Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Eye Institute R01EY017925 e R21EY020985 e finanziamento da parte delle Fondazioni Dana &amp; Whitehall a PK Ringraziamo Matteo Petrella per l&#39;assistenza alle procedure chirurgiche, Grazia Dion a rintracciare i dendriti illustrato nella figura 5a e Pratik Chhatbar per commenti sul manoscritto.

1. Preparazione chirurgica <ol><li> Indurre l&#39;anestesia e monitorare la frequenza cardiaca, terminare CO marea 2, EEG, e la temperatura. Tutte le procedure sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso della Medical University of South Carolina e si basano su quelle che abbiamo precedentemente pubblicato con il 9,15. </li><li> Esporre la superficie dorsale del cranio tagliando la pelle con una lama da bisturi. Staccare il tessuto connettivo sovrastanti l&#39;osso con una curette Brudon. Pulire l&#39;osso con applicatori di cotone con punta e garza di cotone. Applicare la cera ossea (se necessario) al cranio, per arrestare l&#39;emorragia occasionale attraverso piccole vene emissario. </li><li> Collegare un titanio o acciaio piastra di testa in acciaio al cranio (sopra la regione di interesse in cui la craniotomia verrà eseguita) utilizzando cemento dentale mescolato con vernice nera (vedi Materiali). Una apertura rettangolare al centro della piastra di testa fornisce l&#39;accesso per la craniotomia e imaging ottico. Allegare una camera metallica sulla parte superiore della piastra di testa. Questa camera servirà come un serbatoio di fluido per l&#39;imaging con la lente obiettivo immersione in acqua. </li><li> Fissare la piastra di testa per una fase xy con perni in metallo. </li><li> Assottigliare una vasta area dell&#39;osso entro l&#39;apertura rettangolare della piastra di testa utilizzando un trapano dentistico. L&#39;area deve essere diluito deve estendersi ben oltre i confini della craniotomia previsto. Il cranio di spessore non roditori mammiferi deve essere diluito se immagini ad alta risoluzione sono da acquisire dalla neocorteccia perché al sito craniotomia, lo spessore dell&#39;osso detterà lo spessore del agarosio tra la superficie e coverglass neocorticale (vedi sotto) . </li><li> Praticare un 2 x 2 mm quadrati contorno nell&#39;osso per la craniotomia. Sciacquare la camera periodicamente con fresco liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) per rimuovere frammenti ossei e ridurre al minimo la dissipazione del calore verso la corteccia sottostante. Applicare la cera ossea, se necessario, per fermare le emorragie occasionali. </li><li> Lift il lembo osseo con una pinza # 3. </li><li> Rimuovere tutti, ma il livello più basso di durata con una multa pinza (# 5CO) e forbici a molla Vännäs. La dura madre non roditori mammiferi è spessa e opaca, ma può essere rimossa in strati distinti. Il sanguinamento è raro, ma può essere fermato con Gelfoam e gli eventuali residui di sangue dovrebbe essere delicatamente rimosso dallo strato residuo di durata uso di pinze e risciacquo con ACSF. Lo strato finale di dura è trasparente e vasi piali deve essere chiaramente visibile attraverso di essa. Lasciare questo strato finale di dura intatto durante l&#39;esposizione del segnale intrinseco aumenterà il tasso di successo di caricamento di massa di indicatori di calcio fluorescenti per la successiva a due fotoni di imaging fase dell&#39;esperimento (vedi Discussione). </li><li> Applicare una goccia di caldo agarosio al 2% (sciolto in ACSF) e collocare immediatamente il coprioggetti sopra la craniotomia. Controllare la craniotomia per garantire che le pulsazioni respiratorie e cardiovascolari sono minime utilizzando un microscopio da dissezione chirurgica o gli oculari di duefotone microscopio in campo chiaro modalità. </li></ol> 2. Intrinseca del segnale ottico Imaging <ol><li> Aggiungere gel-schiuma imbevuta con ACSF intorno all&#39;esterno del coprioggetto per evitare l&#39;agarosio si secchi durante l&#39;imaging segnale intrinseco. </li><li> Fissare la fotocamera intrinseca un elaboratore di immagini CCD allo standard C-mount porta sulla parte superiore del microscopio a due fotoni (Figura 1). Posizionare la sorgente di luce illuminante sul tavolo aria vicino alla fase xy (Figura 1A). Posizionare e fissare le guide di luce oltre la craniotomia e piastra di testa / camera (Figura 1B). Ritrarre il dicroico primario e lo specchio di sotto del C-mount porta in modo che la luce riflessa rossa necessaria per segnali intrinseci passerà direttamente dalla craniotomia alla telecamera CCD (Figura 1C-D). Utilizzando l&#39;obiettivo 4x aria (0,13 NA, 17 mm WD), un 2 x 2 mm Campo di vista è disponibile per l&#39;imaging del segnale intrinseco. </li><li> Inserire un filtro di calore nel light percorso per impedire la corteccia di riscaldamento. Utilizzare un filtro che lascia passare la luce verde (546 nm centro λ) e registrare l&#39;immagine digitale di riferimento dei vasi sanguigni superficiali corticali. </li><li> Spostare lo stato attivo z a 500 micron sotto la superficie corticale. Utilizzare un filtro rosso (630 nm centro λ) per illuminare la corteccia per la misurazione dei segnali intrinseci. Posizionare le guide di luce in modo tale che la superficie corticale è uniformemente illuminata. Proteggere la craniotomia della luce prodotta dal display stimolo visivo. Presentare una sequenza di