The authors thank P. Levin, S. Moriya, S. Foster, and M. Pinho for the gift of strains and antibodies. They also thank L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper, and B. Dougherty for expert technical assistance. CBW is supported by an Australian National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (571905). LT was supported by a UTS Chancellors Postdoctoral Fellowship. MPS and ATFL were supported by Australian Postgraduate Awards. This work was supported by an Australian Research Council Discovery Project Grant (DP120102010) to EJH.

Preparazione del campione 1 <ol><li> Preparazione di B. Le cellule subtilis for Imaging <ol><li> Inoculare 10 ml di Penassay Broth (PAB, noto anche come antibiotico Medio 3) con una singola colonia di B. subtilis ceppo SU570 (168 TRPC2 FtsZ :: FtsZ-GFP-spec) 16. Crescere durante la notte in una bassa velocità (100 rpm) agitatore a 30 ° C. </li><li> Diluire la cultura durante la notte di 0,05 A 600 (assorbanza misurata a 600 nm) in PAB fresco a 30 ° C con l&#39;alta velocità (215 rpm) agitando e crescere fino alla fase di mid-esponenziale (A 600 ~ 0,4). </li><li> Aggiungere 2 g di agarosio elettroforesi-grade in 100 ml 1x terreno di crescita (PAB) in una bottiglia di vetro con tappo a vite. Sciogliere l&#39;agarosio in autoclave. Questo può essere conservato a 4 ° C per un paio di mesi, e cotto al microonde per sciogliere l&#39;agarosio quando richiesto. Lasciare impostare a temperatura ambiente. </li><li> Applicare una cornice adesiva (65 microlitri, vedi Tabella dei Materiali) su una GLA di seriess vetrino da microscopio. A tale scopo, rimuovere il foglio di poliestere sottile (ogni frame adesivo è disposto tra due fogli di poliestere, uno sottile e uno spessore, e ha il centro quadrato rimosso) e applicare la superficie adesiva esposta del telaio alla superficie del vetrino del microscopio. Questo crea effettivamente un pozzo quadrato sulla parte superiore della diapositiva. Lasciare il foglio di poliestere di spessore fissato al telaio in modo da evitare il coprioggetto attenersi ad esso nei passaggi successivi. </li><li> Sciogliere la soluzione di agarosio in un forno a microonde fino ad ebollizione e pipetta 67 microlitri nel telaio adesivo. Posizionare immediatamente un coprioggetto sulla parte superiore per creare una superficie piana e lasciare a temperatura ambiente per 5-10 minuti. Rimuovere il vetrino per 1-2 minuti mentre il campione è raccolto. </li><li> Raccolto un&#39;aliquota 1 ml del campione e centrifugare a 5.900 xg per 30 sec. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in 200 ml fresco PAB. </li><li> Prendete 2,5 ml di campione concentrato e pipetta su un pre-preparosso pad agarosio. Stendere il campione uniformemente lungo la superficie piana del pad agarosio. Rimuovere il telaio adesivo dal vetrino da microscopio con una pinzetta, pur non toccando il pad agarosio. </li><li> Trasferire il pad agarosio dal vetrino da microscopio di un piatto Petri diametro 35 mm, con fondo di vetro coprioggetto. Invertire il pad agarosio in modo che la sospensione cellulare e coprioggetto della piastra Petri sono in contatto diretto con l&#39;altro. Il fondo della capsula Petri ha un indice di rifrazione di 1,525 per immagini ad alta risoluzione. </li></ol></li><li> Preparazione del live S. Celle aureus for Imaging <ol><li> Seminare 10 ml di L-brodo con una singola colonia di S. aureus ceppo SA94 (SH1000 contenente aratro-FtsZ-GFP e pGL485; Erm r, Cm r) 25. Crescere durante la notte in una bassa velocità (100 rpm) agitatore rotante a 37 ° C. </li><li> Diluire la cultura durante la notte di 0,05 A 600 (assorbanza misurata a 600 nm) in fresco L-brodo con 0,05 mM IPTG (isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside) per indurre la produzione della proteina di fusione. </li><li> Incubare a 37 ° C ad alta velocità (215 rpm) agitando e crescere fino alla fase di mid-esponenziale (A 600 ~ 0,4). </li><li> Seguire i punti 1.1.3 - 1.1.8 come descritto per B. subtilis preparazione live-cella. Nota: Aggiungere la concentrazione appropriata induttore alla soluzione di agarosio al punto 1.1.3 per i ceppi che esprimono una proteina di fusione fluorescente sotto controllo inducibile. </li></ol></li></ol> 2 Preparazione del microscopio Questo metodo utilizza un sistema di imaging DeltaVision OMX (microscopio ottico, sperimentale) 3D-SIM dotato di un modulo di Blaze. Per gli esperimenti descritti, si utilizzano solo una laser e una telecamera. L&#39;illuminazione e il percorso della luce sono descritti in Figura 1. Questo metodo presuppone che il microscopio ha calibrazione appropriato, funzione di trasferimento ottico (OTF)file e luce manutenzione collimazione eseguite. <ol><li> Per gli esperimenti di imaging cellulare dal vivo, assicurarsi che la fase di riscaldamento è collegato alla fase ceramica e il collare dell&#39;obiettivo-riscaldamento è collegato all&#39;obiettivo (60X 1.42 oggettiva olio NA). </li><li> Attivare i riscaldatori oggettivi e stage di almeno 4 ore prima di imaging e lentamente rampa la temperatura al valore desiderato ad una velocità massima di 5 ° C / h. Si raccomanda di avviare questo processo la sera prima di imaging e rampa a 3 ° C / 4 ore. Per gli esperimenti dal vivo con cellule B. subtilis, la maggior parte degli esperimenti vengono eseguiti a 30 ° C. Per S. aureus, tutti gli esperimenti vengono eseguiti a 37 ° C. </li><li> Il giorno dell&#39;esperimento, attivare il sistema di almeno 1 ora prima di imaging per consentire al sistema e laser per stabilizzare completamente. Caricare il piccolo inserto palco piatto sul palco riscaldato per preriscaldare. <ol><li> Accendere la workstation controller master. </li><li> Accendere il workstat elaborazione delle immaginiione. </li><li> Accendere il dispositivo di raffreddamento fotocamera si trova sul pavimento fuori del recinto microscopio. </li><li> Accendere tutte le telecamere sCMOS (anche se non saranno tutti utilizzati). </li><li> All&#39;interno del recinto laser ed elettronica, attivare: <ol><li> Instrument Controller telaio. </li><li> Nanomotion telaio. </li><li> Regolatore di Jena per Z piezo. </li><li> Tutti i controller del motore 4 galvo. </li><li> Modulo di controllo laser primario. </li><li> Modulo di controllo laser secondaria. </li><li> Tutte le stazioni di lavoro della macchina fotografica. </li><li> Workstation OMXIC. </li></ol></li><li> Sulla workstation controller master, aprire il software OMX facendo clic sull&#39;icona. Impostare il percorso del file per salvare i dati in una cartella di dati appropriato. </li><li> Per inizializzare l&#39;hardware, andare al menu Hardware, scegliere Hardware e fare clic sul pulsante Riavvia hardware. Chiudere la finestra. </li><li> Avviare il Softworx software.Turn sui laser necessari per gli esperimenti (488 nm). </li><li> Accendere l&#39;interruttore a chiave per il blocco di sicurezza laser. </li><li> Assicurarsi che il cassetto del filtro dicroico corretta viene inserita sotto l&#39;obiettivo. Per GFP, è lo standard (o fisso) cassetto. </li><li> In OMX SF, andare al menu File, scegliere Impostazioni e selezionare il cassetto fisso dal menu a discesa cassetto. Chiudere la finestra. </li><li> Effettuare le seguenti operazioni dalla schermata principale del software, nella sezione Parametri di luce: <ol><li> Attivare la fotocamera appropriata per il laser di eccitazione e filtro per le emissioni (FITC) fotocamera dalla selezione del canale. </li><li> Controllare la modalità immagine è impostata su Sequenziale. </li><li> Controllare il percorso della luce è impostato su SI. </li><li> Controllare la modalità è impostata a 95 MHz. </li><li> Controllare il laser 488 viene selezionato in eccitazione. </li><li> Impostare il <strong&gt; Dimensioni