Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Buchholz e il Sigma-Aldrich RNAi-team per la discussione. Vorremmo ringraziare la Max Planck Society e il Bundesministerium für Bildung und Forschung grands Go-Bio [0315105] per il supporto. MISSION ® è un marchio registrato di Sigma-Aldrich Biotecnologie LP

1. Di alta qualità MISSIONE esiRNA librerie <ol><li> Per ogni gene di interesse della regione di destinazione più sensibili e specifici per la RNAi viene scelto utilizzando l&#39;algoritmo DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html) 4. Punteggi DEQOR il potenziale silenziamento di tutti possibili 21 nucleotidi siRNA a lungo in un obiettivo-mRNA in base a state-of-the-art design vincoli 4. Inoltre, ogni siRNA potenziale è analizzato per un possibile cross-reattività con altri geni eseguendo una ricerca BLAST contro il trascrittoma dell&#39;organismo studiato. Il programma prevede quindi una analisi della qualità complessiva e cross-silenziamento capacità del esiRNA potenziale (300-600 lunghezza bp). </li><li> La regione scelta del target-gene cDNA viene amplificato mediante PCR utilizzando primers gene-specifici affiancato da batteriofagi RNA-polimerasi-promotore sequenze. </li><li> Ogni prodotto di PCR utilizzata per la produzione MISSIONE esiRNA è verificata l&#39;identità mediante sequenziamento e l&#39;analisi di purezza, Pinza Labchip. </li><li> Long double-stranded RNA trascritto dal prodotto PCR da RNA polimerasi, seguita da una ricottura dei fili trascritte. </li><li> esiRNAs sono preparati da limitate digestione enzimatica della long double-stranded RNA utilizzando RNaseIII seguita dalla purificazione tramite cromatografia a scambio anionico utilizzando Q-sefarosio colonne di rotazione. </li><li> esiRNAs sono precipitati e risospese in tampone TE. Il rendimento si misura con assorbimento UV-misure e la concentrazione è regolata sciogliendo in un volume adeguato di tampone TE. La qualità complessiva del prodotto finale è controllato da analisi Pinza Labchip. </li></ol> 2. La scelta di una linea cellulare e ottimizzare la trasfezione per lo screening <ol><li> Quantità titolare di esiRNA (uso Eg5 come positivi e Renilla-luciferasi come controllo negativo) e quantità crescenti di reagenti di trasfezione in 384 pozzetti, aggiungere le cellule e incubare per 48 ore. Eg5 è una proteina motore chinesina necessari per l&#39;assemblaggio del fuso bipolare e l&#39;esaurimento porta ad un arresto mitotico. Ripetere questa procedura per i reagenti di trasfezione diverse linee cellulari. Qui, usiamo le cellule HeLa in coltura seguendo le procedure standard e oligofectamine (Invitrogen) come reagente di trasfezione. </li><li> Per la scelta delle condizioni ottimali di transfezione contare le cellule transfettate con Eg5 esiRNAs che mostrano un arresto mitotico (forma rotonda) e il numero totale di cellule trasfettate con Renilla-luciferasi (RLUC) esiRNA al microscopio ottico. Scegli la condizione con il minor tossicità per RLUC e il fenotipo più pronunciata per Eg5. Un metodo alternativo per l&#39;ottimizzazione delle condizioni di trasfezione stabile coinvolge una linea di cellule che esprimono EGFP (o un altro gene reporter adatto) sotto il controllo di un promotore costitutivo attivo. Dopo la trasfezione di un esiRNA contro EGFP (o un altro gene reporter) e RLUC (o altro idoneo esiRNA controllo negativo) misura knock-down efficacia e la tossicità ad esempio con l&#39;ordinamento delle cellule assistita fluorescenza (FACS). Assicurarsi che il esiRNA utilizzato per EGFP è perfettamente complementare al target-mRNA. </li></ol> 3. Impostazione della schermata principale 5,6 <ol><li> Ottimizzare la precisione di pipettaggio per tutti i componenti utilizzati in una stazione di pipettamento automatizzati (ad esempio l&#39;Acquario, Tecan e WellMate, Matrix). Poiché i parametri pipettaggio cambiano a seconda del tipo di tipo di soluzione, il volume e la piastra di questa ottimizzazione deve essere ripetuta per ogni fase separatamente. Se possibile, la stazione di pipettamento deve essere posto sotto una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni. Tutti i componenti utilizzati devono essere disinfettati prima di utilizzare sia in autoclave, se applicabile a spruzzo o con il 75% di etanolo. Ottimizzare i protocolli di lavaggio in modo che la contaminazione incrociata da pozzetto a pozzetto è esclusa. Dettagli per l&#39;ottimizzazione del pipettaggio automatizzato non si può dare per vincoli di spazio e dipendono in gran parte dalla stazione di pipettamento utilizzati. Per maggiori informazioni fare riferimento al protocollo produce. </li><li> Trasfezione delle cellule in formato da 384 pozzetti utilizzando le condizioni ottimizzate dall&#39;alto con esiRNAs per Eg5 e RLUC. Utilizzare uno schema alternato per Eg5 e RLUC esiRNA copre l&#39;intera piastra. </li><li> Dopo incubazione per 48 ore fissare le cellule con etanolo freddo al 100%, reidratare in PBS per 15 minuti, macchia per 25 minuti in PBS contenente 1 mg / ml DAPI e 100 mg / ml RNasi A (Qiagen). Infine lavare con PBS e conservare a 4 ° C. </li><li> Misurare l&#39;intensità di fluorescenza DAPI-ad esempio con microscopia su un sistema Olympus ScanR. Genera un istogramma tracciando intensità DAPI contro numero di cellulare e valutare la distribuzione del ciclo