stimoli visivi e registrare immagini dati di riflettanza. Per generare una mappa di orientamento entro 10 min, raccogliere dati corrispondenti a quattro ripetizioni di una sequenza di 8 stimoli (4 orientamenti e due direzioni per ciascun orientamento). </li><li> Analizzare i dati del segnale intrinseco di generare una falsa mappa di orientamento a colori. Selezionare le regioni potenziale bersaglio per due fotoni etichettatura dei neuroni, ad esempio, l&#39;orientamento singolarità pinwheel - punti della mappa in cuitutte le orientazioni preferenziali convergono (Figura 2A). Sovrapporre la mappa orientamento e l&#39;immagine della vascolarizzazione superficie corticale (Figura 2B-C). Utilizzare il layout di domini funzionali e la posizione di navi di superficie di grandi dimensioni per selezionare una destinazione, evitando luoghi in cui i grandi vasi sanguigni e arteriole 15. </li></ol> 3. Caricamento di massa degli indicatori di calcio fluorescenti <ol><li> Preparare una soluzione di 20% Pluronic / DMSO aggiungendo 1 g di Pluronic in DMSO 5 microlitri. Riscaldare la miscela a 60 ° C per 10 minuti per sciogliere completamente il Pluronic. Permettere alla miscela di raffreddare a temperatura ambiente. Aggiungere 4 microlitri della Pluronic / DMSO miscela una fiala 50 mg dell&#39;indicatore calcio fluorescente verde Oregon 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). Poi aggiungere 1 ml di un colorante rosso (Alexa 594, 2 mM soluzione stock) e 35 pl di soluzione di pipetta (vedi Materiali) per una concentrazione finale di 1 mM OGB-1 AM. Sonicare la soluzione per ½ ora inun bagno di acqua fredda, quindi si centrifuga con 0,45 micron filtro per rimuovere le impurità. </li><li> Tirare una pipetta lunga cono con un diametro esterno di punta 2,0-2,5 micron. Caricare 5 microlitri della miscela colorante nella pipetta. </li><li> Rimuovere lo strato finale di dura per facilitare l&#39;inserimento pipetta e ottenere la più alta qualità a due fotoni immagini. </li><li> Determinare l&#39;esatta posizione sulla superficie corticale che la pipetta deve essere posizionato in modo da raggiungere l&#39;obiettivo in strato corticale 2/3. Il nostro obiettivo predeterminato corticale è una singolarità girandola nella mappa di orientamento (Figura 2). La pipetta deve essere guidato nella corteccia di un angolo di 30 ° per passare tra le pareti della camera e l&#39;obiettivo. Così, per etichettare la regione bersaglio 200 micron sotto la superficie corticale, la posizione di ingresso pipetta sulla superficie corticale sarà di circa 350 micron laterali alla posizione di destinazione (Figura 3 AB). </li><li> Spostare la fase di xy (su cui l&#39;animale e il pmicromanipolatore ipette sono posti) al centro della superficie corticale posizione di ingresso nell&#39;ambito dell&#39;obiettivo (Figura 3C). Utilizzare un obiettivo 20x o 40x con una distanza di lavoro (WD) di almeno 3 mm (vedi Materiali) per assicurare che la pipetta facilmente inserire la corteccia senza toccare l&#39;obiettivo o l&#39;osso lungo la parete della craniotomia. Una volta che la posizione di ingresso è centrata sotto l&#39;obiettivo, sollevare la posizione Z dell&#39;obiettivo da 2 mm (Figura 3D). Con l&#39;epi-fluorescenza verde chiaro acceso per visualizzare il rosso Alexa colorante nella pipetta, utilizzare l&#39;asse diagonale del micromanipolatore per spostare la pipetta fino a quando la punta è centrato (e concentrata) a titolo dell&#39;obiettivo direttamente sopra l&#39;ingresso della superficie corticale ( Figura 3E). </li><li> Abbassare la pipetta verticalmente (lungo l&#39;asse Z) fino alla pipetta raggiunge la superficie corticale (Figura 3F), mentre continua la visualizzazione della punta della pipetta attraverso l&#39;OCUlars del microscopio. Utilizzo in campo chiaro di illuminazione, le corticali vasi sanguigni superficiali e rimanenti membrane meningee (pia e aracnoide) sono facilmente visibili come la pipetta si avvicina alla superficie corticale. Se la pipetta non raggiunge la posizione desiderata, sollevare la pipetta e ricalibrare il targeting in base ai punti di riferimento vascolari sulla superficie corticale. </li><li> Rimuovere l&#39;obiettivo, stoppino eccesso di liquido cerebrospinale dalla craniotomia e asciugare l&#39;osso adiacente, con panno-free lance di assorbimento. Applicare una goccia di calda 3% agarosio (disciolto in ACSF) per stabilizzare la corteccia che è visibile attraverso la craniotomia (figura 3G). Nei non roditori, 3% agarosio è necessario smorzare pulsazioni per l&#39;assorbimento efficace di coloranti fluorescenti da neuroni. Per l&#39;imaging ottico di segnale intrinseco solo il 2% di agarosio è necessaria in quanto la combinazione di agarosio al 2% e il coprioggetto offre la stabilità necessaria. Qui, non coverglass viene utilizzato per il colorante di caricamento passo così agarosio al 3% ènecessario. Dopo l&#39;agarosio si è solidificato, inserire un obiettivo 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) e ri-riempire la camera con ACSF. </li><li> Passare dal campo chiaro a due fotoni visualizzazione e individuare la punta della pipetta. Utilizzando l&#39;asse diagonale del micromanipolatore, spostare la pipetta finché la punta raggiunge la profondità desiderata nella corteccia (figura 3H). Occasionali sbuffi di pressione di espulsione