di 512 x 512 per la dimensione della finestra e la categorizzazione di 1 x 1. </li></ol></li><li> Nella scheda Experiment, assicurarsi Type è impostato su SI dal menu a discesa. </li><li> Assicurarsi sezionamento viene attivata e che la spaziatura sezione ottica è impostata su 0.125. </li><li> Assicurarsi che il punto di messa a fuoco quando inizia la scansione è centrale. </li></ol></li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Applicare una goccia di olio sulla parte superiore dell&#39;obiettivo. Per i 37 ° C, l&#39;olio iniziale raccomandata ha un indice di rifrazione di 1.518 per abbinare meglio l&#39;indice di rifrazione del pad gel utilizzato per montare le cellule batteriche a 37 ° C (fare riferimento al punto 1.1.3). </li><li> Porre la capsula di Petri campione contenente le cellule preparate nel riquadro palco e coprire con il coperchio di riscaldamento circolare. Abbassare il palco finché l&#39;olio tocca il fondo dila piastra di Petri campione. </li><li> Lasciare il piatto per riscaldare-equilibrare per 15 minuti nella fase. Utilizzando una bassa impostazione Esposizione di 5 msec o meno (che si trova nella sezione Parametri Luce), si concentrano sul campione utilizzando i comandi di posizionamento nano stadio (DZ, si trova nella sezione Nano di posizionamento). Primo su e giù attraverso il campione per determinare se la luce si diffonde in modo uniforme sopra e sotto il piano focale del campione. Se la funzione del punto di diffusione è nemmeno (aberrazione sferica), pulire il fondo del piatto del campione e l&#39;obiettivo con cloroformio. Cambiare l&#39;olio e ripetere questo passaggio fino a quando viene trovata una corrispondenza adeguata tra l&#39;indice di rifrazione del petrolio e del campione per ridurre al minimo l&#39;aberrazione sferica. </li><li> Utilizzo di 0,5 micron dimensioni passo dZ, segnare la parte superiore e inferiore della pila di immagini. Tornare alla metà del campione. Fare clic sul pulsante Get spessore nella scheda Experiment per impostare lo spessore di acquisizione del campione. Keep l&#39;altezza del camino al minimo pur facendo attenzione a non tagliare la parte superiore e inferiore dello Z-ring. Spessori tipici per B. campioni subtilis sono 2-3 micron. </li><li> Determinare il valore massimo di intensità (Max) dell&#39;immagine del campione con le impostazioni di esposizione e% T attuali. Questo valore si trova sotto la finestra dell&#39;immagine. Per time-lapse imaging, regolare l&#39;esposizione e% T per ottenere un&#39;intensità massima di 1.100-1.400 sopra sfondo per l&#39;immagine. È necessaria una intensità minima di 1.000 sopra sfondo per ottenere la ricostruzione dell&#39;immagine. Per un&#39;immagine di una tantum, aumentare l&#39;intensità massima di 4.000-5.000. </li><li> Attivare la sezione Time-lapse nella scheda Experiment. Impostare il frame rate desiderato e il tempo totale. In File di dati, immettere un nome di file appropriato. Fare clic sul pulsante Esegui per avviare l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Nota: acquisizione immagine è completa quando il green Barra di avanzamento è finito e viene visualizzato un file di log per il set di dati nella cartella di dati appropriato. </li></ol> 4 Controllo di qualità dei dati <ol><li> All&#39;inizio dell&#39;acquisizione dell&#39;immagine, nota del valore massimo di intensità dell&#39;immagine all&#39;inizio dell&#39;acquisizione dell&#39;immagine per il primo fotogramma della serie temporale. Al termine dell&#39;acquisizione del primo telaio, controllare che non vi è stato più di una riduzione del 10% dell&#39;intensità del segnale attraverso il z-stack di questo primo fotogramma. Se vi è stato più di questo livello di photobleaching nel primo punto temporale, i dati attraverso la serie storica sarà di qualità insufficiente per l&#39;analisi e l&#39;acquisizione della serie volte può essere fermato. </li><li> Al termine dell&#39;acquisizione delle serie temporali, aprire il file immagine raw risultante con .dv suffisso e accertare la diminuzione di intensità massima del segnale dall&#39;inizio delle serie temporali per l&#39;immagine finale. Eliminare eventuali punti di tempo in cui ci deve apen oltre il 30% photobleaching. </li></ol> 5. immagini Ricostruzione 3D-SIM <ol><li> Dal menu Processo, attivare la finestra SI ricostruzione. Utilizzare le impostazioni preesistenti per tutti i parametri. </li><li> Attivare il pulsante OTF specifico uso del canale, e impostare il set di filtri standard. Attivare l&#39;uso specifico del canale pulsante KO angoli e impostato il set di filtri standard. </li><li> Trascinare il grezzo (.dv) il file nello spazio file di input. Fare clic su Esegui. Il file di output avrà lo stesso nome del file di input con _SI aggiunto alla fine. Nota: Questo processo di ricostruzione può essere eseguito come un compito utilizzando la funzione Task Builder dal menu Processo, se più file devono essere elaborati. </li></ol> 6. Esportazione dati e analisi <ol><li> Utilizzare Imaris di visualizzare immagini in 3D in modalità ed ex superaredati di immagine porta come tiff (300 dpi) o file avi (senza compressione). Misure di formato in Imaris possono essere eseguite utilizzando lo strumento di misurazione in modalità superare. </li><li> Generazione di grafici 3D di intensità del ring Z dalla 3D-SIM dati di immagine: <ol><li> Esaminare la distribuzione dei FtsZ intorno al ring Z e creare grafici 3D di intensità <ol><li> Aprire un file di immagine 3D per visualizzare i singoli z-fette. Utilizzare lo strumento visualizzatore del volume si trova sotto la scheda menu Visualizza per ritagliare una regione di interesse. </li><li> Inserire il numero di finestra per questa immagine 3D nella finestra di immissione e immettere un nuovo e inutilizzato numero finestra nella finestra di output. Il pulsante di selezione regione sarà disponibile per ritagliare un singolo anello Z di interesse dall&#39;originale 40 × 40 micron campo visivo. </li><li> Regolare l&#39;asse desiderato e il grado di rotazione nella scheda di rotazione. Fare clic sul pulsante Esegui. Scorrere il volume per ottenere la prospettiva desiderata dell&#39;anello Z. </li><li> Utilizzare lo strumento ispettore dati e regolare tha dimensioni colonna / riga per creare una nuova regione di interesse attorno a un anello individuo Z. Fare clic sul centro dell&#39;immagine per posizionare questa nuova regione di interesse. I dati dell&#39;immagine testo è una tabella generata automaticamente che visualizza l&#39;intensità di fluorescenza di ciascun pixel all&#39;interno della regione di interesse. </li><li> Fare clic sul pulsante 3D del grafico per visualizzare inizialmente la trama intensità. </li><li> In alternativa, i dati di immagine di testo possono essere esportati facendo clic sul pulsante Salva dati della tabella nel menu File. </li><li> Copiare i dati di immagine dal file di testo salvato in un nuovo foglio di calcolo. Selezionare tutte le celle all&#39;interno del foglio di calcolo e creare un nuovo grafico 3D Surface. Formattare il grafico plot intensità 3D per la pubblicazione. </li></ol></li><li> Per time-lapse ripetere i passi dati 6.2.1.1 - 6.2.1.7 su ciascuno dei diversi punti temporali del file di immagine 3D. </li></ol></li><li> Monitoraggio intensità media di fluorescenza nel tempo <ol><li> Utilizzare i dati di immagine del testo di tracciare i fluorescenintensità ce nel tempo in una regione di interesse. </li><li> Selezionare le celle che corrispondono alla regione di interesse. </li><li> Calcolare l&#39;intensità media di fluorescenza ad ogni tempo per questa regione di interesse. </li><li> Utilizzare i valori medi di intensità di fluorescenza per generare un grafico a linea separata. </li></ol></li></ol>

