Gli autori desiderano ringraziare Elliot Bourgeois per la sua assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of concede Salute R01HD059288 e R01NS069629.

1. Laterale Fluid Infortunio Percussioni <ol><li> Anestetizzare il mouse usando una miscela di ketamina e xilazina intraperitoneale dato. Preparare quindi la testa del mouse per incisione con uno scrub iodio. </li><li> Eseguire una craniectomia sopra la zona parietale destra con 3 mm (diametro esterno) trapano. </li><li> Sicuro Luer-loc mozzo dell&#39;ago (diametro interno 3 mm) sul craniectomia utilizzando acrilico cyanoarylate e dentale. </li><li> 24 ore più tardi, anestetizzare il mouse usando isoflurano per inalazione. </li><li> Una volta riprende respirazione normale, ma prima che il mouse diventa sensibile alla stimolazione, fornire impulsi 20 msec di soluzione fisiologica nel cranio attraverso il dispositivo fluido pregiudizio percussioni. </li><li> Subito dopo l&#39;infortunio rimuovere l&#39;hub, reanaesthetize il mouse usando isoflurano, e suturare il cuoio capelluto chiuso. Sham comandi azionati riceverà una procedura identica a passo 1,5 omesso. </li></ol> 2. Behavioral Analysis - Resp. paura condizionataOnse <ol><li> Maneggiare i topi in due giorni consecutivi prima della risposta di paura condizionata (CFR) di formazione. </li><li> Del mouse posto in camera di condizionamento per 3 minuti prima di somministrare 1,5 scosse piano mA per 2 sec. Lasciare mouse in camera per altri 30 sec. </li><li> Dopo il periodo di ritardo (di solito 24 ore), il mouse per tornare camera di condizionamento per 5 min. Valutare il congelamento a intervalli di 5 sec. L&#39;analisi consiste nel confrontare la quantità relativa di congelamento tempo in due popolazioni, nel nostro caso cerebrolesi e topi sham comandi azionati. Tassi più bassi di congelamento (rispetto al controllo) indica l&#39;incapacità di mantenere l&#39;associazione tra il contesto e lo shock pavimento, l&#39;indicazione di deficit di memoria e di disfunzione cognitiva. </li></ol> 3. Preparazione di acuta fettine di ippocampo * Nota: anesthetization utilizzando una campana può essere implementato solo per le procedure terminali (la dissezione cervello qui descritto). <ol><li> 7 giorni dopolesioni, fare 1 l di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) e 250 ml di soluzione di saccarosio di taglio. </li><li> Utilizzare il ghiaccio liberamente per assicurare che tutti gli strumenti e le soluzioni utilizzate durante la preparazione del cervello fetta sono fredda come il ghiaccio. </li><li> Anestetizzare mouse utilizzando isoflurano. In modo rapido e rimuovere delicatamente cervello da topo e il luogo in saccarosio. </li><li> Cervello assetto e posto sulla superficie di taglio su una goccia di colla di fronte a un blocco agar. </li><li> Tagliare 350 micron fette coronali, si dovrebbe essere in grado di ottenere 4 o 5 fette con il circuito intatto ippocampale. </li><li> Incubare fette per almeno 1 ora a 37 ° C. </li></ol> 4. Campo di registrazione extracellulare potenziale <ol><li> Tirare elettrodi in vetro borosilicato a 2-5 MΩs con estrattore verticale. </li><li> Fetta Mettere in camera e l&#39;elettrodo inserto sul porta elettrodo. </li><li> Abbassare elettrodo stimolante in sezione in un tratto assonale come il percorso perforante o dei collaterali Schaffer. Registrazione elettrodo inferiorein posizione mentre tracce di uscita monitoraggio per garantire che gli elettrodi siano allo stesso livello Z (profondità). Quando una risposta massima viene raggiunto, tenendo livello di stimolazione corrente costante, elettrodi sono allo stesso livello Z. </li><li> La traccia risultante è costituito da tre componenti: il volley in fibra presinaptica, il potenziale di campo extracellulare postsinaptico (fEPSP), e il picco della popolazione postsinaptico. I componenti possono coincidere temporalmente in alcune preparazioni, rendendo più difficile l&#39;analisi. Se c&#39;è ambiguità tra se le risposte sono presinaptica o postsinaptico, APV e CNQX può essere aggiunto al bagno di bloccare la trasmissione eccitatoria, e tutti i segnali rimanenti saranno di origine presinaptica. </li><li> Protocolli di stimolazione variano per produrre tre diversi tipi di esperimento: ingresso / uscita curve, registrazioni impulsi appaiati, e lungo termine esperimenti di plasticità. L&#39;analisi consiste tipicamente di misure confrontando la pendenza della fEPSP tutto in entrambi i cerebrolesi topi e fintiComandi azionati, per controllare la resistenza di ingresso misurando il volley fibra. </li></ol> 5. Visualizzati Patch-clamp registrazione <ol><li> Preparare fette, elettrodi, e rig per registrare come precedentemente descritto sopra fino al punto 4.2. </li><li> Considerazione solo le cellule più profonde di 80 micron nel tessuto come le cellule più vicine alla superficie sarà morto e / o hanno ridotto la connettività. Avvicina a una cella con pressione positiva sull&#39;elettrodo per garantire che non intasarsi mentre si sposta verso il basso attraverso il tessuto. Quando l&#39;elettrodo tocca delicatamente la cella applicare pressione negativa per creare un &#39;gigaseal&#39; tra l&#39;elettrodo e la membrana plasmatica. </li><li> Applicare brevi sequenze di pressione negativa per rompere le membrane Plama