Ringraziamo il dottor Kristen Verhey (University of Michigan, Ann Arbor) e Dr. Gregory Pazour (Università del Massachusetts Medical School) per la fornitura di alcuni plasmidi. Il progetto è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 e GM122552 a WY).

1. NIH 3T3-preparazione delle cellule per microscopia di velocità da stock
<ol><li>1,5 settimane in anticipo l'esperimento, recuperare una coltura fresca delle cellule NIH 3T3 da uno stock congelato scongelamento a 37 ° C e trasferendo le cellule di un matraccio di cultura cellulare2 25 cm con 3 mL dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) addizionata di 110 mg/mL piruvato di sodio, la glutamina 2mm, 10% siero bovino fetale e 1% di penicillina/streptomicina.</li>
	<li>Incubare le cellule a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 .</li>
	<li>Dividere le celle al confluency di 80%, circa ogni due giorni, almeno tre volte prima di giorno sperimentale per garantire omogeneità del ciclo cellulare. Tripsinizzano cellule con tripsina 0,25% per 2 min a 37 ° C, aspirare tripsina e sostituirlo con 2 mL di terreno. Pipetta il medium più volte per spezzare mazzi delle cellule, rimuovere il numero di celle desiderato e portare il volume totale dei media indietro fino a 3 mL. Nota: NIH-3T3 precedentemente erano geneticamente per esprimere NPHP-4, una proteina che si localizza alla TZ26, fusa al capolinea C a mCherry. mCherry è un fluoroforo che possa essere eccitato con illuminazione a 561 nm per localizzare quantitativamente la barriera di selettività TZ e orientare le ciglia primarie.</li>
	<li>Due giorni prima dell'esperimento, piastra le cellule in un fondo di vetro 35mm piatto al confluency di 60-70% con 1,5 mL di terreno stesso come passo 1.1 e restituiscono le cellule nell'incubatore.</li>
	<li>Un giorno prima dell'esperimento, transfect chimicamente le cellule con il plasmide desiderata. Mescolare 500-1000 ng del plasmide desiderato (vedere la Nota qui sotto) in un rapporto di 1: 2,5 con reagente di transfezione in 0,25 mL di media riduttori del siero senza antibiotici per 30 min media aspirato da 35 mm vetro piatto fondo e sostituirlo con il plasmide di 0,25 mL / mix di reagente di transfezione più un extra 1,25 mL di media riduttori del siero senza antibiotici. Riduttore del siero media serve allo scopo facilitare una successo transfezione, che inducono la crescita di ciglia primarie, come pure mantenere le cellule viva abbastanza a lungo per eseguire l'esperimento. Riporre le cellule nell'incubatore per l'esperimento il giorno seguente. Nota: Quando si esegue il rilevamento di singola molecola di IFT20, un plasmide contenente che un IFT20 geneticamente fuso al suo capolinea C GFP è usato25. Durante l'esecuzione di singola molecola rilevamento di SSTR3, un plasmide contenente un SSTR3 geneticamente fuso al suo capolinea N a un dominio di peptide (AP) acceptor e C terminale GFP è usato22. Oltre il costrutto SSTR3, un plasmide contenente la ligasi di biotina BirA deve essere co-espressi e i media di transfezione deve essere integrati con la biotina 10 µM. BirA attribuisce quindi biotina al dominio AP di recentemente sintetizzati molecole AP-SSTR3-GFP a livello dell'ER. Alexa647 coniugato a tre dei quattro siti di biotina-legante su streptavidina, in media, quindi può essere completata ai media prima di imaging a fluorescente etichetta le molecole di AP-SSTR3-GFP sulla superficie esterna della cella22,27 . GFP e AlexaFluor647 vengono utilizzati in questo metodo; Tuttavia, altre sonde fluorescenti possono essere utilizzate se hanno similmente alta fotostabilità e resa quantistica.</li>
	<li>Se utilizzando il costrutto SSTR3 etichettati esternamente, rimuovere il supporto dal fondo di vetro piatto 1 h prima di esperimento, lavare la cella 5 volte con 1 mL di tampone fosfato salino (PBS) e aggiunta 1 mL di siero riduttore terreno completati con 1 µM Alexa647 coniugato streptavidina.</li>
	<li>Non più di 15 min prima dell'esperimento, rimuovere il supporto dal vetro piatto fondo e lavare le cellule trasfettate ed etichettate 5 volte con 1 mL di PBS.</li>
	<li>Posizionare 1 mL di tampone di imaging (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) nel piatto fondo di vetro. Nota: Nel buffer di imaging, le cellule sono vitali per non più di 3 h. Di conseguenza, solo 2 h di esperimenti vengono eseguite su ogni piatto.</li>
</ol>2. microscopia di velocità
Nota: L'impostazione della velocità della microscopia include un microscopio di fluorescenza invertito dotato di un obiettivo apocromatico di 1,4-NA 100 × immersione in olio, un 35 mW 633 nm laser a He-Ne, 50 mW 488 nm e 561 nm laser a stato solido, un guadagno di moltiplicazione su chip charge-coupled device fotocamera e un pacchetto di software di microscopio per acquisizione dati ed elaborazione (Figura 1). Per l'imaging di singolo canale, GFP, mCherry e Alexa647 sono eccitati da 488 nm, 561 nm, o 633 nm laser, rispettivamente. Per il rilevamento di singola molecola, unico punto illuminazione viene utilizzato per tenere traccia di singole molecole fluorescente etichettati. Per l'imaging di epifluorescenza, una lente concava viene inserita nel percorso di illuminazione laser per espandere il raggio in un campo uniforme di illuminazione. Le emissioni di fluorescenza sono raccolti dall'obiettivo stesso, filtrate da un filtro dicroico (405/488/561/635) e un filtro di emissione (405/488/561/635) e ripreso con la telecamera sopra a 500 Hz per l'inseguimento di singola molecola o 2 Hz per formazione immagine di epifluorescenza.