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Fluorescente live-cell imaging è un potente strumento che permette l&#39;osservazione dei cambiamenti dinamici all&#39;interno delle cellule nel corso del tempo. Immagini dal vivo della biologia cellula batterica è stato difficile a causa delle dimensioni piccole cellule e la capacità delle cellule batteriche di sopportare l&#39;esposizione ripetuta alla luce di eccitazione ridotta. F3D-SIM ha ampliato gli strumenti a disposizione per interrogare tutta la biologia cellulare, ma è necessario eseguire attentamente questa tecnica come artefatti possono essere introdotte se mal implementato. Ci sono una serie di considerazioni importanti per il successo nell&#39;uso di questa tecnica. Come è un metodo di imaging di fluorescenza a grande campo che si basa sull&#39;utilizzo della funzione punto diffusione della luce emessa, indice di rifrazione disadattamento e l&#39;aberrazione sferica della luce emessa deve essere evitata per consentire la ricostruzione delle immagini accurate. L&#39;uso di coprioggetto di 0,17 mm di spessore di alta qualità per evitare variazioni di intensità di segnale dovuta al vetro variabilità dello spessore nelle coperturelabbro è altamente raccomandato. E &#39;di fondamentale importanza per valutare attentamente l&#39;aberrazione sferica della luce emessa durante le fasi iniziali di tutti gli esperimenti e regolare l&#39;indice di rifrazione olio per immersione se necessario. Questo può variare da giorno per giorno perché dipende sia dalla temperatura e il montaggio di mezzi / substrato del campione. L&#39;uso dell&#39;olio invertita determina ricostruzione inferiore delle immagini con manufatti come aloni e segnali di eco. Al termine del processo di ricostruzione dell&#39;immagine, per ciascuna fase una misura della qualità della ricostruzione può essere ottenuta con il &quot;best fit per angolo kO&quot; per ogni fase / angolo di illuminazione. Se questo valore è inferiore a 1 per ogni angolo, quindi la qualità del ricostruito molto probabilmente sarà elevato. Se questo valore è superiore a 6, è più probabile che l&#39;immagine ricostruita conterrà manufatti. Artefatti comuni includono i) la comparsa di strisce nell&#39;immagine che corrispondead uno degli angoli della griglia. Ciò può derivare da basso segnale da questo punto di vista griglia; ii) haloing attorno a strutture. Ciò può derivare da livelli molto irregolari di segnale da strutture luminose rispetto alle strutture circostanti, una mancata corrispondenza di indice di rifrazione dell&#39;olio e il campione o può essere dovuto alle strutture presenti nell&#39;immagine essendo troppo amorfa e non contengono abbastanza &quot;struttura&quot; per essere riconosciuto dalla algoritmo; iii) &#39;nido d&#39;ape&#39;, che deriva da un segnale basso di rumore nell&#39;immagine, di solito a causa di elevato segnale di fondo; iv) le strutture che sono allungati / allungate in xy, che possono essere dovuti a rifrazione indice mancata corrispondenza del petrolio e del campione. Questo artefatto è difficile discernere per un utente inesperto. Si raccomanda che i nuovi utenti di consultare un ricercatore esperto SIM per consigli sulla interpretazione delle immagini e analisi quando si inizia ad utilizzare questa tecnica. Come per tutte le fluorescenti esperimenti di imaging live-cella, è importformica bilanciare attentamente l&#39;assorbimento di energia di eccitazione in modo da minimizzare il grado di photobleaching e fototossicità delle cellule con segnale di emissione sufficienti necessarie per ricostruire immagini con artefatto minima. Fotodecolorazione eccessiva (maggiore del 30% in una singola acquisizione z-stack) porterà ad un pattern striping nell&#39;immagine ricostruita. Con l&#39;uso di telecamere sCMOS, immagini super-risoluzione possono essere ricostruiti con successo da immagini RAW con segnale di emissione a partire da 1.000 conteggi sopra sfondo. Questo può consentire di tempi di esposizione molto brevi riducendo fotoscolorimento e consentendo acquisizione rapida per ogni fotogramma. Inoltre aumenta la quantità di tempo tra i fotogrammi per le cellule di recuperare dall&#39;ingresso energia di eccitazione. Inoltre, il tempo di acquisizione per ciascun telaio può essere molto breve, il grado di artefatto introdotto dal &#39;effetto movimento&#39; durante una cattura individuo si riduce con l&#39;uso di questo metodo. Questa parte variabilezione di 3D-SIM offre una serie di altri vantaggi rispetto alle altre tecnologie disponibili e super imaging ad alta risoluzione per l&#39;imaging dal vivo di biologi cellulari batteriche. L&#39;aumento di 2 volte della risoluzione in tutte e 3 le dimensioni e la capacità di immagine fino a 30 micron in un campione permette l&#39;imaging di cellule batteriche (e mammiferi) interi durante un esperimento. Tecniche come la localizzazione singola molecola che vengono comunemente eseguite in onda evanescente non possono raggiungere la profondità di penetrazione in un campione e non offrono informazioni sulle cellule intere. I recenti progressi che permettono profondità di campionamento più elevati per questa tecnica può risultare in una migliore risoluzione assiale di cellule intere. Inoltre, tecniche di localizzazione singola molecola che richiedono migliaia di immagini raw da acquisire sono anche limitati nel frame rate che possono essere catturate e possono richiedere compromesso tra frame rate di cattura e la risoluzione spaziale finale conseguito, in quanto la risoluzione spaziale dipende dal numero di EvaNTS registrate all&#39;interno di uno spazio definito. Diminuendo il numero di fotogrammi catturati si tradurrà in una risoluzione spaziale inferiore, ma può essere sufficiente per ottenere la risoluzione temporale necessaria per il processo biologico di interesse. La quantità di tempo di recupero tra i fotogrammi può anche essere necessario aumentare per ridurre al minimo fototossicità in cellule vive limitando in tal modo la durata e la frequenza con cui le serie storiche può essere ottenuto. Tecniche ad alta risoluzione, come la microscopia elettronica (EM) o elettroni cryotomography (ECT) offrono maggiore risoluzione su 3D-SIM (e altre tecniche di microscopia ottica super-risoluzione), ma devono essere eseguite su campioni fissi. Il fissaggio e la lavorazione possono introdurre artefatti e la mancanza di etichettatura possono rendere difficile l&#39;interpretazione. Libero-Label ECT ha scarso contrasto e può raggiungere profondità di penetrazione campione di circa 500-200 nm 24, quindi, anche se la proteina di interesse può essere identificata, non può essere osservata la struttura della proteina in una cellula batterica insieme.Anche quando etichettatura può essere utilizzato in EM, come ad esempio con immunogold, imaging viene eseguita solo in 2D. 3D è realizzabile solo con sezionamento sottile e ricostruzione di calcolo delle sezioni. La sottile sezionamento richiede un tecnico esperto, ma può essere problematico e portare a artefatto. Con cellule vive o fissi, 3D-SIM non ha bisogno di essere incorporato in modo specifico e cellule possono essere rapidamente preparato per l&#39;imaging in uno stato nativo vicino. Questo metodo è relativamente facile da implementare da ricercatori con una minima esperienza in microscopia a fluorescenza. Gli esperimenti possono essere eseguiti in media che supportano la funzione delle cellule sane fintanto che non fluorescenza o generare indebite segnale di fondo. Per le cellule batteriche, questo può consentire l&#39;uso di molti tipi di complessi e dei media minime o l&#39;uso di mezzi solidi o semi-solidi per controllare la motilità cellulare batterica. Molti biologi che hanno già ingegnerizzati proteina fluorescente (FP) fusioni e testato la funzionalità diqueste fusioni possono occupare questa tecnologia in rapida senza ulteriore progettazione e validazione di nuove fusioni FP fotoattivabile. Abbiamo trovato, come osservazione generale, che S. aureus era più suscettibile di photobleaching durante l&#39;imaging con fusioni FP rispetto a B. subtilis. Utilizzando i nostri metodi 3D-SIM originali, dove la griglia è stato generato da un reticolo fisico, siamo stati in grado di eseguire l&#39;imaging cellulare dal vivo con un numero di S. fusioni aureus FP. Tuttavia, con questo metodo F3D-SIM avanzata, siamo stati in grado di immagine queste fusioni FP e ad effettuare serie breve tempo per catturare la dinamica di queste proteine ​​taggati. Ciò è probabilmente dovuto ai tempi di esposizione ridotti necessari per l&#39;imaging e l&#39;aumento di tempo tra i fotogrammi per il recupero delle cellule. OMX Blaze 3D-SIM è una tecnologia disponibile in commercio che possono essere abbastanza facilmente realizzato in un singolo laboratorio o un centro di imaging di base. Bisogna fare attenzione a eseguire la tecnica per evitare di artifatti a causa della scarsa preparazione del campione o l&#39;acquisizione di immagini poveri. Una volta che la tecnica è padroneggiata, studi di struttura delle proteine ​​e la dinamica di piccoli organismi come i batteri possono essere eseguite in fluorescenza singola o multi-color.