sotto l&#39;elettrodo e conseguire configurazione whole-cell. </li><li> Eliminare transienti di capacità con amplificatore e compensare la resistenza serie. Compensare la resistenza serie della cella è essenziale per garantire unccurate misurazioni. </li><li> Due modi di registrazioni singola cellula può essere effettuata: pinza amperometrica (potenziale di membrana di misura) e morsetto di tensione (misura corrente che passa attraverso i canali ionici della membrana). Possibili tipi di analisi sono numerosi, ma nel nostro caso consistono per lo più di analisi biofisica quantificare la frequenza e le dimensioni delle correnti sinaptiche spontanee in entrambi i cerebrolesi topi e sham-operati controlli. </li></ol> 6. Tensione Dye Sensitive Imaging (VSD) <ol><li> Preparare fette e rig per registrare come precedentemente descritto sopra fino al punto 4.2. </li><li> Preparare magazzino colorante mescolando 1 mg di-3-ANEPPDHQ in 50 microlitri di etanolo; erogare 2 pl aliquote in provette stagnola avvolto, conservare a -20 ° C. Preparare la soluzione di tintura al giorno, diluendo 1:200 in aCSF. </li><li> Incubare fetta su aCSF inumidito carta da filtro e colorare con 90 ml di colorante per 16 minuti, risciacquare con aCSF e mettere in camera di interfaccia di registrazione. </li><li> Regolare la luce stimulatiointensità fino a n risposta è centrata nel mezzo della gamma di telecamere. Le immagini sono acquisite tipicamente ad una velocità di 500-1000 fotogrammi al secondo. </li><li> Shutter trigger per la stimolazione della luce 200 msec prima della stimolazione elettrica per consentire un rapido iniziale photobleaching a stabilizzarsi. Prove di acquisizione alternate tra stimolati elettricamente, e non stimolati elettricamente, per consentire successivamente la sottrazione del fondo non stimolata. Record intensità luminosa di riposo (lettura della fluorescenza con otturatore chiuso) prima di aprire di scatto. Ogni prova VSD sarà un pixel per pixel x y dal tempo &quot;film&quot; di letture di fluorescenza. Record 10-12 VSD prove in ogni condizione di test. </li><li> Tutte le misure sono effettuate su intra-pixel cambiamento pre-stimolo elettrico-fluorescenza normalizzata, dF / F, che viene calcolato come segue: Sottrarre l&#39;intensità di riposo luce del VSD prima prova acquisita. Per ogni pixel in ogni prova, normalizzare secondo il pre-elettrico-stimolo per tale valore medioprova, e sottraendo l&#39;unità. Fate questo per entrambe le prove elettricamente stimolate e non stimolate elettricamente. Creare un media &quot;fluorescenza di fondo&quot; prova dalle prove non stimolate elettricamente, e sottrarre questo studio sfondo dalle prove elettricamente stimolati. Ulteriori analisi viene tipicamente eseguita in media di 10 - 12 tali prove, che sono di solito filtrati nello spazio e nel tempo per migliorare il rapporto segnale-rumore. </li></ol> 7. Dissezioni regionali per analisi biochimiche <ol><li> Rimuovere il cervello dal mouse come precedentemente descritto. </li><li> Preparare le fette che utilizzano chopper tessuto. </li><li> Lay sezione piatta, microdissect zona CA1 e DG. </li><li> Subito immergere in inibitore della proteasi tampone di lisi contenente. Congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C. </li></ol> 8. Risultati rappresentativi I nostri esperimenti iniziano tipicamente con i dati comportamentali per confermare l&#39;aspettaEd deficit cognitivi che esistono in cerebrolesi topi. Ci avvaliamo di contestuale condizionata test risposta di paura in quanto è un comportamento ippocampale dipendente che sia affidabile e richiede solo una sessione di allenamento e una sessione di test. I dati illustrati nella figura 2 rappresenta test comportamentale per misurare memoria anterograda, tuttavia, il test può essere utilizzato per misurare la memoria retrograda se l&#39;allenamento viene eseguita prima della lesione. Campo potenziale postsinaptico eccitatorio (fEPSPs) sono misurate per determinare l&#39;efficacia sinaptica netto di una vasta popolazione di cellule (Figura 3A). Noi comunemente impiegano tre diversi tipi di pattern di stimolazione, ciascuno offrendo i propri risultati e le conclusioni. Prima, aumentando l&#39;intensità di stimolazione attraverso una serie di passi, si crea un ingresso / uscita curva (Figura 3B / C). Successivo, fornendo due stimolazioni della stessa intensità separatad da un breve ritardo (di solito 50 msec) indaghiamo alterazioni potenziali probabilità di rilascio delle vescicole sinaptiche,. Inoltre, spesso eseguire potenziamento a lungo termine (LTP) esperimenti. Dopo aver stabilito una risposta basale, breve stimolazione ad alta frequenza (solitamente 100Hz) alla stessa intensità viene consegnato, provocando una cascata intracellulare che porta ad una risposta sinaptica potenziato quando la stimolazione riprende normalmente. L&#39;attività elettrica da whole-cell patch-bloccato le cellule può essere registrato in due modi. In modalità morsetto di tensione, lo sperimentatore controlla la tensione di membrana della cellula di patch-clamp in riferimento alla vasca, tramite software associato con l&#39;amplificatore. In questo caso le correnti di mediazione eventi postsinaptici sono registrate, fornendo informazioni sulla frequenza di rilascio presinaptico, il