nützliches Modell für die Untersuchung der molekularen zellulären Prozesse, die die Zelltyp Spezifizierung und Differenzierung. Primäre Zellkultur bietet eine leistungsfähige Methode für die Untersuchung einer Vielzahl von Prozessen einschließlich Genexpression, Protein Dynamik und Kalzium und elektrische Aktivität auf der Ebene der einzelnen Zelle Auflösung. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Für Dissektionen und Kultivierung </td></tr><tr><td> BD Falcon Easy Grip Zellkulturschalen, 35 mm </td><td> Fischer </td><td> 08-772a </td><td></td></tr><tr><td> Einweg Polystyrol Petrischalen, 60 x 15 mm </td><td> Fischer </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35 mm Nunclon Oberfläche Petrischalen (mit Airvent) </td><td> Fischer </td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont feinen Pinzette (Dumostar # 55) </td><td> Fischer </td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellattice Micro-regierten Kunststoff Deckglas, 25 mm </td><td> Fischer </td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td> Ethyl-m-aminobenzoat Methansulfonatsalz (MS-222) </td><td> MP Biomedicals, LLC </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicinsulfat </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> 380-003-G025 </td><td></td></tr><tr><td> Gibco Trypsin (1:250) Powder </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase B aus Clostridium histolyticum </td><td> Roche </td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Nile Blue Sulfate (optional) </td><td> Pfaltz &amp; Bauer </td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> 500 ml Vacuum Filter / Storage Bottle System, 0,22 um Pore 33,2 cm 2 CN Membrane </td><td> Corning </td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ Td&gt; <td></td><td> Für Calcium Imaging </td></tr><tr><td> Fluo-4 AM 1 mM Lösung in DMSO, Cell Permanent </td><td> Life Technologies </td><td> F-14.217 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 10% Lösung in Wasser </td><td> Life Technologies </td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 Konfokale Mikroskop-System </td><td> Zeiss </td><td> Modell Discontinued </td><td></td></tr><tr><td> Blockierungsreagenz </td><td> Roche </td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Für Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) </td></tr><tr><td> Anti-Digoxigenin-POD, Fab-Fragmenten </td><td> Roche </td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-DNP-Antikörper-HRP </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3NHS-Ester </td><td> GE Healthcare </td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-Fluorescein </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46409 </td><td></td></tr><tr><td> Formamid, Deionisiertes </td><td> Amresco </td><td> 0606-950ml </td><td></td></tr><tr><td> Torula RNA, Typ IX </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td> Heparin Sodium Salt, Darmschleimhaut von Schweinen </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 2. Spezifisch Reagenzien und Ausrüstung. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Lösung </td><td> Referenz </td><td> Inhalt </td></tr><tr><td> Cell Culture Medium </td><td> Chang und Spitzer, 2009 54 </td><td> 116 mM NaCl 0,67 mM KCl 2 mM CaCl 2 1,31 mM MgSO 4 4,6 mM Tris 1% (v: v) Penicillin / Streptomycin Der pH-Wert auf 7,8 mit HCl. Filter, indem sie durch eine 0,22 um CN-Filter sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C. </td></tr><tr><td> Calcium-Magnesium Kostenlose Medium (CMF) </td><td> Gu et al, 1994 42;. Gu und Spitzer, 1995 55 </td><td> 116 mM NaCl 0,67 mM KCl 4,6 mM Tris 0,4 mM EDTA 1% (v: v) Penicillin / Streptomycin Der pH-Wert auf 7,8 mit HCl. Filter, indem sie durch eine 0,22 um CN-Filter sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C. </td></tr><tr><td> Maleinsäure-Puffer (MAB) </td><td> Sive et al., 2000 53 </td><td> 100 mM Maleinsäure 150 mM NaCl (pH 7,5). </td></tr><tr><td> Marcs Modified Ringers (MMR), 10X </td><td> Sive et al., 2000 53 </td><td> 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO 4 2 mM CaCl 2 5 mM HEPES pH mit NaOH auf 7,4 eingestellt 0,1 X MMR enthält auch 50 mg / ml Gentamicinsulfat und der pH wird mit NaOH auf 7,4 eingestellt. </td></tr><tr><td> MEMFA Solution, 10X </td><td> Sive et al., 2000 53 </td><td> 0,1 M MOPS (pH 7,4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO 4 3,7% Formaldehyd A 10X Lösung, ohne Formaldehyd, bei 4 ° C gelagert werden Formaldehyd zugegeben frischen (1/10 Volumen einer Standard-37% Aktien). </td></tr><tr><td> In-situ-Hybridisierung Buffer </td><td> SivE et al., 2000 53 </td><td> 50% Formamid 5X SSC 1 mg / ml RNA Torula 100 mg / ml Heparin 1X Denharts Lösung 0,1% Tween 20 0,1% CHAPS 10 mM EDTA. </td></tr></tbody></table> Solutions. * Gentamicin, ein Antibiotikum, wird in unserem MMR-Lösungen verwendet werden, während Penicillin und Streptomycin in unserer Kultur Medien verwendet werden. </td></tr></tbody></table>

