Questo lavoro è stato finanziato (in parte) con la Israel Science Foundation (Grant 399/11), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), nel quadro della convenzione tedesco-israeliano di cooperazione Progetto (DIP), e dall&#39;Istituto famiglia Rappaport per la Ricerca in le scienze mediche.

1. Generazione di linee cellulari inducibili <ol><li> Prima dell&#39;esperimento si ha la necessità di trovare la concentrazione minima del G418 farmaco che uccide le cellule utilizzate per la preparazione delle linee cellulari desiderati. A questo scopo, le cellule piastra di scelta in più piastre duplicati a 70% di confluenza in mezzo che verrà utilizzato durante l&#39;esperimento e aggiungere concentrazioni crescenti di G418 (0-1000 mg per ml). Monitorare le cellule giornalieri per determinare la concentrazione minima G418 che uccide le cellule in modo efficiente. La morte cellulare si osserva entro 3-7 giorni. </li><li> Prima generazione di linee cellulari, si raccomanda di verificare mediante saggi di trasfezione transiente del plasmide che esprime la shRNA può ridurre in qualche misura l&#39;espressione del gene in esame. Questo può essere fatto in qualsiasi linea cellulare che può essere efficacemente trasfettate. </li><li> Piastra T-REX-293 cellule ad una densità di circa 5x10 6 cellule per piastra di 10 cm in 8 ml di terreno DMEM (contenente il 10% Tet sygambo FBS omologato, 2 mM L-glutammina, 100 unità per ml di penicillina e 0,1 mg per ml streptomicina, 5 pg per ml blasticidina). Incubare le piastre per una notte a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Il giorno seguente, cambiare il supporto a 8 ml di mezzo fresco prima della trasfezione. </li><li> Trasfettare le cellule con 10 pg di plasmide pSuperior.neo GFP + (Figura 1) o codifica ACF1 SNF2h shRNA guidata da un promotore inducibile da tetraciclina H1, nonché il gene di resistenza a neomicina fusa alla GFP e guidata da un promotore PGK costitutivo. Aggiungere il DNA a 500 pl di 150 mM NaCl. Aggiungere il reagente jetPIE ad un&#39;altra aliquota di 500 microlitri di NaCl 150 mM a 2 ml per DNA pg. Aggiungere la soluzione jetPIE al DNA e mescolare bene nel vortex. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Pipettare delicatamente complessi DNA sui 10 piatti cm contenente il 70-80% delle cellule confluenti. Riportare le piastre per l&#39;incubatore. </li><li> Il giorno successivo sostituire il mezzo con un terreno selettivo (DMEM comedescritto sopra contenente un ulteriore 500 pg per ml G418). </li><li> Per le due settimane successive monitorare le cellule e sostituire il terreno selettivo un fluido simile fresco ogni 3-4 giorni fino colonie appaiono e possono essere visualizzati senza un microscopio. </li><li> Prima di isolamento di colonie, preparare piastre da 24 pozzetti con terreno selettivo. </li><li> Identificare colonie a occhio, e contrassegnare la loro posizione sul fondo della piastra con un pennarello colorato. Verificare che sotto il microscopio che le colonie sono ben separati. </li><li> Nella cappa sterile, aspirare il terreno dalla piastra, risciacquare delicatamente con caldo PBS e aspirare bene tutto il liquido rimanente. Aggiungere 3 ml di 0,25% tripsina / EDTA ad una colonia sulla piastra. Pipettare la tripsina finché le cellule staccare e aggiungerli uno dei pozzi in 24 pozzetti. Ripetere questa operazione per diverse altre colonie sulla piastra. </li><li> Crescere le cellule a 37 ° C, 5% di CO 2 fino a riempire il pozzo. Poi dividere le cellule derivate daciascuna delle colonie originali in tre pozzi, ognuno in un separato di 12 pozzetti e incubare una notte. </li><li> Il giorno seguente, sostituire il mezzo in una piastra con terreno contenente 1 pg per ml di doxiciclina da una soluzione madre preparata in acqua bidistillata (1-5 mg per ml). Sostituire il mezzo in una piastra di controllo con il mezzo senza doxiciclina. Incubare le cellule per 72 ore a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Cellule raccolta da uno trattato ed uno non trattato bene di ogni clone cellulare per la preparazione di estratti proteici e analisi Western blot per determinare l&#39;efficienza di ACF1 o knockdown SNF2h. Utilizzare anticorpi ACF1 o SNF2h nonché anticorpi alfa-tubulina, che serve come controllo di caricamento. Utilizzare le cellule nel terzo pozzo, non trattata, per l&#39;espansione di cloni di cellule selezionato in cui oltre doxiciclina portato ad almeno il 50% di riduzione del livello della proteina in esame. Congelare aliquote di queste cellule in 90% FBS, 10% DMSO per ulteriore uso. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. Induzione di Knockdown e Transfection <ol><li> Cellule piastra nel terreno selettivo in 10 piatti cm. Aggiungere doxiciclina a 1 pg per ml di mezzo le piastre e incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 per 48-72 h (vedere Figura 4). </li><li> Dopo 48-72 ore, Tripsinizzare le celle da ciascun gruppo di cellule, contarli, e piatto 1.5x10 6 cellule per 6 Piastra cm nel terreno stesso, con o senza doxiciclina. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% di CO 2 durante la notte. Piano in modo che ciascun gruppo di piastre di sezione 2,1 fornirà le cellule per dodici piastre 6 cm, di cui due duplicati per il saggio DAPI per ogni punto, nonché una piastra per analisi Western blot di ciascun campione (vedi figura 4). </li><li> Il giorno seguente trasfettare le cellule in piastre da 6 centimetri con le seguenti combinazioni di plasmidi: 1 ug di un plasmide vuoto o una quantità identica di plasmide codificante E4orf4, insieme con 4 mg di un vettoreesprimendo ACF1-GFP o GFP-SNF2h reso resistente alla shRNA nei cloni cellulari mediante introduzione di mutazioni silenti, o 3 mg del vettore corrispondente vuota e 1 mg plasmide esprimente GFP (Figura 4). Utilizzare il reagente jetPIE come descritto sopra (10 microlitri per 5 pg di DNA) per preparare la miscela di trasfezione. Per ogni campione, preparare una miscela di trasfezione per tre piatti. </li><li> A seguito di una incubazione di 15 min DNA con il reagente jetPIE a temperatura ambiente, lentamente pipettare quantità uguali di complessi DNA da ogni miscela di trasfezione su tre piastre 6 centimetri e incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 durante la notte. </li></ol> 3. Assay DAPI in cellule trasfettate <ol><li> Il giorno successivo, estrarre proteine ​​da un piatto per campione per analisi Western blot per determinare che ACF1 o SNF2h sono stati efficacemente abbattuto e che E4orf4 stata espressa ugualmente nei diversi campioni. </li><li> Aspirare il terreno dalle piastre destinate alla DAPIdosaggio, lavare i piatti delicatamente con PBS e aggiungere 1 ml di paraformaldeide al 4% preparato in PBS per coprire le cellule. Preparazione della soluzione di paraformaldeide e trattamento delle cellule con la sostanza chimica deve essere effettuata in una cappa chimica. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. </li><li> Aspirare il paraformaldeide e lavare tre volte con PBS, dondolo a temperatura ambiente per 5 minuti ogni volta. Aggiungere 80% etanolo tenuta a -20 ° C ed incubare a -20 ° C per almeno 1 ora. Le piastre possono essere tenuti sotto etanolo a -20 ° C per diversi giorni finché sono ben sigillati per impedire l&#39;evaporazione dell&#39;etanolo e asciugatura. </li><li> Aspirare l&#39;etanolo e lavare le cellule due volte con PBS ed una volta con PBS-BT (PBS contenente 0,5% di BSA e 0,05% Tween-20), dondolo a temperatura ambiente per 5 minuti ogni volta. </li><li> Per prevenire il legame non specifico degli anticorpi, bloccare le cellule in 1 ml di PBS-BT tampone contenente siero di capra 10% per 20 min mentre a dondolo a temperatura ambiente. Quindi lavare tegli le cellule due volte in PBS-BT, 5 minuti ogni lavaggio. </li><li> Incubare le cellule con l&#39;anticorpo primario (E4orf4 un anticorpo specifico nel nostro caso) in 1 ml di PBS-BT per 1 ora mentre a dondolo a temperatura ambiente. Poi lavare due volte in PBS-BT e una volta in PBS contenente 0,1% BSA, 5 min ogni lavaggio. </li><li> Incubare le cellule in 1 ml di PBS-BSA 0,1% contenente l&#39;appropriato anticorpo secondario marcato con fluorescenza e 0,5 pg per ml concentrazione finale di DAPI per 40 min mentre a dondolo a temperatura ambiente al buio. Poi lavare con PBS per 5 minuti, asciugare bene per aspirazione e mantenere le piastre capovolte per un&#39;ora aggiuntiva a notte per ottenere la completa essiccazione. Quindi montare vetrini di copertura sulle cellule, utilizzando Fluoromount-G soluzione. Conservare le piastre a 4 ° C al buio fino al momento di contare i nuclei apoptotici. </li><li> Fai un collega per identificare le varie piastre di nuovi numeri, in modo da contare nuclei apoptotici nei diversi campioni può essere fatto in modo imparziale. </li><li> Visualizza le cellule nel quadro di un upright microscopio a fluorescenza ad un ingrandimento di 400x (in aria) o 630x (immersione in olio). Identificare cellule trasfettate che sono colorate per le varie proteine ​​espresse in ciascun campione, e contare il numero di nuclei condensati o frammentati visualizzati tramite colorazione DAPI all&#39;interno della popolazione di cellule transfettate. Monitorare diversi campi e contare un totale di almeno 200 cellule trasfettate. </li><li> Calcolare la percentuale di nuclei con morfologia apoptotica all&#39;interno della popolazione di cellule transfettate. Ripetere l&#39;esperimento, con duplicati, 2-3 volte per calcolare la significatività statistica delle variazioni tra i vari campioni. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi L&#39;efficienza di colonie ottenendo in cui knockdown condizionale dell&#39;espressione genica ha avuto successo è variabile, a seconda del gene coinvolto. Nelle nostre mani, abbiamo ottenuto sette colonie di successo su 12 testati per ACF1 e 6 su 18 per SNF2h. Figura 2 shows un piatto rappresentativo di cloni di cellule selezionate (Figura 2A), così come una singola colonia (Figura 2B). Figura 3 mostra un blot rappresentativo preparato con proteine ​​estratte da cellule di vari cloni coltivati ​​in presenza o assenza di doxiciclina per 72 ore. Il blot è stato colorato con anticorpi SNF2h e-tubulina, che serve come controllo di caricamento. Due dei cloni (numero 4 e 5) ha mostrato una forte riduzione dei livelli SNF2h dopo induzione doxiciclina. Occorre notare che, sebbene la pSuperior.neo + plasmide GFP (Figura 1) utilizzato per la generazione di linee cellulari neo-codifica una proteina di fusione GFP, la fluorescenza verde nelle linee cellulari