<ol><li>Appone la piastra inferiore di vetro sul palco del microscopio e individuare una cellula che esprime correttamente i costrutti desiderati. Una volta che è stato trovato un cellulare adeguata, allineare la macchia NPHP4-mCherry alla base delle ciglia primarie con la posizione sul piano formazione immagine che corrisponde all'illuminazione di singolo punto del laser.</li>
	<li>Acquisire un'immagine di epifluorescenza del NPHP4-mCherry e IFT20-GFP o AP-SSTR3-GFP utilizzando la funzione "Snap" nella scheda "Fotocamera" della finestra "Focus controlli" se utilizza il pacchetto software di microscopia digitale (Vedi Tabella materiali). Nota: Queste immagini agirà come un riferimento per le posizioni successive singola molecola.</li>
	<li>Una volta ottenute le immagini di riferimento, localmente di ridurre la concentrazione di molecole singole con etichettate. Foto-candeggina la TZ con illuminazione di laser 1 mW per 20 s o fino a quando l'intensità di fluorescenza è vicina a quella di fluorescenza di fondo. Nota: Quando la concentrazione precisa può essere controllata, 0.1-1 nM etichettato singole molecole sono utilizzati.</li>
	<li>Per preparare per il rilevamento di singola molecola, ridurre la potenza di illuminazione del laser a ~0.15 mW per singole molecole etichettati con GFP o ~0.5 mW per molecole etichettata con Alexa647.</li>
	<li>Non appena la potenza del laser e parametri di imaging sono insieme, guadagno massimo e intensificazione e 2 ms frame rate, per l'imaging di singola molecola, coinvolgere il laser illuminazione appropriata e registrare non-photobleached, etichettato singole molecole che vengono trasportati attraverso la regione di photobleached del TZ facendo clic sul pulsante "Flusso" nella scheda "Fotocamera" della finestra "Controlli di messa a fuoco". Nota: Non più di 2 min di video devono essere acquisite per ridurre al minimo gli effetti di deriva ciliare ad un livello trascurabile.</li>
	<li>Dopo la cattura del video di singola molecola, elaborare i video utilizzando un algoritmo di raccordo gaussiana 2D, come scorcio dal laboratorio Gelles, che localizza con precisione il centroide di eccitazione di ogni singola molecola PSF in un'area che comprenda di interesse (AOI).</li>
	<li>Selezionare tutte le posizioni di singola molecola con precisione < 10 nm e correggere il centro delle ciglia basato sulla distribuzione delle posizioni di singola molecola dotata di una funzione gaussiana 2D. Nota: Utilizzando 2D all'algoritmo di trasformazione 3D, 3D trasporto visualizzati i percorsi delle vie IFT20-GFP e AP-SSTR3 sono chiaramente sulla membrana ciliare axonemal o ciliare, rispettivamente.</li>
</ol>3. 2D a 3D trasformazione
<ol><li>Una volta mille diverse localizzazioni per molecole (segnale-rumore rapporto > 11) in transito nel Cilio sono raccolti, è possibile selezionare l'asse lungo del cilio come la dimensione X. Fare un istogramma di dimensione Y delle posizioni e procurarsi le somme bin in incrementi di 10 nm. Nota: Da 2D a 3D trasformazione possono essere valutati da mano o qualsiasi software o linguaggio di programmazione. Gli autori hanno implementato con successo la trasformazione in Matlab e Python 2.7.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Leung, B. O., Chou, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+super-resolution+fluorescence+microscopy+for+biology.">Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology.</a> Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).</li><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. 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J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+distribution+of+transient+interactions+in+the+nuclear+pore+complex+obtained+from+single-molecule+snapshots.">Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).</li><li>Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-regulated+viscous+channel+in+the+nuclear+pore+complex.">Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+three-dimensional+mapping+of+mRNA+export+through+the+nuclear+pore.">High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore.</a> Nat Comm. 4, (2013).</li><li>Akey, C. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraflagellar+transport+protein+IFT20+is+associated+with+the+Golgi+complex+and+is+required+for+cilia+assembly.">The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly.</a> Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).</li><li>Awata, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPHP4+controls+ciliary+trafficking+of+membrane+proteins+and+large+soluble+proteins+at+the+transition+zone.">NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone.</a> J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).</li><li>Howarth, M., Ting, A. 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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Questo protocollo descrive l'applicazione di microscopia di velocità per il cilio primario, un organello di segnalazione cellulare che è altamente affidamento sul trasporto efficiente della proteina. Microscopia di velocità in grado di fornire alta risoluzione posizioni (< 10 nm) per molecole fluorescente etichettati come passano attraverso l'illuminazione di singolo punto centrato su TZ. In precedenza è stato applicato per studiare la proteina traffico attraverso il NPC6,<sup class...