numero dei recettori post-sinaptici attivati ​​e la concentrazione dei neurotrasmettitori vescicolare dei suini (Figura 4A). In modalità pinza amperometrica lo sperimentatoremanipola corrente iniettata e misura la risposta di tensione. Ciò può essere utile per determinare le caratteristiche del potenziale d&#39;azione, come soglia del potenziale d&#39;azione e metà larghezza. Queste caratteristiche permettono la classificazione funzionale di neuroni come eccitatoria o inibitoria sulla base delle loro modelli cottura potenziale di azione (Figura 4B). Al fine di verificare l&#39;identità cellulare si consiglia di riempire le celle con Giallo Lucifero dopo la registrazione e l&#39;identità visiva conferma per la presenza o l&#39;assenza di spine dendritiche. (Figura 4C, D). Un esempio dei risultati di un esperimento utilizzando tensione colorante sensibile per misurare le variazioni di tensione della membrana è illustrato in Figura 5. In questo caso, un elettrodo stimolante è stato posizionato nella via collaterale Schaffer e l&#39;attività neuronale risultante nella zona CA1 viene analizzato. Tensione colorante sensibile non riporta i valori assoluti di potenziale di membrana, ma tha cambiato in tensione da una condizione di base senza stimolazione. Tuttavia, analisi confrontando due condizioni (ad es cerebrolesi vs sham-operated) può essere usato per determinare i parametri spazio-temporali di alterazioni fisiologiche che non possono essere misurati usando fEPSPs o whole-cell patch-clamp. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4411/4411fig1.jpg" /> Figura 1. Schema del circuito ippocampale. Una sezione orizzontale attraverso l&#39;ippocampo. Le vie principali attraverso l&#39;ippocampo sono mostrati in giallo. Gli assoni dei neuroni nella corteccia entorinale progetto attraverso la via perforante nel giro dentato formare sinapsi con i dendriti delle cellule granulari del giro dentato. Granule progetto assoni delle cellule attraverso la via fibra di muschio CA3 dove formano sinapsi con i dendriti dei neuroni CA3. Gli assoni dei neuroni CA3 progetto attraverso la via Schaffer garanzia sul Dendrites di cellule piramidali CA1. Gli assoni delle cellule piramidali CA1 sporgere dell&#39;ippocampo attraverso il subiculum. Nota: anche raffigurati sono piramidali CA3 collaterali degli assoni delle cellule sporgenti all&#39;ippocampo controlaterale attraverso la fimbria. (CA1: Cornu Ammonis 1, CA2: Cornu Ammonis 2, CA3: Cornu Ammonis 3, DG: giro dentato, linea tratteggiata indica il corpo strato di cellule, linea continua indica i limiti strutturali.) <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4411/4411fig2.jpg" /> Figura 2. Rappresentante dei dati comportamentali A:. Dati comportamentali che rappresentano la differenza nei tassi di congelamento tra topi cerebrolesi (FPI) e sham comandi azionati (sham) nel paradigma condizionato risposta di paura. La formazione si è verificato l&#39;infortunio giorno 6 ° successivo, con il periodo di prova nel 24 ore più tardi. (** Indica p &lt;.01). <img alt="Figura 3" fo:content-wIDþ = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/4411/4411fig3highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/4411/4411fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Dati rappresentativi registrazione extracellulare A:. Un esempio di un campo eccitatorio postsinaptico potenziale (fEPSP) registrazione nella zona CA1. La prima deviazione verso il basso è il manufatto stimolo, seguita dalla volley fibra presinaptica e infine il fEPSP. B: ingresso / uscita curva che rappresenta una diminuzione netta efficacia sinaptica in CA1 lesioni seguente percussioni fluido (FPI). C: ingresso / uscita delle curve che rappresentano un incremento netto di efficacia sinaptica in giro dentato (DG) a seguito di FPI. (* Indica p &lt;.05.) <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4411/4411fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4411/4411fig4.jpg" /> Figura 4. Rappresentativi whole-cell patch-clamp. Dati A: Un esempio spontaneaeccitatori corrente postsinaptica (sEPSC) da una cella CA1 piramidale. B: Esempi di treni potenziale di azione da una cella CA1 piramidale (traccia superiore) e un veloce spiking CA1 interneuroni (traccia inferiore). C: Esempio di un giallo Lucifero riempito CA1 interneurone inibitorio. Si noti l&#39;assenza di spine dendritiche (pannello superiore). D: Esempio di Lucifero giallo riempito CA1 neurone piramidale. Si noti la presenza di spine dendritiche (pannello superiore). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4411/4411fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4411/4411fig5.jpg" /> Figura 5. Rappresentante di tensione Dati sensibili Imaging Dye A:. Topo fetta coronale ippocampale visualizzata per mostrare l&#39;anatomia. (DG: giro dentato, CA1: Cornu Ammonis 1) B: giallo per pixel rossi che rappresentano l&#39;attività eccitatoria nella zona CA1 14 msec dopo la stimolazione afferente collaterali Schaffer. Rosso indicates più depolarizzazione mentre il giallo indica una depolarizzazione inferiore, ma comunque significativa. C: pixel blu che rappresentano siti di attività inibitoria nella zona CA1 56 msec dopo la stessa stimolazione afferente garanzia Schaffer in blu scuro B. indica più iperpolarizzazione.