stabili era molto bassa e l&#39;espressione di altre proteine ​​di fusione GFP introdotto transitoriamente in queste cellule potrebbe essere facilmente individuata sopra la fluorescenza verde sfondo. Una rappresentazione schematica degli esperimenti effettuati nei cloni cellulari per misurareche l&#39;effetto di ACF1 o knockdown SNF2h E4orf4 sulla morte cellulare indotta è mostrato in fig. 4. Il tempo richiesto per knockdown dell&#39;espressione genica mediante trattamento doxiciclina può variare a seconda della stabilità della proteina i cui livelli devono essere ridotti. Per ACF1 e SNF2h, un trattamento di 72 ore è richiesto per knockdown efficiente a livello proteico. La figura 5 mostra un esempio di cellule esprimenti GFP e E4orf4 e subendo morte cellulare manifesta con la comparsa di DAPI-tinto nuclei con una morfologia condensato o frammentato. Figura 6 mostra i risultati di un esperimento rappresentativo che dimostra che doxiciclina indotta ACF1 knockdown portato ad un aumento E4orf4-stimolata morte cellulare (Figura 6A). Questo aumento non è stato determinato da un aumento dei livelli E4orf4 (Figura 6B). Inoltre, il ripristino delle ACF1 alle doxiciclina indotte cellule diminuito l&#39;aumento della tossicità E4orf4 ai livelli<html> osservata in cellule uninduced (Figura 6). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1.jpg" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4442/4442fig1highres.jpg"/> Figura 1. Mappa del + pSuperior.neo plasmide GFP. La mappa mostra la tetraciclina-inducibile promotore H1 guida shRNA espressione e l&#39;espressione promotore PGK di guida di un neo-proteina di fusione GFP. La mappa è stato adattato dal manuale OligoEngine pSuperior. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig2.jpg" /> Figura 2. Immagini di identificazione di colonie resistenti alla neomicina. Di una piastra contenente colonie (A) e di una singola colonia (B) sono mostrati. Le colonie sono stati ottenuti coltivando le cellule per 14 giorni in un mezzo selettivo contenente neomicina. ys &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig3.jpg" /> Figura 3. Cellule esame di efficienza knockdown in colonie selezionate. Di numerose colonie selezionati in presenza di neomicina sono state piastrate in pozzetti in duplicato. Un pozzetto di ciascun campione è stata indotta da doxiciclina (+) ed un pozzetto stata lasciata non trattata (-). Le proteine ​​sono state estratte 72 ore post-induzione e cromatografato su SDS-PAGE. Il Western blot è stata colorata successivamente con anticorpi SNF2h e di alfa-tubulina (che funge da controllo del carico) e mostra i livelli di SNF2h nelle cellule indotte e di controllo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig4.jpg" /> Figura 4. Progettando un tipico esperimento knockdown-DAPI dosaggio. Successive fasi dell&#39;esperimento sono mostrati, compreso il trattamento doxiciclina raggiungere ACF1 o knockdown SNF2h, una trasfezione per ripristinare ACF1 o SNF2h espressione o di introdurre una empty vettore e di introdurre E4orf4 o suo corrispondente vettore vuoto nelle cellule, e analisi dei risultati. Doxycycline trattati con piastre vengono visualizzati in rosso (Dox) e le piastre di controllo sono contrassegnati in blu. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4442/4442fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig5.jpg" /> Figura 5. Celle di rivelazione di E4orf4 morte cellulare indotta dal test DAPI. Sottoposti alle vari trattamenti descritti nella figura 4 sono state fissate e colorate con anticorpi specifici E4orf4 e DAPI per visualizzare i nuclei delle cellule trasfettate. Questa foto è stata scattata specifico da un campione contenente E4orf4 e la proteina GFP controllo. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) le immagini unite. Le frecce bianche mark-GFP e E4orf4-trasfettate cellule contenenti nuclei con morfologie apoptotici. Le frecce rossemarcare i nuclei con forme irregolari che non sono contati come nuclei apoptotici. Asterischi marchio nuclei mitotico o nuclei che si sono appena divisi. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4442/4442fig6.jpg" /> Figura 6. ACF1 knockdown migliora E4orf4 morte cellulare indotta. (A) Le cellule del T-rex-293 derivato da linea cellulare che esprime ACF1-shRNA da un promotore inducibile tetraciclina sono state indotte con doxiciclina (Dox +) o non trattata (-Dox). Tre giorni dopo, le cellule sono state trasfettate con plasmidi esprimenti E4orf4 (+ E4orf4) o un vettore vuoto (-E4orf4) insieme con un vettore vuoto o un plasmide che esprime GFP-tagged ACF1, che è stato reso resistente alla shRNA dall&#39;introduzione di silenzio mutazioni. Le cellule sono state fissate 24 ore dopo la trasfezione e colorate con anticorpi per E4orf4 e con DAPI. Induzione della morte cellulare è stata misurata con il test sopra descritto DAPI e la percentuale of cellule trasfettate con nuclei condensati o frammentati è stata determinata. Un esperimento rappresentativo di tre repliche è indicata, e le barre di errore rappresentano la deviazione standard. (B) Le cellule di piastre parallele sono state raccolte per l&#39;analisi Western blot. Il blot è stato macchiato con anticorpi E4orf4, GFP, e ACF1. Il endogena ACF1 e ACF1-GFP sono presenti in due pannelli separati.