Quanto affermato da Ernst Abbe nel 1873, la risoluzione di microscopia chiara convenzionale è stata creduta di essere limitato a circa 200 nm a causa della diffrazione della luce dall' obiettivo1,2. Attualmente, le tecniche di microscopia di Super-risoluzione rompono questa limitazione e permettono di catturare immagini dinamiche con risoluzione sub-diffrazione (< 200 nm). Le tecniche rientrano generalmente in due grandi categorie: stimolato gli approcci di microscopia basata di svuotamento (STED) emissione, che generano volume di illuminazione di Sub-diffrazione dovuto la risposta ottica non lineare di fluorofori in campioni3; e fotoattivazione microscopia (PALM) e microscopia di ricostruzione ottica stocastica (STORM)-basato su tecniche di Super-risoluzione, che utilizzano funzioni matematiche per localizzare i centroidi di fluorofori e quindi ricostituire questi centroidi per formare super-risoluzione immagini4,5. Attualmente, a causa del relativamente semplice setup ottico, PALM e tempesta sono ampiamente impiegati attivando solo un piccolo sottoinsieme di fluorofori in ogni fotogramma di un video lungo di una preparazione biologica. Questo consente per la localizzazione più precisa di raccordo 2D gaussiana dello spot fluorescente, definito la funzione di diffusione del punto (PSF), di proteine fluorescente etichettati in ogni fotogramma del video. La posizione 2D di ogni molecola fluorescente etichettati quindi possa essere sovrapposti su un unico piano di formazione immagine per produrre un'immagine di Super-risoluzione del biologico preparazione1,2. Mentre questi localizzazione singola molecola, approcci di Super-risoluzione per la microscopia certamente rivoluzionato come imaging di campioni biologici è stata eseguita, ci sono ancora sfide da superare. Ad esempio, tempesta e PALM può raggiungere i loro migliori risoluzioni spaziali dopo la fissazione dei campioni biologici e presentano quindi una rappresentazione statica delle proteine con etichetta fluorescente, che è una limitazione simile di microscopia elettronica. Inoltre, per ottenere un'alta risoluzione spaziale per ogni proteina fluorescente-labeled in cellule vive, i campioni devono essere imaged al framerate molto lungo che non sono in grado di catturare proteina dinamiche. Pertanto, è necessario per superare questi ostacoli tecnici principali.
Per ottenere un'alta risoluzione spazio-temporale che è particolarmente adatta per la rilevazione di proteine veloci o RNA in cellule vive, abbiamo sviluppato la microscopia di Super-risoluzione velocità nel nostro laboratorio (Figura 1)6,7, 8. diverse importanti progressi tecnici nella microscopia di velocità precedentemente ci hanno permesso di monitorare con successo trasporto nucleocytoplasmic di piccole molecole, proteine, mRNA e virus tramite nativo nucleare poro complessi (NPC)6, 7 , 8. brevemente, le seguenti funzionalità di microscopia di velocità verrà utilizzata per tenere traccia di macromolecole veloci attraverso le strutture simmetria rotazionale sub-micrometrica in cellule vive, come NPC e ciglia primarie: (1) un inclinato o un illuminazione verticale PSF consente l'eccitazione di singole molecole all'interno di un volume piccolo limite di diffrazione nel piano focale (Figura 1); (2), il PSF inclinato può evitare notevolmente out-of-focus fluorescenza e quindi migliorare il rapporto segnale-rumore. (3), la densità ottica di 100-500 kW / cm2 nell'illuminazione PSF permette a migliaia di fotoni per essere raccolti dal singolo fluorofori con velocità veloce rilevamento (> 500 Hz). Velocità di rilevazione (4), il digiuno inoltre notevolmente riduce l'errore di localizzazione spaziale di singola molecola (< 10 nm) nel determinare le traiettorie spaziali di molecole fluorescenti in movimento in cellule vive, perché la diffusione molecolare è uno dei principali fattori causando le imperfezioni della singola molecola localizzazione per lo spostamento di molecole. Algoritmi di trasformazione (5) ben consolidate 2D a 3D ci permettono di fornire mappe di densità di probabilità spaziale 3D delle vie di trasporto per le molecole in NPC o il cilio primario. È interessante nota che il nostro processo di conversione tra il cartesiano e il sistema di coordinamento cilindrico viene utilizzato per generare una densità di probabilità spaziale 3D mappa anziché 3D tracking della singola molecola (Figura 2). In precedenza, dati di microscopia elettronica hanno rivelato che la NPC9,10 e il cilio primario11 entrambi hanno una struttura simmetria rotazionale. In linea di principio, in modo casuale diffondere molecole si muove attraverso il NPC o il cilio primario dovrebbe anche avere distribuzioni simmetriche rotazionale. Come illustrato nella Figura 2, un elevato numero di molecole all'interno del cilindro di diffusione in modo casuale genererebbe simmetriche rotazionale distribuzioni la vista di sezione trasversale come quello nel NPC, ulteriore conseguente un circa uniforme spaziale distribuzione all'interno di ogni sub-regione molto piccola tra due anelli adiacenti (Figura 2E). Questa distribuzione uniforme porta che la distribuzione spaziale lungo dimensione θ nel sistema cilindrico è costante. Quindi le coordinate 3D (X, R, θ) possono essere semplificate per essere le coordinate 2D (R, X, costante). In realtà, il nostro processo di conversione tra il cartesiano e i sistemi cilindrici è da 2D (X, Y) a 2D (R, X, costante). Il θ costante, la densità spaziale p in Figura 2,Esi riferisce, viene calcolata utilizzando l'equazione A<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq1.jpg">.