Un certo numero di tecnologie di imaging diversi sono stati utilizzati nel corso degli anni a studiare i batteri tra cui vari elettrone e tecniche di microscopia ottica. Mentre microscopia elettronica offre risoluzione estremamente elevata, fino al nanometri, la necessità di un vuoto e l&#39;uso di agenti di contrasto ha limitato questa tecnica per campioni fissati ed embedded. Gli artefatti possono anche essere introdotte a causa di preparazione del campione lungo e un professionista esperto è necessario per preparare i campioni, e di analizzare e interpretare le immagini risultanti. La microscopia ottica offre i vantaggi di semplice preparazione del campione e l&#39;applicazione di etichette multiple con relativa facilità rispetto al microscopio elettronico. Utilizzo di proteine ​​fluorescenti e coniugati di tintura, la capacità di studiare cellule vive con la microscopia a fluorescenza è anche possibile. Con i miglioramenti nella stabilità fluoroforo e proteina fluorescente dimensione / struttura che portano alla diminuzione della tossicità delle cellule, così come i progressi nella fotocamera tecn rilevamentoology, microscopia a fluorescenza utilizzando sistemi di imaging confocale a largo campo e ha ampliato significativamente la nostra comprensione delle dinamiche spaziali di cellule. Utilizzando queste tecniche, la nostra conoscenza della cellula batterica negli ultimi 20 anni è progredita notevolmente ad un ben più dettagliato che rivela un elevato livello di organizzazione strutturale e proteine ​​all&#39;interno della cellula batterica 1. Tuttavia, i metodi convenzionali di microscopia ottica sono diffrazione limitata, il che significa che la risoluzione intrinseca è circa la metà della lunghezza d&#39;onda della luce di eccitazione utilizzato. Di conseguenza, anche con il sistema di microscopia ottica convenzionale più ottimale, la migliore risoluzione laterale è di circa 220-250 nm e la risoluzione assiale è di circa 500 nm (per una rassegna vedi Schermelleh et al. 2). Per i biologi delle cellule batteriche in particolare, questo ancora limita fortemente la nostra comprensione della organizzazione spaziale di queste piccole cellule; essendo solo 1-2 micron di diametrometro e 1-10 micron di lunghezza. Vi è anche la necessità di tecniche ad alta risoluzione che possono essere eseguite su cellule vive dove comportamento spaziale dinamica di una proteina può essere analizzato per integrare dati in vitro. Negli ultimi dieci anni, sono state sviluppate diverse tecniche di imaging di fluorescenza super-risoluzione. Super-risoluzione di microscopia descrive le tecniche di imaging che almeno il doppio della risoluzione laterale ottenibile con microscopia ottica convenzionale, superando così la barriera di diffrazione. Queste tecniche manipolare l&#39;illuminazione e / o analisi della luce emessa per creare aumenti reali nella risoluzione apparente. Ci sono attualmente tre principali tipi di tecniche di super-risoluzione - i) stimolato microscopia deplezione di emissione 3 (STED); ii) la microscopia localizzazione singola molecola, comprese le tecniche quali la microscopia localizzazione fotoattivazione 4,5 (PALM), stocastico la microscopia ottica ricostruzione <sup&gt; 6 (STORM), STORM diretta 7 (dSTORM), e la terra esaurimento Stato con singola molecola di ritorno 8 (GDSIM); e iii) l&#39;illuminazione strutturata microscopia 9-12 (SIM). Tecniche di localizzazione singola molecola offrono i maggiori incrementi di risoluzione laterale, fino a tra 10-40 nm in campioni biologici. In molte implementazioni di singola molecola microscopia localizzazione, la profondità di campionamento è limitato ad onda evanescente e le implementazioni iniziali di STED stati inoltre limitata profondità di campionamento. Tuttavia, recenti progressi come l&#39;uso di ottiche adattive, sfruttamento della astigmatismo in funzione del punto di diffusione in diversi punti focali, rilevamento multi-piano e utilizzando due obiettivi per dedurre la posizione assiale della luce emessa hanno visto miglioramenti sia assiale risoluzione e profondità di campionamento sia molecola STED e singola localizzazione 13,14. Velocità di acquisizione dati per STED e tecniche di localizzazione singola molecolasono anche relativamente lento a causa del gran numero di immagini che devono essere acquisiti per risoluzione massima (fino a 50.000 per tecniche di localizzazione). Questo lento acquisizione dati non si presta alla ripresa dei campioni vivi senza modifiche personalizzate che sono spesso piuttosto costosi. Queste due tecniche sono attualmente prestano perfettamente per i campioni fissi (per una rassegna vedi 2,15), tuttavia, molto lavoro è stato fatto per affrontare questa limitazione. Tridimensionale strutturato microscopia illuminazione (3D-SIM) è una tecnica a grande campo che migliora sia la risoluzione laterale e assiale con conseguente risoluzione di circa 110 e 280 nm, rispettivamente. Profondità di campionamento è fino a 30 micron dal coprioggetto, consentendo per l&#39;imaging di cellule intere. La variazione di 3D-SIM sviluppato da Sedat, Agard, e Gustaffsson sul Optical Microscope sperimentali (OMX) piattaforma comporta illuminando il campione con un modello di griglia nota che viene spostato in 15 diverseposizioni in ogni piano z 9-11. Le frange dei conseguenti effetti moiré che vengono creati nello spazio di frequenza al di fuori della regione osservabile sono misurati. Le informazioni dallo spazio di frequenza è computazionalmente ricostruito per generare un&#39;immagine visibile super-risoluzione di 10,11. La velocità relativa alla quale le immagini crude possono essere acquisite utilizzando questa tecnica permette l&#39;imaging delle cellule vive. Tuttavia, è importante notare che per i processi biologici che si verificano su una scala temporale di secondi, la velocità di acquisizione delle immagini prime è ancora troppo lento per catturare cambiamenti dinamici. Per la serie temporale con una velocità di acquisizione di secondi, l&#39;acquisizione ripetuto senza tempo di recupero sufficiente può portare a fototossicità e photobleaching, soprattutto durante l&#39;imaging dal vivo di piccole cellule batteriche. Per superare questi problemi, sono stati sviluppati i recenti progressi per rapida 3D-SIM (F3D-SIM). Qui si descrive uno noto come OMX Blaze 16 che ero iontroduced alla fine del 2011, questa tecnologia crea l&#39;illuminazione fantasia senza l&#39;uso di una rete fisica come è stato utilizzato nei sistemi precedenti. L&#39;uso di interferire fasci di luce e nuova tecnologia dell&#39;otturatore permette la creazione della luce modellata sul campione in modo molto rapido. La velocità di acquisizione delle immagini è stata ulteriormente migliorata con l&#39;introduzione della scientifica Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS) telecamere, soprattutto se paragonata alle telecamere EMCCD esistenti. Questi cambiamenti hanno comportato un possibile tasso di acquisizione di immagini di un fotogramma al secondo per una profondità di campionamento di 1 micron (512 x 512 pixel, 9 z-fette), consentendo il monitoraggio dei cambiamenti dinamici all&#39;interno delle cellule che si verificano in pochi secondi 16. La riduzione dell&#39;esposizione (eccitazione) volte apparenti di vivere le cellule che utilizzano questo metodo consente sia di serie tempo per essere catturato o un aumento del tasso di cattura. Qui si descrive l&#39;applicazione della microscopia F3D-SIM per esae la struttura e il movimento dinamico dell&#39;anello cytokinetic Z nelle cellule delle due specie batteriche: organismo modello Bacillus subtilis a forma di bastoncello e il patogeno umano coccoidi Staphylococcus aureus. FtsZ è una proteina del citoscheletro tubulina-like che svolge un ruolo chiave nella divisione cellulare nei batteri 17,18. Si localizza al sito divisione di reclutare almeno 20 altre proteine ​​di divisione, che formano l&#39;apparato divisione 17,18, e si crede per fornire la forza di costrizione delle cellule 19-23. Questo metodo rivela che FtsZ è eterogeneo distribuito lungo l&#39;anello Z in entrambi gli organismi in una disposizione bead-simili; risolvendo la lunga data questione se l&#39;anello Z è una cintura uniforme continua intorno alla cella, come visualizzato dal grande campo convenzionale microscopia a fluorescenza, o una struttura discontinua come suggerito da elettroni Cryo-tomografia (ECT) 24. Mostriamo come la capacità del 3D-SIM in grado di migliorare notevolmente l&#39;esame spaziale di piccoli (1micron di diametro) cellule rotonde come S. aureus che dividono in tre piani perpendicolari consecutivi (x, y, z). Studi time-lapse che utilizzano queste tecniche mostrano che la struttura dell&#39;anello Z è dinamico, con i cambiamenti lordi organizzazione all&#39;interno dell&#39;anello, piuttosto che molecole FtsZ muovono dentro e fuori di un ponteggio fisso 24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Agarose I (Biotecnology grade)</td>
			<td style="width:161px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:119px;">0710-500G</td>
			<td style="width:167px;">Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide (FM 4-64)</td>
			<td style="width:161px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T-13320</td>
			<td style="width:167px;">Lipophylic dye used for staining cell membranes.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:216px;">1.5 ml microtube, graduated Natural</td>
			<td>Scientific specialties Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1210-00</td>
			<td style="width:167px;">Made from Homopolymer polypropylene, Used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Luria broth base, Miller&#160;</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">241420</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions. Add 2%?? after autoclaving&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">210932</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Adhesive frame</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ABGAB-0577</td>
			<td style="width:167px;">&#160;Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15x16mm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microscope cover glass</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">111512-9</td>
			<td style="width:167px;">22x22 No 1 Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">35 mm diameter petri dish with a glass coverslip bottom</td>
			<td style="width:161px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:119px;">FD35-100</td>
			<td style="width:167px;">Known as FluoroDish with this company. Dish: &#216;35mm, Glass: &#216; 23mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0378-25G</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lincomycin hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L6004-5MU</td>
			<td style="width:167px;">Make a 25 mg/ml stock in 50% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Erythromycin&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Boehringer Mannheim GmbH</td>
			<td style="width:119px;">12390120-14</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Combined Orbital/Linear Shaking waterbath&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Grant scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">OLS-200</td>
			<td style="width:167px;">Shaking speed used for cultures: 215 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">UV visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:161px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:119px;">UV-1601</td>
			<td style="width:167px;">600 nm wavelength was used for measuring Optical density of bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415R</td>
			<td style="width:167px;">Pellets of bacterial culture were obtained by spidding down mid exponentially growing cultures at 8000 for 30 seconds&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">15502-10G</td>
			<td style="width:167px;">Prepare 1M stock and filter sterilze prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">softWoRx software</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;">version 5.0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Imaris data analysis software</td>
			<td style="width:161px;">Bitplane Scientific Software, Bitplane AG</td>
			<td style="width:119px;">version 7.0.0</td>
			<td style="width:167px;">Matlab XTensions included</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module.</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Blaze module fitted on OMX V3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss Axioplan 2&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of the cytokinetic z ring in live bacteria using fast 3d-structured illumination microscopy (f3d-sim)