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R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+suppression+of+tumorigenicity+by+virus-mediated+RNA+interference.">Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference.</a> Cancer. 2, 243-247 (2002).</li><li>Czauderna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+shRNA+expression+for+application+in+a+prostate+cancer+mouse+model.">Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model.</a> Nucleic acids research. 31, e127 (2003).</li><li>Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+conditional+vectors+for+hairpin+siRNA+knockdowns.">Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns.</a> Nucleic acids research. 31, e77 (2003).</li><li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+suppression+of+cellular+genes:+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference.">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> Journal of. 77, 8957-8961 (2003).</li><li>Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+targets+PP2A+to+the+ACF+chromatin-remodeling+factor+and+induces+cell+death+through+regulation+of+SNF2h-containing+complexes.">The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes.</a> Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).</li><li>Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase+activation+by+adenovirus+E4orf4+protein+is+cell+line-specific+and+is+mediated+by+the+death+receptor+pathway.">Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway.</a> J. Virol. 75, 789-798 (2001).</li><li>Shtrichman, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+type+5+E4+open+reading+frame+4+protein+induces+apoptosis+in+transformed+cells.">Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells.</a> J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).</li><li>Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4orf4+protein+interacts+with+both+Ba+and+B'+subunits+of+protein+phosphatase+2A,+but+E4orf4-induced+apoptosis+is+mediated+only+by+the+interaction+with+Ba.">Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba.</a> Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).</li><li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E4orf4,+a+novel+adenovirus+death+factor+that+induces+p53-independent+apoptosis+by+a+pathway+that+is+not+inhibited+by+zVAD-fmk.">E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk.</a> J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).</li><li>Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adenovirus+E4orf4+protein+induces+growth+arrest+and+mitotic+catastrophe+in+H1299+human+lung+carcinoma+cells.">The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells.</a> Oncogene. 28, 390-400 (2009).</li><li>Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -. C., Robert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+E4+open+reading+frame+4-induced+apoptosis+involves+dysregulation+of+Src+family+kinases.">Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases.</a> J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Knockdown di espressione del gene specifico è un approccio importante per l&#39;indagine del contributo di una proteina a percorsi normativi. Dal momento che knockdown costitutiva di espressione dei geni essenziali influisce negativamente la proliferazione delle cellule, il loro studio hanno bisogno di un introduzione transitoria di siRNA o applicazione di stabili sistemi smontabili condizionali. Generazione di linee cellulari stabili con la capacità di farmaco-indotta espressione di shRNAs qui descritte, fornisce un ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Alta glucosio DMEM </td><td> Gibco </td><td> 41965 </td><td></td></tr><tr><td> Tet sistema approvato FBS </td><td> Clontech </td><td> 631106 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> Pen Strep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% tripsina-EDTA </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr><tr><td> T-REX-293 cellule </td><td> Invitrogen </td><td> R710-07 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma </td><td> A1720 </td><td></td></tr><tr><td> blasticidina </td><td> InvitRogen </td><td> R210-01 </td><td></td></tr><tr><td> pSuperior.neo + plasmide GFP </td><td> OligoEngine </td><td> VEC-PBS-0007/0008 </td><td></td></tr><tr><td> jetPIE </td><td> Trasfezione PolyPlus </td><td> 101-40 </td><td></td></tr><tr><td> doxiciclina </td><td> Sigma </td><td> D9891 </td><td></td></tr><tr><td> paraformaldeide </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI) </td><td> Sigma </td><td> D9542 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoromount-G </td><td> SouthernBiotech </td><td> 0100-01 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of cell-lines for conditional knockdown of gene expression and measurement of the knockdown effects on e4orf4-induced cell death