della miscela colorante (una psi pochi, ogni impulso 0,1 sec), aiuta a prevenire la punta della pipetta da intasamento. Poiché OGB-1:00 diventa visibile solo entrando cellule, il colorante rosso Alexa è critico per la visualizzazione della punta della pipetta all&#39;interno della corteccia. </li><li> Prima di caricare i neuroni in strato corticale 2/3 con l&#39;intera dose di colorante, rifocalizzare l&#39;obiettivo sulla superficie corticale per confermare la profondità della punta della pipetta e garantire che la punta si trova nella posizione di destinazione sulla base del layout di vasi sanguigni superficiali. Se la pipetta è nel livello 2/3, piccoli sbuffi di miscela colorante dovrebbe illuminare l&#39;spazio extracellulare e rivelano un gruppo denso di corpi cellulari circolari come ombre scure. </li><li> Per caricare corpi cellulari neuronali in una sfera di corteccia 300-600 micron di diametro, iniettare la miscela colorante nello spazio extracellulare usando 30-90 impulsi, ogni impulso 1,0 sec, 2-10 psi. Gli impulsi di pressione non dovrebbe essere così forte che il tessuto si muove. Dopo l&#39;iniezione è stata completata, attendere pochi min, quindi rimuovere la pipetta e obiettivo. Attendere 1 ora per consentire il OGB-1 AM per essere prese pienamente-up dai neuroni. </li><li> Rimuovere l&#39;agarosio utilizzata per il carico colorante e lavare la camera di registrazione. Mettere una piccola goccia di 2-3% agarosio in superficie e rapidamente mettere un coprioggetti sopra la craniotomia. Poiché i coloranti fluorescenti sono sensibili alla luce, evitare di sovraesporre la corteccia di campo chiaro o epi-fluorescente. Inserire un elevato NA (1.0) 20x obiettivo nel supporto obiettivo e ricentrare la regione corticale etichettata nell&#39;ambito dell&#39;obiettivo utilizzando la fase di xy. Proteggere la craniotomia da exfonti di luce traneous, ad esempio, la visualizzazione stimolo visivo, utilizzando strati multipli di materiale blackout. </li></ol> 4. Single-cell Elettroporazione di coloranti fluorescenti <ol><li> Per studiare la morfologia dendritica, preparare una soluzione di 100 mM Alexa Fluor 594 (diluizione 1:20 in ACSF di 2 mM Alexa Fluor 594 stock). Per l&#39;imaging funzionale di dendriti un sale OGB può essere utilizzato 16,17. </li><li> Tirare una pipetta lunga cono con dimensioni ugello di 1 um e caricare 5 microlitri di colorante nella pipetta. Tutte le altre fasi di mira un dominio funzionale è identico al metodo di caricamento bulk (Figure 1-3). Per posizionare la punta della pipetta adiacente ad una membrana neuronale corpo cellulare, monitorare l&#39;aumento dell&#39;impedenza dell&#39;elettrodo ed applicare pressione sbuffi di colorante ad illuminare lo spazio extracellulare e vedere corpi cellulari come ombre durante due fotoni imaging. </li><li> Quando la punta della pipetta è adiacente ad una membrana neuronale corpo cellulare, utilizzare l&#39;800A Axoporator applicareImpulsi 1-3 (-8 a -10 V, 10 ms di impulso). Il riempimento immediato del neurone con colorante è facilmente visualizzato con microscopia a due fotoni. Rimuovere la pipetta e raccogliere immagini ad alta risoluzione dei dendriti e degli assoni in vivo. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vi presentiamo un metodo per indirizzare l&#39;etichettatura dei corpi cellulari neuronali (o dendriti e degli assoni) in pre-determinati funzionali micro-domini della neocorteccia. Fusione di imaging intrinseca segnale ottico con due fotoni microscopia offre la possibilità di determinare quali sinapsi e cellule contribuiscono al micro-dominio di ogni mappa funzionale, sia correlato selettività neuronali con la posizione del neurone in una mappa funzionale, e il circuito neuronale componenti che cambiano con l&#39;esp...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1. Supporto Life / esperimento prep </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Webster Vet </td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td> Vaporizzatore isoflurano </td><td> Midmark </td><td> VIP 3000 </td><td></td></tr><tr><td> Commenti termocoperta regolamentato </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 50-7079F </td><td></td></tr><tr><td> Monitor ECG </td><td> Digicare biomedica </td><td> LifeWindow Lite </td><td></td></tr><tr><td> Amplificatore EEG </td><td> AM Sistemi </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor EEG </td&gt; <td> Hewlett Packard </td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td> End tidal CO 2 monitor </td><td> Respironics </td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td> Ottimizzare la ventilazione </td></tr><tr><td> Bave trapano in metallo duro per ossa foratura </td><td> Henry Schein </td><td> bene (0,5 punta mm) e grosso (1,25 punta mm) </td><td></td></tr><tr><td> Cemento per piastra di testa / camera </td><td> Dentsply </td><td> 675571, 675572 </td><td></td></tr><tr><td> Nero Polvere Tempera Vernice </td><td> Sargent Art Inc. </td><td> 22-7185 </td><td> Aggiungi al cemento per migliorare la luce schermatura e ridurre i riflessi </td></tr><tr><td> Agarosio - Tipo III-A </td><td> Sigma </td><td> A9793 </td><td> Per ridurre al minimo le pulsazioni durante il segnale intrinseco e due fotoni di imaging </td></tr><tr><td> Vetrino: 5 o 8 mm di diametro, 0,17 mm di spessore </td><td> Mondo Precisionstruments </td><td> 502040, 502041 </td><td> Per ridurre al minimo le pulsazioni durante l&#39;esposizione, il coprioggetto può essere tagliato in base alle esigenze </td></tr><tr><td> Brudon curette </td><td> George Tiemann </td><td> 105-715-0, 105-715-3 </td><td> Pulizia della superficie del cranio </td></tr><tr><td> Bone cera </td><td> Ethicon </td><td> W31G </td><td> Rapidamente fermare l&#39;emorragia </td></tr><tr><td> Punta in cotone Applicatore </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 72308-05 </td><td> Osso superficie pulita ed asciutta </td></tr><tr><td> Dumont # 5CO Pinze </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 11295-20 </td><td> Prendete singoli strati di durata o di pia </td></tr><tr><td> Vannas Primavera Forbici </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 15000-03 </td><td> Cut dura </td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pfizer </td><td> 09-0396-05 </td><td> Per arrestare l&#39;emorragia sulla durata </td></tr><tr><td> Assorbimento lance</td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 18105-01 </td><td> Assorbimento ultra-veloce e privo di lanugine di CSF </td></tr><tr><td> Blackout materiale </td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td> Scudo craniotomia </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2. Tingere preparazione / iniezione </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon verde 488-Bapta 01:00 </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td> Indicatore di calcio </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro centrifugo (dimensione dei pori 0,45 um) </td><td> Millipore </td><td> UFC30HV00 </td><td> Per rimuovere le impurità prima dell&#39;iniezione </td></tr><tr><td> Pipetta di vetro estrattore </td><td> Sutter Instruments </td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td> Vetro borosilicato filamented capillare (1,5 mm di diametro esterno) </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 1B150F-4 </td><td> Espulsione pipetta Dye </td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956 003 </td><td> Per il caricamento colorante in pipetta </td></tr><tr><td> Micromanipolatore </td><td> Sutter Instruments </td><td> MP-285 </td><td> Per posizionare pipetta </td></tr><tr><td> Pressione a impulsi </td><td> Parker Hannifin </td><td> PicoSpritzer III </td><td> Per pressione di iniezione del colorante </td></tr><tr><td> Single-cell elettroporatore </td><td> Molecular Devices </td><td> Axoporator 800A </td><td> Per elettroporazione del colorante </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3. Intrinseca imaging </td></tr><tr><td> Obiettivo 4x (0,13 NA, 17 mm WD) </td><td> Olimpo </td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td> Intrinseca hardware / software </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> Imager 3001 / VDAQ </td><td> VDAQ software viene utilizzato per l&#39;imaging episodica </td></tr><tr><td> CCD </td><td> Adimec </td><td> Adimec-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Luce sorgente di alimentazione </td><td> KEPCO </td><td> ATE 15-15M </td><td></td></tr><tr><td> Sorgente di luce </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> HAL 100 </td><td> L&#39;intensità della luce sulla superficie corticale di 3-5 mW </td></tr><tr><td> Filtro verde (per l&#39;immagine vascolare) </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> λ = 546 nm (banda passante 30 nm) </td><td> Per un&#39;immagine di riferimento di vascolarizzazione superficiale </td></tr><tr><td> Filtro rosso (per segnale intrinseco) </td><td> Ottica Imaging Inc. </td><td> λ = 630 nm (banda passante 30 nm) </td><td> Per raccogliere segnali intrinseci </td></tr><tr><td> Calore filtro </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4. Due-fotone rig / immagini </td></tr><tr><td> Microscopio a due fotoni e software </td><td> Prairie Technologies </td><td></td><td> Vedi Shen et al. 2012 per percorso della luce, filtri e potenza del laser </td></tr><tr><td> Ti: zaffiro laser </td><td> Spectra-Physics </td><td> Mai Tai XF </td><td></td></tr><tr><td> 20x (0,5 NA; 3,5 millimetri WD) </td><td> Olimpo </td><td> UMPLFLN20X </td><td> 0,5 obiettivo NA viene utilizzata solo per l&#39;allineamento pipetta sul craniotomia (non per l&#39;imaging due fotoni) </td></tr><tr><td> 20x (1,0 NA; 2,0 millimetri WD) </td><td> Olimpo </td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40x (0,8 NA; 3,3 millimetri WD) </td><td> Olimpo </td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td> Air tavolo </td><td> Newport </td><td> ST-200 </td><td> Isola preparazione da vibrazioni esterne </td></tr><tr><td> xy fase </td><td> Mike Machine Co. (Attleboro, MA) </td><td></td><td> Soggetto sperimentale e micromanipolatore Sutter posto sul palco xy </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Ricette </td></tr><tr><td> Artificiale liquido cerebro-spinale </td><td> NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl 2 (1,0 mM), CaCl 2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4 </td></tr><tr><td> Pipettare Soluzione 14 </td><td> NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4 </td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted labeling of neurons in a specific functional micro-domain of the neocortex by combining intrinsic signal and two-photon imaging