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	<li>Faul, M., Xu, L., Wald, M. M., Coronado, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+Brain+Injury+in+the+United+States:+Emergency+Department+Visits+Hospitalizations+and+Deaths+2002-2006.">Traumatic Brain Injury in the United States: Emergency Department Visits Hospitalizations and Deaths 2002-2006.</a> Centers for Disease Control and Prevention, National Center for Injury Prevention and Control. , (2010).</li><li>McAllister, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropsychiatric+sequelae+of+head+injuries.">Neuropsychiatric sequelae of head injuries.</a> Psychiatr. Clin. North Am. 15, 395-413 (1992).</li><li>Pierce, J. E., Smith, D. H., Trojanowski, J. Q., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enduring+cognitive,+neurobehavioral+and+histopathological+changes+persist+for+up+to+one+year+following+severe+experimental+brain+injury+in+rats.">Enduring cognitive, neurobehavioral and histopathological changes persist for up to one year following severe experimental brain injury in rats.</a> NSC. 87, 359-369 (1998).</li><li>Dixon, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluid+percussion+model+of+experimental+brain+injury+in+the+rat.">A fluid percussion model of experimental brain injury in the rat.</a> J. Neurosurg. 67, 110-119 (1987).</li><li>McIntosh, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traumatic+brain+injury+in+the+rat:+characterization+of+a+lateral+fluid-percussion+model.">Traumatic brain injury in the rat: characterization of a lateral fluid-percussion model.</a> Neuroscience. 28, 233-244 (1989).</li><li>Carbonell, W. S., Grady, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+and+temporal+characterization+of+neuronal,+glial,+and+axonal+response+after+traumatic+brain+injury+in+the+mouse.">Regional and temporal characterization of neuronal, glial, and axonal response after traumatic brain injury in the mouse.</a> Acta Neuropathol. 98, 396-406 (1999).</li><li>Toth, Z., Hollrigel, G. S., Gorcs, T., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instantaneous+perturbation+of+dentate+interneuronal+networks+by+a+pressure+wave-transient+delivered+to+the+neocortex.">Instantaneous perturbation of dentate interneuronal networks by a pressure wave-transient delivered to the neocortex.</a> J. Neurosci. 17, 8106-8117 (1997).</li><li>D'Ambrosio, R., Maris, D. O., Grady, M. S., Winn, H. R., Janigro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+loss+of+hippocampal+long-term+potentiation,+but+not+depression,+following+fluid+percussion+injury.">Selective loss of hippocampal long-term potentiation, but not depression, following fluid percussion injury.</a> Brain Res. 786, 64-79 (1998).</li><li>Witgen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+hippocampal+alteration+associated+with+cognitive+deficit+following+experimental+brain+injury:+A+systems,+network+and+cellular+evaluation.">Regional hippocampal alteration associated with cognitive deficit following experimental brain injury: A systems, network and cellular evaluation.</a> Neuroscience. 133, 1-15 (2005).</li><li>Schwarzbach, E., Bonislawski, D. P., Xiong, G., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+the+inability+to+induce+area+CA1+LTP+in+the+mouse+after+traumatic+brain+injury.">Mechanisms underlying the inability to induce area CA1 LTP in the mouse after traumatic brain injury.</a> Hippocampus. 16, 541-550 (2006).</li><li>Cole, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+branched+chain+amino+acids+ameliorate+injury-induced+cognitive+impairment.">Dietary branched chain amino acids ameliorate injury-induced cognitive impairment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 366-371 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ogni tecnica di cui sopra contribuisce alla maggiore comprensione del meccanismo di fondo che ha causato il deficit osservato comportamentale. Combinando le informazioni uniche acquisite da ciascun metodo siamo in grado di esaminare i meccanismi biologici con più precisione. FEPSPs di misura è utile per quantificare l&#39;efficacia sinaptica netto di grandi regioni spazialmente definiti di neuroni. E &#39;anche in grado di fornire informazioni circa la possibilità di un gruppo di cellule ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome dell&#39;apparecchiatura </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Axopatch 200B amplificatore </td><td> Molecular Devices </td><td> AXOPATCH 200B </td><td> Patch-clamp rig </td></tr><tr><td> Digidata 1322A digitalizzatore </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> Patch-clamp rig </td></tr><tr><td> MP-225 micromanipolatore </td><td> Sutter </td><td> MP-225 </td><td> Patch-clamp rig </td></tr><tr><td> DMLFSA microscopio </td><td> Leica </td><td></td><td> Patch-clamp rig </td></tr><tr><td> Multiclamp amplificatore 700B </td><td> Molecular Devices </td><td> Multiclamp 700B </td><td> Multiuso (campo)impianto </td></tr><tr><td> Digidata 1440 digitalizzatore </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> Multipurpos (campo) rig </td></tr><tr><td> MPC-200 micromanipolatore </td><td> Sutter </td><td> MPC-200 </td><td> Multiuso (campo) rig </td></tr><tr><td> BX51WI microscopio </td><td> Olimpo </td><td> BX51WI </td><td> Multiuso (campo) rig </td></tr><tr><td> Axoclamp amplificatore 900A </td><td> Molecular Devices </td><td> Axoclamp 900A </td><td> VSD rig </td></tr><tr><td> Digidata 1322 digitalizzatore </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td> VSD rig </td></tr><tr><td> Redshirt CCD-SMQ fotocamera </td><td> Redshirt </td><td> NCS01 </td><td> VSD rig </td></tr><tr><td> VT 1200S vibratomo </td><td> Leica </td> &lt;td&gt; 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> P-30 Elettrodo estrattore </td><td> Sutter </td><td> P-30 / P </td><td></td></tr><tr><td> inibitore della proteasi COMPLETO </td><td> Roche </td><td> 11697498001 </td><td></td></tr></tbody></table>