Imaging di campioni biologici mediante microscopia a fluorescenza è progredita notevolmente con le nuove tecnologie per superare la risoluzione barriera della diffrazione della luce permettendo super-risoluzione di campioni dal vivo. Ci sono attualmente tre principali tipi di tecniche di super-risoluzione - deplezione emissione stimolata (STED), microscopia localizzazione singola molecola (incluse le tecniche quali PALM, STORM, e GDSIM), e microscopia illuminazione strutturata (SIM). Mentre le tecniche di localizzazione STED e singola molecola mostrano i maggiori incrementi di risoluzione, sono stati più lenti per offrire maggiore velocità di acquisizione delle immagini. Tridimensionale SIM (3D-SIM) è una tecnica di microscopia a fluorescenza a livello di campo che offre una serie di vantaggi rispetto sia singola molecola localizzazione e STED. La risoluzione è migliorata, con risoluzioni tipiche laterali e assiali di 110 e 280 nm, rispettivamente, e la profondità di campionamento fino a 30 micron dal coprioggetto, consentendol&#39;imaging di cellule intere. I recenti progressi (veloce 3D-SIM) nella tecnologia aumentando la velocità di acquisizione delle immagini raw permette di rapida cattura dei processi biologici che avvengono in pochi secondi, riducendo in modo significativo foto-tossicità e photobleaching. Qui si descrive l&#39;uso di uno di questi metodi di immagine cellule batteriche che ospitano il cytokinetic proteina fluorescenza marcata FtsZ per mostrare come vengono analizzate le cellule e il tipo di informazioni uniche che questa tecnica può fornire.