Nella corteccia visiva primaria di non-mammiferi roditori, i neuroni sono raggruppati in base alla loro preferenza per le funzioni di stimolo come l&#39;orientamento 1-4, direzione 5-7, dominanza oculare 8,9 e disparità binoculare 9. Selettività Orientamento è la caratteristica più studiati ed una mappa continua con un quasi-periodico disposizione per l&#39;orientamento preferito è presente su tutta la corteccia visiva primaria 10,11. L&#39;integrazione dei contributi sinaptiche, cellulare e di rete che portano a risposte di stimolo selettivo in queste mappe funzionali richiede l&#39;ibridazione di tecniche di imaging che si estendono su sub-micron di millimetro scale spaziali. Con l&#39;imaging convenzionale segnale ottico intrinseco, il layout generale di mappe funzionali tutta la superficie della corteccia visiva può essere determinato 12. Lo sviluppo in vivo di due fotoni microscopia utilizzando coloranti sensibili calcio permette di determinare la SYNAPTingresso ic arrivare a spine dendritiche singoli 13 o record di attività contemporaneamente da centinaia di singoli corpi cellulari neuronali 6,14. Di conseguenza, combinando l&#39;imaging intrinseca segnale con la sub-micron risoluzione spaziale di due fotoni microscopia offre la possibilità di determinare esattamente quali segmenti dendritiche e cellule contribuiscono al micro-dominio di ogni mappa funzionale nella neocorteccia. Qui mostriamo un alto rendimento metodo per ottenere rapidamente una mappa corticale orientamento e di una versione specifica micro-dominio in questa mappa funzionale per l&#39;etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in un non-roditore mammifero. Con il microscopio stesso utilizzato per l&#39;imaging a due fotoni, dobbiamo prima di generare una mappa di orientamento utilizzando l&#39;imaging intrinseca segnale ottico. Poi ci mostrano come assegnare un micro-dominio di interesse con una micropipetta caricato con colorante per l&#39;etichetta sia una popolazione di corpi cellulari neuronali o l&#39;etichetta di un singolo neurone in modo tale che dendriti e degli assoni, le spine sono visibili invivo. Nostri perfezionamenti rispetto ai metodi precedenti facilitare un esame della neuronali relazioni struttura-funzione con sub-cellulare risoluzione nel quadro neocorticali architetture funzionali.