investigations on alterations of hippocampal circuit function following mild traumatic brain injury

Traumatic Brain Injury (TBI) colpisce più di 1,7 milioni di persone negli Stati Uniti ogni anno e anche lieve trauma cranico può portare a deficit neurologici persistenti 1. Due sintomi pervasivi e disattivazione incontrati dai sopravvissuti TBI, deficit di memoria e una riduzione della soglia convulsiva, si pensa siano mediati da TBI-indotta disfunzione ippocampale 2,3. Al fine di dimostrare come alterazione della funzione del circuito ippocampale influenza negativamente il comportamento dopo TBI nei topi, ci avvaliamo di laterale lesioni percussioni fluido, un modello animale comunemente usato per trauma cranico che riproduce molte caratteristiche del trauma cranico umano tra cui la perdita neuronale, gliosi, e la perturbazione ionica 4 - 6. Qui mostriamo un metodo combinatorio per indagare TBI-indotta disfunzione ippocampale. Il nostro approccio comprende molteplici tecniche fisiologiche ex vivo con comportamento animale e analisi biochimica, per analizzarepost-TBI cambiamenti nell&#39;ippocampo. Cominciamo con il paradigma sperimentale di danno con l&#39;analisi comportamentale per valutare la disabilità cognitiva dopo trauma cranico. Successivamente, caratterizzato da tre distinte ex vivo le tecniche di registrazione: registrazione di campo extracellulare potenziale, visualizzabili whole-cell patch-bloccaggio, e della tensione di registrazione colorante sensibile. Infine, si dimostra un metodo per dissezione regionale sottoregioni dell&#39;ippocampo che può essere utile per l&#39;analisi dettagliata delle alterazioni neurochimiche e metaboliche post-TBI. Questi metodi sono stati utilizzati per esaminare le alterazioni nella circuiteria dell&#39;ippocampo dopo TBI e per sondare i cambiamenti opposti in funzione rete circuitale che si verificano nel giro dentato e sottoregioni CA1 dell&#39;ippocampo (vedi Figura 1). La capacità di analizzare i cambiamenti post-TBI in ogni sottoregione è essenziale per comprendere i meccanismi sottostanti che contribuiscono al trauma cranico indotta comportamentali e cognitive deficits. Il multi-sfaccettato sistema qui delineato consente agli investigatori di spingere caratterizzazione passato di fenomenologia indotta da uno stato di malattia (in questo caso TBI) e determinare i meccanismi responsabili della patologia osservata associata a trauma cranico.