In questo studio abbiamo visualizzato la proteina divisione cellulare batterica FtsZ, espresso in cellule vive come una fusione FtsZ-GFP, per illustrare i vantaggi potenti di F3D-SIM over microscopia a fluorescenza convenzionale per studiare la localizzazione della proteina batterica e la dinamica. FtsZ è una proteina del citoscheletro tubulina-like che polimerizza in una struttura ad anello dinamica intorno alla circonferenza della cella. L&#39;anello Z ha una funzione importante nella divisione cellulare: la sua assemblea segna il futuro sito della divisione, esso assume tutte le proteine ​​di divisione cellulare a questo sito, e l&#39;anello Z costrizione sembra fornire la forza per permettere il movimento verso l&#39;interno della busta cellulare durante cytokinesis 17 , 18. Quando visualizzate dalla grande campo convenzionale microscopia a fluorescenza, l&#39;anello Z appare come una singola banda trasversale della fluorescenza in batteri a forma di bastoncello, compresi gli organismi più ben studiato come B. subtilis (Figura 2A), &lt;em&gt; E. coli e C. crescentus. È importante sottolineare che l&#39;intensità di fluorescenza in questo gruppo sembra essere più o meno uniforme, e il modello di localizzazione offre molto poco spaccato l&#39;organizzazione strutturale e la distribuzione di polimeri FtsZ all&#39;interno dell&#39;anello Z. Quando le stesse cellule vengono esaminate utilizzando il metodo F3D-SIM qui descritto (Figura 2B), tuttavia, i vantaggi di questa tecnica sono immediatamente evidenti. In primo luogo, la rotazione dell&#39;immagine 3D-SIM intorno all&#39;asse z consente la visualizzazione dell&#39;anello Z come una struttura ad anello genuino nello spazio tridimensionale (Figure 2C e 3A). Insieme con l&#39;aumento della risoluzione, questo rivela che la distribuzione del FtsZ nell&#39;anello Z è infatti estremamente eterogenee (Figura 3). Il miglioramento della risoluzione ci permette anche di vedere gli anelli Z che hanno iniziato il processo di costrizione per formare un setto di divisione (indicato dal invaginazione della membrana cellulare in &lt;strong&gt; Figura 2C e 2D). Ulteriori esempi di B. subtilis anelli Z visualizzati da questa tecnica sono illustrati nella Figura 3Bi - 3Biv e mostrano come l&#39;intensità di fluorescenza intorno al ring Z non è mai la stessa. Inoltre, le regioni di bassissima intensità di fluorescenza sono spesso osservate. Ci riferiamo a queste regioni lacune (punte di freccia bianche). Osserviamo queste lacune nel 15% di tutti gli anelli Z esaminati (n = 84) e prevalentemente in anelli Z aventi un diametro di 800-900 nm (93%). Per quantificare queste osservazioni, trame intensità 3D sono stati creati dell&#39;anello Z e sono mostrati in figura 3Ci e 3Cii utilizzando gli anelli Z mostrati nelle figure 3Biii e 3Biv. Le trame di intensità mostrano che in genere la quantità di fluorescenza sul ring Z può variare fino a 3 - 4 volte in diverse regioni del B. anello subtilis Z. Inoltre, le trame intensità 3D mostrano che la gaps della fluorescenza all&#39;interno dell&#39;anello Z quasi leggere i livelli basali di fluorescenza di fondo (freccia nera nella figura 3Ci). Questi esempi sopra riportati rappresentano buone ricostruzioni dell&#39;anello Z e dipendono luce sufficiente emessa dal campione senza significative photobleaching. Questo si realizza attraverso la luminosità del fluoroforo GFP fusa FtsZ e la sua abbondanza nella cella in queste condizioni (elevato rapporto segnale-rumore). In altre celle in cui il rapporto segnale-rumore è basso la ricostruzione dell&#39;immagine è scarsa. Per simulare questo evento con FtsZ-GFP, la quantità di segnale di emissione raccolti dal B. cellule subtilis è stata ridotta abbassando l&#39;energia di eccitazione. Come mostrato in Figura 3D una piega riduzione del 100 dei risultati energetici eccitazione in un&#39;immagine di Z-anello che ha artefatti significativi. Questo si verifica come conseguenza di insufficiente contrasto locale tra il segnale FtsZ-GFP e lo sfondo che porta a poor ricostruzione dell&#39;immagine. È interessante notare, B. anelli Z subtilis hanno mostrato lacune più pronunciate e eterogeneità nelle regioni superiori e inferiori l&#39;anello, ma non nei lati del ring (Figura 3B). Questo avviene a causa della differenza di risoluzione raggiunti da questa variazione di 3D-SIM nel piano laterale rispetto al piano assiale. Ciò si traduce nelle regioni superiori e inferiori del (piano laterale) anello Z di essere ripreso con risoluzione ottimale. Le lacune Z-ring sono troppo piccole per essere rilevate nei lati dell&#39;anello Z come visualizzato nel piano assiale, che ha circa la metà della risoluzione del piano laterale. I batteri che hanno una morfologia coccoidi, come S. aureus, ha gli anelli Z che sono posizionati in tutti i piani. Così l&#39;imaging l&#39;anello Z quando si trova nel piano laterale (o vicino ad esso) offre la possibilità di immagine tutte le regioni del ring con risoluzione ottimale. Approfittando di questo, abbiamo esaminato la struttura dil&#39;anello Z in diretta S. cellule aureus, utilizzando un ceppo che contiene un plasmide portante una fusione FtsZ-GFP. La produzione di questa fusione è sotto il controllo di un promotore inducibile P Spac (vedi punto 1.2.1). Quando ripreso con sul ​​piano assiale, S. anelli Z aureus è apparso identico a B. anelli Z subtilis che sono presenti nello stesso piano (Figura 4AI). Tuttavia, anelli di imaging Z nel piano laterale confermato che l&#39;intero anello Z apparso sia bead-simile ed eterogeneo. Circa il 26% di questi anelli ha anche mostrato almeno un &quot;gap&quot; visibile di fluorescenza (Figura 4Aii, 4B). Simile a B. subtilis FtsZ, piazzole di intensità di fluorescenza mostrano che l&#39;intensità della fluorescenza nell&#39;anello Z varia tanto quanto 4 - 6 volte in differenti aree del S. aureus Z anello (Figura 4C). La lunghezza e la larghezza delle sfere possono essere misurate (fare riferimento alla schematica nella Figura 4D). Questo ha dimostrato che l&#39;80% degli anelli Z (n = 43) che sono stati esaminati aveva una lunghezza cordone di 200 nm, raggiungendo una lunghezza massima di 400 nm. La larghezza di perline, dall&#39;altro, misurata a 200 nm. C&#39;era in media 12 ± 2 (SEM) perline FtsZ per anello Z. Dati di localizzazione simile è stata osservata quando FtsZ nativo è stato visualizzato con questi metodi che utilizzano la microscopia di immunofluorescenza (IFM), che dimostrano che questo modello localizzazione eterogenea e tallone-come era genuino e non un artefatto causato da espressione di FtsZ-GFP oltre al nativo FtsZ (dati non mostrato). Questo progresso del 3D-SIM è in grado di dimostrare che l&#39;anello Z appare come una struttura eterogenea ed è forse discontinuo in natura. Per affrontare la questione di come questa struttura Z-ring eterogeneo subisce costrizione e facilita la divisione cellulare, l&#39;analisi time-lapse della dinamica dell&#39;anello Z può essere eseguita. Una delle principali sfide conmicroscopia a fluorescenza studi time-lapse è nella minimizzazione di photobleaching campione e fototossicità durante l&#39;imaging. 