cellulare calcolando la percentuale di cellule con il DNA contenuto 2N per G1-fase; &lt;2N&gt; 4N per la fase S; 4N per G2/M-phase e &gt; 4N per aneuploidie / poliploidia. </li><li> Valutare l&#39;omogeneità dei risultati sopra la piastra. Ulteriore ottimizzazione è necessario se i risultati differiscono significativamente da escludere effe posizionects. Un problema comune quando si usano più pozzetti evaporazione è maggiore nei pozzi bordo durante il tempo di incubazione. Questo porta a diverse condizioni sperimentali in pozzi diversi, che si traduce spesso alla piastra posizioni effetti specifici. Per questo motivo, si consiglia di lasciare tutti i pozzi vuoti a bordo di uno schermo. Per minimizzare ulteriormente l&#39;evaporazione assicurarsi che le incubatrici sono mantenuti a umidità elevata. Abbiamo anche abitualmente utilizzano barriere evaporazione come nastro di tenuta Corning traspirante che bloccano l&#39;evaporazione. Anche altre risorse per gli effetti di posizione devono essere presi in considerazione, ad esempio, variazioni tecniche del sistema di lettura (microscopio, lettore di piastre, ecc) o variazioni di manipolazione dei liquidi (gradienti, disomogeneità delle soluzioni, ecc.) </li><li> Le differenze statistiche tra controlli positivi e negativi di fornire una misura della significatività del test impiegato. Una grande differenza tra controllo negativo (o rumore di fondo; mock-controllo) e il campione deve essere stabilito prima di iniziare la proiezione vera e propria. Una buona misura per la significatività statistica è la Z-fattore. Lo Z-fattore è calcolato secondo la formula: Z = 1 - (3 SD [campione] + 3 SD [finta]) * (| Av [campione] - Av [finta] |) -1, con SD: deviazione standard; Av: media. Un fattore di Z-1&gt; Z&gt; 0,5 indica una separazione statisticamente significativo dei controlli negativi (e rumore) dai controlli positivi 7. </li></ol> 4. Schermo primario <ol><li> Preparare 384 e piastre di coltura di tessuto per la transfezione di esiRNAs utilizzando le condizioni ottimizzate dall&#39;alto. Qui, usiamo esiRNA 15ng per ben sciolto in tampone 5μl TE. Almeno otto posizioni di controllo per piastra deve essere caricata con opportuni controlli positivi e negativi per il processo biologico studiato (qui: Eg5 e RLUC). Per evitare effetti la posizione del bordo pozzi vengono caricati con tampone TE 5μl solo. </li><li> Aggiungi 5μl OptiMEM (Invitrogen) contenente Oligofectamine 0.2μl per bene, mescolare e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungi sospensione cellulare sulla miscela di trasfezione (qui: 40μl di una sospensione di cellule HeLa a 25 cellule / concentrazione microlitri, pari a 1000 cellule per pozzetto) e incubare per 72 ore. </li><li> Misura del DNA contenuto in un microscopio automatico (Olympus ScanR, vedi sopra). Valutare con Z-score statistiche per la selezione hit: Z-score vengono calcolati per tutti esiRNAs esempio utilizzando il segnale per il controllo negativo come riferimento. Nota, la Z-score non è la stessa della Z-fattore. Z-score fornisce una misura statistica per la significatività dei valori del campione rispetto ad un (finto) di controllo. Si è calcolato secondo la formula: Z = (valore [Sample] - media [finta]) * deviazione standard [finta] -1. Per la selezione ha colpito una soglia deve essere applicato. Tipicamente, un criterio di significato come: 2 &lt;Z &lt;-2 viene utilizzato, ma a seconda della qualità del set di dati, il processo biologico studiato o semplicemente la portata dello schermo, soglie differenti possono essere applicabili. Accanto alla abbastanza facile Z-score statistiche anche più elaborati metodi di valutazione matematico può essere utilizzato (dentro una prima volta nel vasto campo della valutazione statistica dei dati di screening può essere trovato a Malo et al. 8). </li></ol> 5. Schermo secondario e validazione colpito <ol><li> Uno schermo secondario segue lo schermo principale per eliminare i falsi positivi a causa di errori sperimentali o off-target effetti. Per i colpi selezionato la stessa procedura utilizzata nella schermata principale dovrebbe essere ripetuto per un maggior numero di repliche (3-5) per consentire una migliore valutazione statistica. </li><li> Per colpisce verificato un esiRNA secondaria non sovrapposti (o un altro non sovrapposti innescare silenziamento) rispetto agli obiettivi individuati nelle schermate iniziali dovrebbero essere usati. La stessa analisi e lettura deve essere applicato come per lo schermo principale. </li><li> In definitiva i geni selezionati possono essere convalidati da cross-specie di soccorso RNAi 9. Quindi un cromosoma batterico artificiale (BAC) che codifica per esempio il ortholog topo del gene è trasfettate stabilmente nelle cellule. BAC-costruisce conservare un gene nel suo contesto genomica e consentire una espressione quasi-fisiologica. RNAi contro il gene endogeno umano lascerà l&#39;espressione del transgene inalterato topo che salva il RNAi-fenotipo. RNAi-rescue fornisce il gold-standard per la verifica dei fenotipi RNAi ad oggi disponibili. </li><li> Infine, i candidati validati sono studiate in modo più dettagliato alla fine di ricavare comprensione meccanicistica. In molti casi RNAi può essere utilizzato in questi esperimenti, ad esempio in secondaria, i test più elaborati. </li></ol>