In ultima analisi, rilevamento di singola molecola ha un'ampia applicazione nella ricerca biologica, così, è naturale che una pletora di tecniche sarà sviluppata per riempire nicchie biologiche specifiche12,13,14. Tale è il caso con microscopia di velocità. In precedenza, quando accoppiato con un algoritmo di trasformazione 3D, questa tecnica è stata sviluppata per risolvere i percorsi di trasporto 3D di transito attraverso gli NPC, una struttura biologica rotationally simmetrici e sub diffraction-dimensioni6molecole. In questa carta, ciglia primarie è dimostrato di essere organelli eccellente modello pure. Ciliari sono cilindrici, antenna-come organelli (raggio di ~ 125 nm) che proiettano dalla superficie delle cellule più mammiferi15,16,17. Sono responsabili per la ricezione di segnali esterni e trasmettere una risposta intracellulare in genere associata a crescita e metabolismo15,16. Di conseguenza, flusso di proteine strutturali, riciclo di recettori transmembrana e trasmissione di messaggeri intracellulari è responsabilità vitale delle ciglia primarie. Nel punto di giunzione tra le ciglia primarie e il corpo cellulare è una barriera di selettività critico, chiamata la zona di transizione o TZ, attraverso il quale tutto questo trasporto di proteine deve verificarsi11,18,19, 20. Oltre alla funzione di gating del TZ, almeno due processi di trasporto, trasporto intraflagellare e diffusione passiva, si pensiero siano responsabili del movimento della proteina attraverso questa regione16,21, 22. dal punto di vista della salute umana, la perdita delle ciglia primarie e conseguente deregolamentazione di segnalazione a valle è caratteristica di molti cancri. Inoltre, molte malattie genetiche, come la sindrome di Bardet-Biedl e malattia del rene policistico, sono associati con proteina difettosa trasporto23. Sia la dimensione del limite di Sub- diffrazione e il complesso processo di trasporto selettivo di proteine attraverso la TZ rendono le ciglia primarie un obiettivo primario per questa tecnica. In questa carta di metodi, dimostreremo il tracciamento di una proteina transmembrana ciliare, recettore della somatostatina 3 (SSTR3)24, etichettati esternamente con Alexa Fluor 647 e un componente dell'IFT, IFT2025, etichettati con una molecola GFP fusa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="618">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:123px;">25 cm2 tissue culture dish</td>
			<td style="width:204px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">VV-01936-00</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">15140122</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">10438018</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">DMEM</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">10566-016</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">OPTIMEM</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">31985062</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">Trypsin</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">25300054</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P3813-1PAK</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">Transit LT1</td>
			<td style="width:204px;">Mirus</td>
			<td style="width:101px;">MIR 2300</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">35 mm glass bottom dish</td>
			<td style="width:204px;">MatTek</td>
			<td style="width:101px;">P35GCOL-0-14-C</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:123px;">AlexaFluor 647-conjugated streptavidin</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">S21374</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">Biotin</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">B4501-100MG</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">633 nm He-Ne laser</td>
			<td style="width:204px;">Melles Griot</td>
			<td style="width:101px;">25-LHP-928-249</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">561 nm solid state laser</td>
			<td style="width:204px;">Coherent</td>
			<td style="width:101px;">OBIS 561-50 LS</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">488 nm solid state laser</td>
			<td style="width:204px;">Coherent</td>
			<td style="width:101px;">1185053</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:123px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:204px;">Olympus</td>
			<td style="width:101px;">IX81</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:123px;">1.4-NA 100&#215; oil-immersion apochromatic objective</td>
			<td style="width:204px;">Olympus</td>
			<td style="width:101px;">UPLSAPO 100&#215;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:123px;">On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera</td>
			<td style="width:204px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:101px;">Cascade 128+</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:123px;">Dichroic filter</td>
			<td style="width:204px;">Semrock</td>
			<td style="width:101px;">Di01- R405/488/561/635-25x36</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:123px;">Emission filter</td>
			<td style="width:204px;">Semrock</td>
			<td style="width:101px;">NF01-405/488/561/635-25X5.0</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">Slidebook 6.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td style="width:191px;">digital microscopy software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of high-speed super-resolution speed microscopy in live primary cilium