Per illustrare la precisione dei nostri metodi di etichettatura tinture, abbiamo mirato più piccolo micro-dominio di qualsiasi mappa noto funzionale nella neocorteccia non roditore. Scarsamente punteggiato tutta la mappa di orientamento nella corteccia visiva primaria sono singolarità. Questi si verificano nei punti in cui convergono tutte le orientazioni preferenziali in modo tale che nelle mappe in falsi colori di orientamento preferenziale, le regioni intorno l&#39;aspetto singolarità come &quot;girandole&quot; <s...

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Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

Un metodo è descritto per l&#39;etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in predeterminate funzionali micro-domini della neocorteccia. Primo, imaging segnale intrinseco ottico viene utilizzato per ottenere una mappa funzionale. Poi microscopia a due fotoni è usato per l&#39;etichetta e neuroni di immagine all&#39;interno di un micro-dominio della mappa.

Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Views.  Medical University of South Carolina. Un metodo è descritto per l'etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in predeterminate funzionali micro-domini della neocorteccia. Primo, imaging segnale intrinseco ottico viene utilizzato per ottenere una mappa funzionale. Poi microscopia a due fotoni è usato per l'etichetta e neuroni di immagine all'interno di un micro-dominio della mappa.

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In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Ricerca

Neuroscienze

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

Rilevamento di ipossia microregionale nella corteccia cerebrale di topo Imaging a due fotoni di fluorescenza endogena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

Due fotoni Imaging di Cellular Dynamics nel midollo spinale del mouse

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablazione di una popolazione neuronale utilizzando un Laser del due-fotone e sua valutazione usando formazione immagine del calcio e registrazione del comportamento nelle larve di Zebrafish

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.