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Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Un approccio multi-angolare per indagare cambiamenti funzionali al circuito ippocampale è spiegato. Tecniche elettrofisiologiche sono descritte con il protocollo infortunio, test comportamentali e metodo di dissezione regionale. La combinazione di queste tecniche possono essere applicate in modo simile ad altre regioni del cervello e domande scientifiche.

Indagini su Alterazioni della funzione del circuito ippocampale seguito lieve trauma cranico

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

investigations-on-alterations-hippocampal-circuit-function-following

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K Views.  Children's Hospital of Philadelphia. Un approccio multi-angolare per indagare cambiamenti funzionali al circuito ippocampale è spiegato. Tecniche elettrofisiologiche sono descritte con il protocollo infortunio, test comportamentali e metodo di dissezione regionale. La combinazione di queste tecniche possono essere applicate in modo simile ad altre regioni del cervello e domande scientifiche.

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Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Effetti del Neurotrauma indotta da Blast il roditore pressurizzato Middle arterie cerebrali

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

Ricerca

Neuroscienze

Investigating Alterations in Caecum Microbiota After Traumatic Brain Injury in Mice

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also demonstrate that traumatic brain injuries cause changes to the gut microbiota. However, mechanisms underlying the bidirectional regulation of the brain-gut axis remain unknown. Currently, few models exist for studying the changes in gut microbiota after traumatic brain injury. Therefore, the presented study combines protocols for inducing traumatic brain injury using a lateral fluid percussion device and analysis of caecum samples following injury for investigating alterations in the gut microbiome. Alterations of the gut microbiota composition after traumatic brain injury are determined using 16S-rDNA sequencing. This protocol provides an effective method for studying the relationships between enteric microorganisms and traumatic brain injury.

Presented here is a protocol to induce diffuse traumatic brain injury using a lateral fluid percussion device followed by the collection of the caecum content for gut microbiome analysis.

Indagare sulle alterazioni nel caecum Microbiota dopo una lesione cerebrale traumatica nei topi

Increasing evidence shows that the microbiota-gut-brain axis plays an important role in the pathogenesis of brain diseases. Several studies also ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.

Advanced Diffusion Imaging nell'ippocampo di ratti con lievi lesioni cerebrali traumatiche

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous ...