Il cilio primario è una protrusione microtubule-basato sulla superficie di molte cellule eucariotiche e contiene un unico complemento delle proteine tale funzione criticamente nella motilità cellulare e di segnalazione. Poiché le ciglia sono incapaci di sintetizzare le proprie proteine, quasi 200 unici ciliare proteine devono essere oggetto di traffico tra il citosol e ciglia primarie. Tuttavia, è ancora una sfida tecnica per mappare le tridimensionale (3D) posizioni delle vie di trasporto per queste proteine in vivo ciliari a causa delle limitazioni attualmente esistenti tecniche. Per vincere la sfida, recentemente abbiamo sviluppato e impiegato una microscopia ad alta super-risoluzione 3D virtuale ad alta velocità, definita microscopia Sub-diffrazione (velocità) singolo punto bordo-eccitazione, per determinare la posizione spaziale 3D delle vie di trasporto per entrambi citosolici e proteine di membrana in ciglia primarie di cellule vive. In questo articolo, ci dimostrerà la configurazione dettagliata di microscopia di velocità, la preparazione delle cellule che esprimono proteine ciliari fluorescenza-proteina-identificate, l'inseguimento in tempo reale di singola molecola di singole proteine in vivo Cilio e il raggiungimento di densità di probabilità spaziale 3D mappe delle vie di trasporto per le proteine ciliari.