<ol>
	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li><li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi.">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li><li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens.">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li><li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEQOR:+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs.">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li><li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+of+mammalian+cell+division.">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells.">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells.">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies.">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li></ol>

Gli autori dichiarano rapporti finanziari con gli enti commerciali che potrebbe avere un interesse per il lavoro presentato.

RNA interference è diventata una tecnica standard per studiare la perdita di funzione fenotipi. Su larga scala collezioni di RNAi-mediatori sono disponibili da diversi fornitori e fornisce un metodo facile, conveniente e rapido per silenziamento genico. Ciò ha aperto la porta per lo screening sistematico per attori chiave in molti processi biologici che permette un genoma scala punto di vista su una vasta gamma di diverse specie e tipi di cellule. Alto tasso di falsi positivi e falsi negativi sono una sfida comune a schermi RNAi. Per risolvere questo problema, notevoli sforzi sono stati investiti per migliorare l&#39;efficacia e, in particolare, la specificità del silenziamento trigger. Una scoperta importante fu che un pool di diversi siRNA targeting la trascrizione stessa migliora notevolmente la specificità del bersaglio. Perché una piscina molto complessa di diversi siRNA è prodotto dalla endoribonuclease, esiRNAs sono alti trigger specificità del bersaglio, riducendo il tasso di falsi positivi nelle schermate RNAi. esiRNAs hanno anche dimostrato di raggiungere atterramenti efficiente, riducendo anche il tasso di falsi negativi. Poiché gli schermi RNAi sono tecnicamente impegnativi, che probabilmente rimarrà difficile da eseguire di routine per qualche tempo. Tuttavia, come reagenti e strumenti di laboratori di ottenere una migliore e più condividere la loro esperienza, l&#39;uso di schermi RNAi in biologia moderna sono ritenuti aumentare in futuro.