Inattivazione funzionale di espressione genica in cellule di mammiferi è fondamentale per lo studio del contributo di una proteina di interesse per varie vie 1,2. Tuttavia, knockdown condizionale dell&#39;espressione genica è necessaria nei casi in cui knockdown costitutiva non è tollerata dalle cellule per un lungo periodo di tempo 3-5. Qui si descrive un protocollo per la preparazione di linee cellulari che permettono knockdown condizionale della subunità del fattore ACF rimodellamento della cromatina. Queste linee cellulari facilitare la determinazione del contributo di ACF ad induzione di morte cellulare per la proteina adenovirus E4orf4 6. Sequenze codificanti short hairpin RNA per le subunità ACF1 SNF2h e del fattore di ACF rimodellamento della cromatina sono stati clonati accanto a un doxiciclina promotore inducibile in un plasmide contenente un gene anche per il gene di resistenza alla neomicina. Neomicina resistenti cloni sono stati selezionati in presenza di G418 e isolata. Le linee cellulari risultanti sono state indottetrattamento doxiciclina, e una volta ACF1 o livelli di espressione SNF2h stati ridotti, le cellule sono state transfettate con un plasmide codificante E4orf4 o un vettore vuoto. Per confermare l&#39;effetto specifico dei costrutti shRNA, i livelli di proteina ACF1 o SNF2h sono stati ripristinati ai livelli WT da coinfezione con un plasmide che esprime ACF1 o SNF2h cui erano stati resi resistenti al shRNA con l&#39;introduzione di mutazioni silenti. La capacità di E4orf4 di indurre la morte cellulare nei vari campioni è stata determinata mediante un saggio DAPI, in cui è stata misurata la frequenza della comparsa di nuclei con morfologie apoptotici nella popolazione di cellule transfettate 7-9. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per la determinazione del contributo funzionale di varie proteine ​​di induzione della morte cellulare dai loro partner proteici nei casi in cui knockdown costitutiva può essere letale cellula.