Low-intensity Blast Wave Model for Preclinical Assessment of Closed-head Mild Traumatic Brain Injury in Rodents

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of medical visits in the United States. There are currently no FDA-approved treatments available for TBI. The increased incidence of military-related, blast-induced TBI further accentuates the urgent need for effective TBI treatments. Therefore, new preclinical TBI animal models that recapitulate aspects of human blast-related TBI will greatly advance the research efforts into the neurobiological and pathophysiological processes underlying mild to moderate TBI as well as the development of novel therapeutic strategies for TBI.
Here we present a reliable, reproducible model for the investigation of the molecular, cellular, and behavioral effects of mild to moderate blast-induced TBI. We describe a step-by-step protocol for closed-head, blast-induced mild TBI in rodents using a bench-top setup consisting of a gas-driven shock tube equipped with piezoelectric pressure sensors to ensure consistent test conditions. The benefits of the setup that we have established are its relative low-cost, ease of installation, ease of use and high-throughput capacity. Further advantages of this non-invasive TBI model include the scalability of the blast peak overpressure and the generation of controlled reproducible outcomes. The reproducibility and relevance of this TBI model has been evaluated in a number of downstream applications, including neurobiological, neuropathological, neurophysiological and behavioral analyses, supporting the use of this model for the characterization of processes underlying the etiology of mild to moderate TBI.

We present here a protocol of a blast wave model for rodents to investigate neurobiological and pathophysiological effects of mild to moderate traumatic brain injury. We established a gas-driven, bench-top setup equipped with pressure sensors allowing for reliable and reproducible generation of blast-induced mild to moderate traumatic brain injury.

Modello di onda d'esplosione a bassa intensità per la valutazione preclinica della lesione cerebrale traumatica lieve a testa chiusa nei roditori

Traumatic brain injury (TBI) is a large-scale public health problem. Mild TBI is the most prevalent form of neurotrauma and accounts for a large number of ...

Electromagnetic Controlled Closed-Head Model of Mild Traumatic Brain Injury in Mice

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and understanding the mechanisms of how a TBI alters brain function. The availability of multiple animal models of TBI is necessary to model the different aspects and severities of TBI seen in people. This manuscript describes the use of a midline closed head injury (CHI) to develop a mouse model of mild TBI. The model is considered mild because it does not produce structural brain lesions based on neuroimaging or gross neuronal loss. However, a single impact creates enough pathology that cognitive impairment is measurable at least 1 month after injury. A step-by-step protocol to induce a CHI in mice using a stereotaxically guided electromagnetic impactor is defined in the paper. The benefits of the mild midline CHI model include the reproducibility of the injury-induced changes with low mortality. The model has been temporally characterized up to 1 year after the injury for neuroimaging, neurochemical, neuropathological, and behavioral changes. The model is complementary to open skull models of controlled cortical impact using the same impactor device. Thus, labs can model both mild diffuse TBI and focal moderate-to-severe TBI with the same impactor.

The protocol describes mild traumatic brain injury in a mouse model. In particular, a step-by-step protocol to induce a mild midline closed head injury and the characterization of the animal model is fully explained.

Modello elettromagnetico controllato a testa chiusa di lieve lesione cerebrale traumatica nei topi

Highly reproducible animal models of traumatic brain injury (TBI), with well-defined pathologies, are needed for testing therapeutic interventions and ...

Assessing Changes in Synaptic Plasticity Using an Awake Closed-Head Injury Model of Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of closed-head mTBI in the preclinical setting to increase translatability to the clinical population. The awake closed-headed injury (ACHI) model uses a modified controlled cortical impactor to deliver closed-headed injury, inducing clinically relevant behavioral deficits without the need for a craniotomy or the use of an anesthetic.
This technique does not normally induce fatalities, skull fractures, or brain bleeds, and is more consistent with being a mild injury. Indeed, the mild nature of the ACHI procedure makes it ideal for studies investigating repetitive mTBI (r-mTBI). Growing evidence indicates that r-mTBI can result in a cumulative injury that produces behavioral symptoms, neuropathological changes, and neurodegeneration. r-mTBI is common in youths playing sports, and these injuries occur during a period of robust synaptic reorganization and myelination, making the younger population particularly vulnerable to the long-term influences of r-mTBI.
Further, r-mTBI occurs in cases of intimate partner violence, a condition for which there are few objective screening measures. In these experiments, synaptic function was assessed in the hippocampus in juvenile rats that had experienced r-mTBI using the ACHI model. Following the injuries, a tissue slicer was utilized to make hippocampal slices to evaluate bidirectional synaptic plasticity in the hippocampus at either 1 or 7 days following the r-mTBI. Overall, the ACHI model provides researchers with an ecologically valid model to study changes in synaptic plasticity following mTBI and r-mTBI.

Here, it is demonstrated how an awake closed-head injury model can be used for examining the effects of repeated mild traumatic brain injury (r-mTBI) on synaptic plasticity in the hippocampus. The model replicates important features of r-mTBI in patients and is used in conjunction with in vitro electrophysiology.