dissection, culture, and analysis of xenopus laevis embryonic retinal tissue

Der Prozess, durch den vorderen Bereich des Neuralplatte ergibt sich die Retina von Wirbeltieren weiterhin ein wichtiger Schwerpunkt der klinischen und der Grundlagenforschung sein. Neben der offensichtlichen medizinischen Relevanz für das Verständnis und die Behandlung von Netzhauterkrankungen, weiterhin die Entwicklung der Retina von Wirbeltieren als ein wichtiges und elegantes Modell für das Verständnis neuronaler Zelltyp Bestimmung und Unterscheidung 1-16 dienen. Das neurale Retina besteht aus sechs diskrete Zelltypen (Ganglion amakrinen, horizontal, Fotorezeptoren, bipolaren Zellen, und Müller Gliazellen) in stereotypen Schichten angeordnet sind, ein Muster, das weitgehend unter allen Vertebraten 12,14-18 konserviert ist. Während des Studiums der Netzhaut im intakten entwickelnden Embryo ist eindeutig für das Verständnis erforderlich, wie dieses komplexe Organ von einem Vorsprung des Vorderhirns in eine geschichtete Struktur entwickelt, gibt es viele Fragen, die fro profitierenm Einsatz Ansätze unter Verwendung von primären Zellkulturen von mutmaßlichem Netzhautzellen 7,19-23. Beispielsweise Analysieren von Zellen aus Geweben entfernt und dissoziiert in verschiedenen Phasen ermöglicht es, den Stand der Spezifikation der einzelnen Zellen in verschiedenen Entwicklungsstadien unterscheiden, das heißt, das Schicksal der Zellen in Abwesenheit von Wechselwirkungen mit benachbarten Geweben 8,19-22 ,24-33. Primäre Zellkultur ermöglicht auch die Ermittler, die Kultur mit spezifischen Reagenzien zu behandeln und analysieren die Ergebnisse auf einer einzigen Zellebene 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, ein klassisches Modellsystem für die Untersuchung von frühen neuralen Entwicklung 19,27,29,31-32,40-42, dient als ein besonders geeignetes System zur Netzhaut primäre Zellkultur 10,38,43-45. Mutmaßlich Netzhautgewebe ist von den frühesten Stadien der Entwicklung, unmittelbar nach neuralen Induktion 25,38,43. Darüber hinaus, th gegebenbei dem jede Zelle im Embryo eines Vorrats von Eigelb enthält, retinaler Zellen in einem sehr einfachen definierten Medien, bestehend aus einer gepufferten Salzlösung kultiviert werden, wodurch das Entfernen der Wirkung von Störfaktoren Inkubation Seren oder anderen Produkten auf 10,24,44-45 . Allerdings ist die Isolierung des Retinagewebe vom umgebenden Gewebe und der nachfolgenden Verarbeitung schwierig. Hier stellen wir ein Verfahren zur Präparation und Dissoziation von Retinazellen in Xenopus laevis, die zum primären Zellkulturen, die wiederum für Calcium Aktivität und Genexpression bei der Auflösung von einzelnen Zellen analysiert werden vorbereitet wird. Während das Thema in diesem Papier ist die Analyse der spontanen Kalzium Transienten ist die Technik breit anwendbar auf ein breites Spektrum von Fragestellungen und Ansätze (Abbildung 1).

Beispiele von erfolgreich seziert Augenblasen (Stadium 25) und retinae (Stufe 35) sind in den Figuren 2E und 2J gezeigt. Während dieses Protokoll in verschiedenen Stadien der Entwicklung verwendet werden kann, ist es entscheidend, um nur Retinagewebe zu erhalten, um die Genauigkeit für weitere Experimente gewährleisten. Entfernen Sie vorsichtig die Epidermis in allen Phasen und sicherzustellen, dass Ihre Pinzette nicht Punktion der Netzhautgewebe. In der Stufe 35 oder älter, kann die Linse als klare...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue at JoVE.com

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis bietet ein ideales Modellsystem zur Untersuchung von Zell Schicksal Spezifikation und physiologische Funktion der einzelnen Zellen der Netzhaut in primären Zellkulturen. Hier stellen wir eine Technik zum Präparieren Netzhautgewebe und Erzeugen primären Zellkulturen, die für Calcium-Aktivität abgebildet und analysiert werden durch in situ-Hybridisierung.

Dissection, Kultur und Analyse der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryonic Netzhautgewebe

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

dissection-culture-analysis-xenopus-laevis-embryonic-retinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

13.7K Aufrufe.  College of William and Mary. Xenopus laevis bietet ein ideales Modellsystem zur Untersuchung von Zell Schicksal Spezifikation und physiologische Funktion der einzelnen Zellen der Netzhaut in primären Zellkulturen. Hier stellen wir eine Technik zum Präparieren Netzhautgewebe und Erzeugen primären Zellkulturen, die für Calcium-Aktivität abgebildet und analysiert werden durch in situ-Hybridisierung.