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Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Contributo del fattore ACF rimodellamento della cromatina per E4orf4 morte cellulare indotta è stata misurata. Il protocollo include la selezione di cloni di cellule in cui il trattamento doxiciclina induce knockdown condizionale della subunità ACF ACF1 e SNF2h, e l&#39;uso del test per misurare DAPI E4orf4 morte cellulare indotta in linee cellulari inducibili.

Preparazione di linee cellulari per Knockdown condizionale dell&#39;espressione genica e valutazione degli effetti sulla Knockdown E4orf4 morte cellulare indotta

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

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10.9K Views.  Technion - Israel Institute of Technology. Contributo del fattore ACF rimodellamento della cromatina per E4orf4 morte cellulare indotta è stata misurata. Il protocollo include la selezione di cloni di cellule in cui il trattamento doxiciclina induce knockdown condizionale della subunità ACF ACF1 e SNF2h, e l'uso del test per misurare DAPI E4orf4 morte cellulare indotta in linee cellulari inducibili.

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The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparazione di colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino per elettroporazione

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

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Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizzando il sistema di elettroporazione Gene Pulser MXcell per trasfettare cellule primarie con alta efficienza

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

L&#39;utilizzo di un contatore automatico cella per semplificare gli studi sull&#39;espressione genica: Knockdown siRNA di IL-4 genica dipendente nelle celle Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Sezioni incluse in paraffina e surgelati di Drosophila Adulti Muscoli

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Ricostituzione in vitro di Active T. castaneum telomerasi

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo</emEritropoiesi> di cellule staminali emopoietiche

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi mediata Knockdown Gene e Transgenesi dalla microiniezione nel nematode Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible (Tet-on) shRNA or cDNA Expression