3D-SIM richiede un gran numero di immagini raw per ottenere che significa che photobleaching di un campione nel tempo si tradurrà in cattivo rapporto segnale-rumore del segnale che porta alla insufficiente per consentire opportune ricostruzioni immagine. L&#39;applicazione della nuova tecnologia minimizza la quantità di energia di eccitazione utilizzata per ogni esposizione e quindi una diminuzione dell&#39;energia entrare nelle cellule vive. Ciò avviene mediante una combinazione di luce interferometria fascio per creare il modello strutturato sul campione e l&#39;uso di telecamere scientifici CMOS che aumentano la sensibilità e l&#39;efficienza quantica. Questa combinazione provoca l&#39;acquisizione z-pila di 1 micron per sec (512 × 512 pixel x 8 z-fette) rispetto a 1 micron per 5-8 sec (512 x 512 pixel x 8 z-fette) ottenuto con la nostra precedente iterazione di 3D-SIM (descritto nel Riglar et al. 26).Diminuendo il tempo di acquisizione dell&#39;immagine e impostazioni di esposizione può anche aiutare a minimizzare fototossicità di cellule vive, che è particolarmente rilevante negli studi time-lapse. La nuova tecnologia qui presentata affronta anche un altro problema in live-cell imaging che noi chiamiamo &#39;effetto movimento&#39; che in questo contesto si riferisce alla localizzazione delle proteine ​​cambiano durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Diminuendo il tempo di acquisizione dell&#39;immagine della quantità di &#39;motion blur&#39; è minimizzato creando così una ricostruzione un&#39;immagine più accurata. Precedenti studi che hanno affrontato come FtsZ è organizzato all&#39;interno dell&#39;anello Z non sono stati in grado di mostrare come struttura ad anello Z cambia nel tempo. Per indagare questo aspetto abbiamo effettuato time-lapse utilizzando F3D-SIM. Questa acquisizione permesso di una immagine 3D-SIM dell&#39;anello Z in B. subtilis ogni 5-10 sec su un periodo di 50 secondi, che in precedenza non era possibile in questa scala temporale. Mostrato in Figura 5A è un example dei rapidi cambiamenti nella distribuzione FtsZ all&#39;interno dell&#39;anello Z nel tempo (diametro di 890 nm). Altri anelli Z che erano visibilmente nel processo di costrizione stati anche dimostrato di avere dinamiche simili che hanno interessato la distribuzione di FtsZ intorno all&#39;anello Z (non mostrati). Trame intensità 3D possono anche essere generati per ciascuno dei punti di tempo per quantificare e apprezzare i continui cambiamenti di intensità di fluorescenza e l&#39;abbondanza relativa di così FtsZ in diverse regioni dell&#39;anello Z su una scala temporale di secondi (Figura 5B). Regioni di interesse possono essere identificati da queste trame intensità per monitorare le fluttuazioni di intensità di fluorescenza (Figura 5C). Il monitoraggio di tali cambiamenti nella struttura ad anello Z in queste condizioni sarebbe praticamente impossibile senza la tecnologia avanzata F3D-SIM. Inoltre, questo lavoro ha rivelato che in S. aureus il movimento dinamico della FtsZ è simile a quello osservato in B. subtilis. S. cellule aureus RN4220 producing FtsZ-GFP è stato ripreso per 50 sec a 10 intervalli di tempo sec. Modifiche alla eterogeneità dell&#39;anello Z in S. aureus con F3D-SIM erano simili a B. subtilis (vedi punte di freccia e le frecce in Figura 6). Questi studi time lapse supportano un modello di costrizione anello Z (il modello pizzicotto iterativo) che è stato previsto attraverso l&#39;esame di C. fisso cellule crescentus, ma non poteva essere dimostrato a causa della necessità di esaminare le dinamiche Z-ring in cellule vive 27. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 schematica della configurazione ottica del F3D-SIM utilizzata in questo studio luce. Laser dalla tabella laser è diretto attraverso una fibra SIM per un collimatore e fissato grata, poi nel modulo di controllo di fase che crea sia la lunghezza d&#39;onda specifica ottimale spaziatura of i ± 1 ° ordine travi della trave centrale di ordine zero ed i passaggi di fase per la raccolta SIM. Le travi poi entrano nel modulo di controllo dell&#39;angolo in cui i raggi si riflettono per i 3 gruppi per creare i 3 angoli di illuminazione. Le travi quindi immettere il microscopio e il percorso della luce come mostrato (Modificata con il permesso di Paul Goodwin, API). <img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig2highres.jpg" width="400" /> Figura 2 Confronto tra convenzionale fluorescenza a largo campo e imaging 3D-SIM di B. cellule che esprimono subtilis FtsZ-GFP. (A) a grande campo convenzionale imaging di fluorescenza di B. cellule che esprimono subtilis FtsZ-GFP (SU570, verde) come un unico esemplare sono stati colorati con la membrana colorante FM4-64 (rosso). Bar Scala = 5 micron. L&#39;immagine è stata acquisita utilizzando un microscopio a fluorescenza verticale.(B) 3D-SIM immagini dello stesso B. subtilis ceppo che esprime FtsZ-GFP, macchiata di FM4-64. Regioni di interesse dall&#39;immagine possono essere selezionati (casella tratteggiata) per ingrandire. L&#39;immagine può anche essere ruotata intorno all&#39;asse z per visualizzare anelli 3D FtsZ sul piano assiale. (C, D) La rimozione di out-of- messa a fuoco della luce e una migliore risoluzione d&#39;immagine che possiede 3D-SIM consente chiara visualizzazione di anelli Z (compresi quelli che sono costrizione) e la membrana cellulare interna durante la divisione (indicato dalle frecce bianche). Si noti che il testo protocollo descrive la visualizzazione di un singolo fluoroforo. Tuttavia, il procedimento può essere adattato per acquisire fino a quattro diverse lunghezze d&#39;onda simultaneamente. Questo dato è stato ristampato da Strauss et al 16. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. Immagini rappresentative della dell&#39;anello Z in cellule vive a forma di bastoncello batteriche (B. subtilis) che esprimono FtsZ-GFP con 3D-SIM. (Ai) L&#39;anello Z si osserva come una banda di fluorescenza perpendicolare all&#39;asse lungo della cella che si trova nel piano xy. (Aii) L&#39;immagine è stata ruotata attorno alla z -axis utilizzando software di visualizzazione Imaris 3D (fare riferimento al protocollo punto 6.1), in modo che si sta cercando attraverso la struttura ad anello per vedere chiaramente come FtsZ è distribuito all&#39;interno dell&#39;anello Z. Questa immagine, ora nel piano zx mostra che l&#39;anello ha una distribuzione eterogenea di FtsZ con le regioni di nessun o pochissimo fluorescenza (frecce bianche). L&#39;immagine deve essere ruotata rispetto di queste regioni gap &#39;di fluorescenza. Bi-Biv mostrano ulteriori esempi di anelli Z ruotati che ora giacciono nel piano zx. Anelli Z in (Bi-iii) hanno un diametro di circa 0,9 micron. (BIV) mostra un anello Z con un diametro di ONLy 0,65 micron subire differenze di FtsZ-GFP attorno all&#39;anello Z avente un diametro di 0,85 micron (vedi protocollo passaggi 6.1-6.3) costrizione. (Ci) Questo profilo di intensità 3D tipica illustra l&#39;intensità di fluorescenza (cioè concentrazione). Il livello di fluorescenza a queste lacune è basso e si avvicina a livelli di fluorescenza di fondo (freccia nera). (CII) Un profilo di intensità simile 3D di un anello Z nel processo di costrizione. Concentrazione FtsZ-GFP è anche non uniforme; diametro, 0,65 micron. Pannelli A, B, CI e CII sono stato ristampato da Strauss et al 16. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4 immagini Rappresentante 3D-SIM di S. cellule aureus producono FtsZ-GFP. Poiché queste cellule sono rotonde (cocchi), l&#39;anello Z si havdi e diversi orientamenti. Le cellule che mostrano una banda di fluorescenza nel normale orientamento di visualizzazione (cioè nel piano xy) come in (Ai), sono molto simili a quelli nelle celle astiformi quando ruotato intorno all&#39;asse Z come per la Figura 1AI. In (Aii) l&#39;anello Z è già nel piano xy; orientamento laterale e la risoluzione massima è sopra l&#39;intero anello che ora dà una struttura tallone-come (B). (C) Una trama intensità 3D della relativa abbondanza di FtsZ-GFP nell&#39;anello Z. (D) Rappresentazione schematica del S . anello aureus Z. Le frecce rosse indicano la lunghezza cordone e larghezza (fare riferimento al protocollo step 6.1). Questo dato è stato modificato da Strauss et al 16. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig5highres.jpg" width="500" /> &lt;strong&gt; Figura 5 F3D-SIM consente l&#39;analisi rapida di localizzazione FtsZ nel tempo in 3D-SIM. (A) Variazioni nella distribuzione FtsZ-GFP all&#39;interno dell&#39;anello Z a B. a forma di bastoncello cellule subtilis possono essere visualizzati per indicare la dinamica dell&#39;anello. Tempo (sec) è indicato nell&#39;angolo in alto a sinistra di ogni immagine. (B) appezzamenti di intensità di fluorescenza 3D mostrano la non uniforme e la distribuzione dinamica del FtsZ nell&#39;anello Z. (C) dinamica FtsZ (FtsZ-GFP cambiamenti fluorescenza del ring) può essere esaminata anche in modo più dettagliato quantificando intensità di fluorescenza nel tempo in due regioni di interesse. Questo dato è stato ristampato da Strauss et al 16. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51469/51469fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6 F3D-SIM immagini time-lapse mostrano cambiamenti nella localizzazione FtsZ all&#39;interno dell&#39;anello nel tempo a S. unureo. Una freccia bianca indica una lacuna quando viene inizialmente rilevata sul ring Z. La comparsa e la scomparsa di lacune nella stessa posizione (come indicato dalla freccia bianca) nel tempo illustra come FtsZ viene ridistribuito in tutto il Z-ring. Frecce bianche indicano la formazione di lacune sul ring Z a successivi intervalli di tempo. Tempo (sec) viene visualizzato sul lato superiore sinistro delle immagini. Questo dato è stato modificato da Strauss et al 16.

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Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-Resolution Imaging del Cytokinetic Z Anello in batteri vivi Uso di Fast 3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

19.8K Views.  University of Technology, Sydney. Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring. 

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Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

Visualizzare batteri nei nematodi usando la microscopia a fluorescenza

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Ricerca

Biologia

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-risoluzione Imaging della Divisione Macchine batterica

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

I campioni di prova per ottimizzare STORM Super-Resolution Microscopia

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparazione del campione per microscopia a forza atomica Virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Tridimensionale Super Resolution Microscopia di filamenti di F-actina da interferometrico fotoattivati ​​localizzazione Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Analisi singola particella open-source per Super-risoluzione Microscopia con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Stato fondamentale lo svuotamento super-resolution Imaging in cellule di mammifero

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

Applicazione di microscopia di velocità ad alta velocità super-risoluzione in Live cilio primario

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

Etichettatura specifica dei nucleoidi mitocondriali per la microscopia dell'illuminazione strutturata time-lapse

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...