Questa sezione illustra i dati ottenuti dall'esecuzione di microscopia di velocità presso la TZ delle ciglia primarie per studiare il percorso di trasporto di SSTR3 collegato da un linker esterno di nm ~ 15 a Alexa647 (Figura 3A). Esso ha il duplice scopo di verificare l'algoritmo di trasformazione 3D. Alexa647 dovrebbe solo etichetta la superficie esterna del cilio primario e di conseguenza, la via di trasporto 3D dovrebbe rivelare una via ...

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Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Recentemente abbiamo mappato le posizioni spaziali (3D) tridimensionale delle vie di trasporto per varie proteine dispostamento all'interno ciliari in cellule vive. Qui questo dettagli di carta la messa a punto sperimentale, il processo di campioni biologici e l'analisi dei dati per la fluorescenza 3D Super-resolution imaging approccio appena applicati in live ciliari.

Applicazione di microscopia di velocità ad alta velocità super-risoluzione in Live cilio primario

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

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High Speed Droplet-based Delivery System for Passive Pumping in Microfluidic Devices

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery system. Passive pumping is the phenomenon by which surface tension induced pressure differences drive fluid movement in closed channels. The automated fluid delivery system consists of a set of voltage controlled valves with micro-nozzles connected to a fluid reservoir and a control system. These voltage controlled valves offer a volumetrically precise way to deliver fluid droplets to the inlet of a microfluidic device in a high frequency manner. Based on the  dimensions demonstrated in the current study example, the system is capable of flowing 4 milliliters per minute (through a 2.2mm by 260um cross-sectional channel). Based on these same channel dimensions, fluid exchange of a point inside the channel can be achieved in as little as eight milliseconds. It is observed that there is interplay between momentum of the system (imparted by a combination of the droplets created by the valves and the fluid velocity in the channel), and the surface tension of the liquid. Where momentum provides velocity to the fluid flow (or vice-versa), equilibration of surface tension at the inlet provides a sudden stop to any flow. This sudden stop allows the user to control the flow characteristics of the channel and opens the door for a variety of biological applications, ranging anywhere from reagent delivery to drug-cell studies. It is also observed that when nozzles are aimed at the inlet at shallow angles, the droplet momentum can cause additional interesting fluid phenomena, such as mixing of multiple droplets in the inlet.

A novel microfluidic system has been developed using the phenomenon of passive pumping and a user controlled fluid delivery system. This microfluidic system has the potential to be used in a wide variety of biological applications given its low cost, ease of use, volumetric precision, high speed, repeatability and automation.

Alta velocità Droplet basato Delivery System per pompaggio passiva in dispositivi microfluidici

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery ...

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Biologia

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-risoluzione Imaging della Divisione Macchine batterica

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

I campioni di prova per ottimizzare STORM Super-Resolution Microscopia

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualizzazione dei G3BP stress Granuli Dynamics in cellule primarie in diretta

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparazione del campione per microscopia a forza atomica Virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-Resolution Imaging del Cytokinetic Z Anello in batteri vivi Uso di Fast 3D Structured Illumination Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Tridimensionale Super Resolution Microscopia di filamenti di F-actina da interferometrico fotoattivati ​​localizzazione Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Analisi singola particella open-source per Super-risoluzione Microscopia con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Stato fondamentale lo svuotamento super-resolution Imaging in cellule di mammifero

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Esame della dinamica nucleare del lievito di fissione mitotico e meiotico da fluorescenza microscopia a celle vive

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...