A major approach in the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of genes of interest in selected cell lines, with the aim to reveal one or several of the gene's function(s) using transient/stable overexpression or knockdown of the gene of interest. Unfortunately, for various cell biological investigations this approach is unsuitable when manipulations of gene expression result in cell growth/proliferation defects or unwanted cell differentiation. Therefore, researchers have adapted the Tetracycline repressor protein (TetR), taken from the E. coli tetracycline resistance operon1, to generate very efficient and tight regulatory systems to express cDNAs in mammalian cells2,3. In short, TetR has been modified to either (1) block initiation of transcription by binding to the Tet-operator (TO) in the promoter region upon addition of tetracycline (termed Tet-off system) or (2) bind to the TO in the absence of tetracycline (termed Tet-on system) (Figure 1). Given the inconvenience that the Tet-off system requires the continuous presence of tetracycline (which has a half-life of about 24 hr in tissue cell culture medium) the Tet-on system has been more extensively optimized, resulting in the development of very tight and efficient vector systems for cDNA expression as used here.
Shortly after establishment of RNA interference (RNAi) for gene knockdown in mammalian cells4, vectors expressing short-hairpin RNAs (shRNAs) were described that function very similar to siRNAs5-11. However, these shRNA-mediated knockdown approaches have the same limitation as conventional knockout strategies, since stable depletion is not feasible when gene targets are essential for cellular survival. To overcome this limitation, van de Wetering et al.12 modified the shRNA expression vector pSUPER5 by inserting a TO in the promoter region, which enabled them to generate stable cell lines with tetracycline-inducible depletion of their target genes of interest.
Here, we describe a method to efficiently generate stable human Tet-on cell lines that reliably drive either inducible overexpression or depletion of the gene of interest. Using this method, we have successfully generated Tet-on cell lines which significantly facilitated the analysis of the MST/hMOB/NDR cascade in centrosome13,14 and apoptosis signaling15,16. In this report, we describe our vectors of choice, in addition to describing the two consecutive manipulation steps that are necessary to efficiently generate human Tet-on cell lines (Figure 2). Moreover, besides outlining a protocol for the generation of human Tet-on cell lines, we will discuss critical aspects regarding the technical procedures and the characterization of Tet-on cells.

Generation of Stable Human Cell Lines with Tetracycline-inducible Tet-on shRNA or cDNA Expression

A rapid and simple way to generate human cell lines with inducible and reversible cDNA overexpression or shRNA-mediated knock-down of the gene of interest. This method enables researchers to reliably and highly reproducibly manipulate cell lines that are difficult to alter by transient transfection methods or conventional knockdown/knockout strategies.

Generazione di linee cellulari umane stabili con tetraciclina-inducibile (Tet-on) shRNA o espressione di cDNA

A major approach in  the field of mammalian cell biology is the manipulation of the expression of  genes of interest in selected cell lines, with the aim ...

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well when a small number of genes are targeted for knockdown, large scale feeding screens show variable knockdown efficiencies, which limits their utility. We have deconstructed previously published RNAi knockdown protocols and found that the primary source of the reduced knockdown can be attributed to the loss of dsRNA-encoding plasmids from the bacteria fed to the animals. Based on these observations, we have developed a dsRNA feeding protocol that greatly reduces or eliminates plasmid loss to achieve efficient, high throughput knockdown. We demonstrate that this protocol will produce robust, reproducible knock down of C. elegans genes in multiple tissue types, including neurons, and will permit efficient knockdown in large scale screens. This protocol uses a commercially available dsRNA feeding library and describes all steps needed to duplicate the library and perform dsRNA screens. The protocol does not require the use of any sophisticated equipment, and can therefore be performed by any C. elegans lab.

Large-scale Gene Knockdown in C. elegans Using dsRNA Feeding Libraries to Generate Robust Loss-of-function Phenotypes

While dsRNA feeding in C. elegans is a powerful tool to assess gene function, current protocols for large scale feeding screens result in variable knockdown efficiencies. We describe an improved protocol for performing large scale RNAi feeding screens that results in highly efficacious and reproducible knockdown of gene expression.

Su larga scala Knockdown Gene in<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizzo di librerie di alimentazione dsRNA per generare fenotipi Robusti Perdita di funzione

RNA interference by feeding worms bacteria expressing dsRNAs has been a useful tool to assess gene function in C. elegans. While this strategy works well ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

In Vivo trasfezione di siRNA e Gene Knockdown in Spinal Cord via rapida non invasiva lombare spinale iniezioni nei topi

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...