<table border="1">
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
<td>Comments</td>
</tr>	
<tr>
<td>MISSION esiRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For additional information contact: rnai@sial.com</td>
</tr>
<tr>
<td>Wellmate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoScientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Breathable sealing tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OptiMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=E7023|SIAL&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Ethanol</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E7023</td>
<td>200 proof (absolute), for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P5493|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Phosphate buffered saline</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P5493</td>
<td>BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=D8417|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&#x2032;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D8417</td>
<td>Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC)</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=R6513|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Ribonuclease A from bovine pancreas</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R6513</td>
<td>For molecular biology, &ge;70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T9285|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Tris-EDTA buffer solution</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T9285
</td>
<td>100 x, for molecular biology</td>
</tr>
</table>

mission esirna for rnai screening in mammalian cells

Interferenza dell&#39;RNA (RNAi) è un meccanismo cellulare di base per il controllo dell&#39;espressione genica. RNAi è indotta da brevi double-stranded RNA conosciuta anche come piccoli RNA interferenti (siRNA). Il corto double-stranded RNA provengono da più precursori a doppio filamento per l&#39;attività di Dicer, una proteina della famiglia delle endonucleasi RNasi III. I frammenti risultanti sono i componenti del silenziamento dell&#39;RNA indotta complesso (RISC), orientandola verso l&#39;mRNA bersaglio affini. RISC si unirà l&#39;mRNA bersaglio riducendo così l&#39;espressione della proteina codificata 1,2,3. RNAi è diventato un metodo potente ed ampiamente utilizzato sperimentale per la perdita degli studi di funzione del gene in cellule di mammifero utilizzando piccoli RNA interferenti. Attualmente due metodi principali sono disponibili per la produzione di piccoli RNA interferenti. Un metodo comporta sintesi chimica, mentre un metodo alternativo impiega scissione endonucleolytic di target specifici long double-stranded RNA da RNase III in vitro. In tal modo, un pool eterogeneo di siRNA oligonucleotidi come viene prodotto, che è anche conosciuto come endoribonuclease preparata siRNA o esiRNA. Un confronto di efficacia di siRNA chimicamente derivati ​​e esiRNAs mostra che entrambi i trigger sono potenti in target-silenziamento genico. Differenze possono però essere visti quando si confrontano specificità. Molti siRNA solo per sintesi chimica di produrre importanti effetti off-target, mentre la miscela complessa inerente esiRNAs porta ad una più specifica knockdown 10. In questo studio, presentiamo il progetto di librerie MISSIONE genoma scala esiRNA e il suo utilizzo per lo screening RNAi esemplificato da un DNA contenuto dello schermo per l&#39;identificazione di geni coinvolti nella progressione del ciclo cellulare. Mostriamo come ottimizzare il protocollo di trasfezione e il test per lo screening in un throughput elevato. Abbiamo anche dimostrare come grandi insiemi di dati possono essere valutati statisticamente e presenti metodi per convalidare colpi primaria. Infine, diamo potenziali punti di partenza per ulteriori caratterizzazioni funzionali di visite convalidato.

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MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Qui si usa una libreria umano esiRNA in un high-throughput schermo per geni coinvolti nella divisione cellulare. Dimostriamo come impostare e condurre un esiRNA schermi, e come analizzare e convalidare i risultati.

EsiRNA MISSIONE per lo screening RNAi in cellule di mammifero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

mission-esirna-for-rnai-screening-in-mammalian-cells

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JoVE Journal

Biology

16.2K Views.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. Qui si usa una libreria umano esiRNA in un high-throughput schermo per geni coinvolti nella divisione cellulare. Dimostriamo come impostare e condurre un esiRNA schermi, e come analizzare e convalidare i risultati.

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Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocollo per saggi RNAi in zanzare adulte (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

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Biologia

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing e Trapianto cellule di mammifero

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

Consegna batterica di RNAi per DJ: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex MISSIONE pool di screening Biblioteca shRNA in cellule di mammifero

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi di screening per identificare fenotipi postembrionale in C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

siRNA screening per identificare ubiquitina e ubiquitina-come regolatori del sistema di percorsi biologici in cellule di mammifero coltivate

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

La misurazione dei livelli Heme sintesi in cellule di mammifero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.