Valutazione dei cambiamenti nella plasticità sinaptica utilizzando un modello di trauma cranico chiuso sveglio di lieve lesione cerebrale traumatica

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a prevalent health issue in North America. There is increasing pressure to utilize ecologically valid models of ...

Convalida della risposta alle lesioni e delle valutazioni comportamentali in un modello di ratto mTBI

Rat Model of Closed-Head Mild Traumatic Injury and its Validation

Animal models are crucial for advancing our understanding of mild traumatic brain injury (mTBI) and guiding clinical research. To achieve meaningful insights, developing a stable and reproducible animal model is essential. In this study, we report a detailed description of a closed-head mTBI model and a representative validation method using Sprague-Dawley rats to verify the modeling effect. The model involves dropping a 550 g mass weight from a height of 100 cm directly onto the head of a rat on a destructible surface, followed by a 180-degree turn. To assess the injury, rats underwent a series of neurobehavioral assessments 10 min post-injury, including time of loss of consciousness, first seeking-behavior time, escape ability, and beam balance ability test. During the acute and subacute stages following the injury, behavioral tests were conducted to assess motor coordination ability (Beam task), anxiety (Open Field test), and learning and memory abilities (Morris Water Maze test). The closed-head mTBI model produced a consistent injury response with minimal mortality and replicated real-life situations. The validation method effectively verified the model development and ensured the stability and consistency of the model.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca sulle lesioni cerebrali traumatiche - Un modello a testa chiusa per una replicazione accurata e una valutazione rapida 

Here, we present a closed-head mild traumatic brain injury (mTBI) rat model and its validation exhibiting remarkable similarity to human mTBI concerning behavioral manifestations during the acute and subacute stages.

Modello di ratto di lesione traumatica lieve a testa chiusa e sua convalida

Animal models are crucial for advancing our understanding of mild traumatic brain injury (mTBI) and guiding clinical research. To achieve meaningful ...

Induzione di rmTBI nei topi tramite un metodo di lesione a testa chiusa

Modified Mouse Model of Repetitive Mild Traumatic Brain Injury Incorporating Thinned-Skull Window and Fluid Percussion

Mild traumatic brain injury is a clinically highly heterogeneous neurological disorder. Highly reproducible traumatic brain injury (TBI) animal models with well-defined pathologies are urgently needed for studying the mechanisms of neuropathology after mild TBI and testing therapeutics. Replicating the entire sequelae of TBI in animal models has proven to be a challenge. Therefore, the availability of multiple animal models of TBI is necessary to account for the diverse aspects and severities seen in TBI patients. CHI is one of the most common methods for fabricating rodent models of rmTBI. However, this method is susceptible to many factors, including the impact method used, the thickness and shape of the skull bone, animal apnea, and the type of head support and immobilization utilized. The aim of this protocol is to demonstrate a combination of the thinned-skull window and fluid percussion injury (FPI) methods to produce a precise mouse model of CHI-associated rmTBI. The primary objective of this protocol is to minimize factors that could impact the accuracy and consistency of CHI and FPI modeling, including skull bone thickness, shape, and head support. By utilizing a thinned-skull window method, potential inflammation due to craniotomy and FPI is minimized, resulting in an improved mouse model that replicates the clinical features observed in patients with mild TBI. Results from behavior and histological analysis using hematoxylin and eosin (HE) staining suggest that rmTBI can lead to a cumulative injury that produces changes in both behavior and gross morphology of the brain. Overall, the modified CHI-associated rmTBI presents a useful tool for researchers to explore the underlying mechanisms that contribute to focal and diffuse pathophysiological changes in rmTBI.

Autore in primo piano: Ottimizzazione dei modelli di roditori per lo studio dei meccanismi e della riabilitazione nelle lesioni cerebrali traumatiche lievi ripetute

This protocol presents a modified mouse model of repetitive mild traumatic brain injury (rmTBI) induced via a closed-head injury (CHI) method. The approach features a thinned-skull window and fluid percussion to reduce the inflammation commonly caused by meninges exposure, along with improved reproducibility and accuracy in modeling rmTBI in rodents.

Modello murino modificato di lesione cerebrale traumatica lieve ripetitiva che incorpora finestra cranica assottigliata e percussione fluida

Mild traumatic brain injury is a clinically highly heterogeneous neurological disorder. Highly reproducible traumatic brain injury (TBI) animal models ...

Methods Article

Indagini su Alterazioni della funzione del circuito ippocampale seguito lieve trauma cranico