Supporto parziale per questo lavoro è stato fornito dal National Institute of Health (R01GM100470 e 1R01GM095959-01A1, per MA e JDS) e un sussidio Core strumento dalla Indiana clinica e traslazionale Sciences Institute (finanziato in parte dal NIH concedere # UL1 TR000006; a JDS).

1. Swarm Assay media Preparazione e inoculazione 4,5,7,8,11 <ol><li> Preparazione supporti NOTA: La composizione media di seguito descritto è applicabile a P. aeruginosa studi formazione viticcio. Si prega di consultare le specifiche dei media su Tabella 1 per P. aeruginosa, B. subtilis, e M. xanthus saggi motilità superficie. <ol><li> Mescolare 200 ml di FAB-minus (NH 4) 2 SO 4 medie sciame (Materials Table), 0,9 g di agar Noble, e 0,2 g di acidi Casamino (Tabella 1), mescolando con un bastoncino magnetico. Usare piccoli volumi (100-300 ml) per migliorare la coerenza tra esperimenti. </li><li> Autoclavare il composto 200 ml di agar / media utilizzando un tempo di esposizione di 22 min, temperatura di esposizione di 121,1 ° C, e una opzione di sfiato veloce. Le impostazioni autoclave permetteranno un&#39;adeguata sterilizzazione e fusione agar, ma evitare caramellizzazione agar. NOTA: agar Noble è incline a caramellozione; motilità batterica è alterata su agar caramellato. </li><li> Subito dopo il ciclo di sterilizzazione è finalizzato, chiudere il tappo della bottiglia mezzi per impedire la perdita di acqua per evaporazione. Si noti tuttavia che capping stretto può causare un &quot;vuoto di tenuta&quot; effetto -come sulla bottiglia. </li><li> Raffreddare il supporto a 50 ° C sotto agitazione a temperatura ambiente (RT) e 2 ml di 1,2 M sterile glucosio. In alternativa, inserire il supporto in un incubatore o bagnomaria a 60 ° C fino al momento dell&#39;uso (fino a 15 ore più tardi), e procedere come indicato. Per evitare la formazione di bolle in media, miscelare accuratamente con l&#39;ancoretta magnetica; bolle sulla superficie del agar impedirà ancora brulicante. NOTA: Per gli altri test, aggiungere in questa fase i componenti sensibili al calore che non possono essere sterilizzati in autoclave come i nutrienti o coloranti supplementari, se necessario (ad esempio, l&#39;aggiunta di 8 ml Invitrogen Syto 63 tinture per 100 ml fuso agar all&#39;immagine M. xanthus come mostrato in representative risultati, sotto). L&#39;aggiunta di alcuni coloranti può influenzare il comportamento brulicante di base, che va confrontato con un controllo non-dye. </li><li> In una cappa di laboratorio, aliquota 7,5 ml di mezzi sterile per 60 millimetri di diametro polistirolo piastra di Petri e mantengono le piastre in un singolo strato (non sovrapposti). Per maggiore superficie brulicante, aliquota 25 ml di media per 100 mm di diametro Petri dish. È importante riempire i piatti su una superficie piana orizzontale. Utilizzare livello degli occhi di un toro per verificare se la superficie è livellato. NOTA: Per P. saggi aeruginosa, con un volume di supporto specifici per piastra migliorerà la coerenza e la riproducibilità. Per B. subtilis e M. saggi xanthus, mano versando produce risultati paragonabili a aliquote specifiche di volume. </li></ol></li><li> Indurimento Piastra <ol><li> Per piccole piastre (60 mm), consentono il mezzo agar fuso per curare (sia impostato semi-solido e secco liquido in eccesso) nel cappuccio scoperta (cioè, senza coperchio) per 30 min. Più GrandiPiastre (100 mm) richiedono tempi più lunghi (vedi Discussione). NOTA: In alternativa, alcuni saggi possono richiedere piastre per curare il overnight da banco (20-24 ore) coperta (cioè, coperchi via) in un singolo strato (Tabella 1). Sciamatura è sensibile sia l&#39;umidità in eccesso e insufficiente. L&#39;umidità, flusso d&#39;aria, e la temperatura di un determinato laboratorio possono richiedere variazioni al piatto curare per promuovere sciamare ottimale di voi batterio. </li><li> Seminare piatti subito dopo il periodo di asciugatura. Non conservare le piastre per un ulteriore uso. <ol><li> Eseguire il &quot;test spread ink&quot; individuando una targa di prova con 10 microlitri miscela di 0,50% (vol / vol) Higgins nero impermeabile India inchiostro e l&#39;inoculo batterico 11. Se la miscela inchiostro / inoculo diffonde rapidamente (cioè non conserva la forma gocciolina) sulla superficie del supporto, i media avranno bisogno di tempo supplementare per asciugare. NOTA: Per le specie che sono particolarmente sensibili all&#39;umidità (&lt;em&gt; ad esempio, P. aeruginosa), eseguire una rapida &quot;test spread ink&quot; 11 per determinare se i piatti sono abbastanza asciutti. </li></ol></li></ol></li><li> Swarm Assay inoculazione <ol><li> Seminare 6 ml di terreni di coltura di brodo (vedi Tabella 1 per i dettagli) con una colonia isolata da un fresco (&lt;5 giorni se lasciato a temperatura ambiente) Terreno di Luria Bertani (LB) coltura in piastra. Incubare culture brodo overnight (≤18 HR) a 30 ° C o 37 ° C con agitazione orizzontale (240 rpm). </li><li> Seminare piastre sciame individuando con 1-5 ml di brodo di coltura durante la notte, o da &quot;frugando&quot; l&#39;agar con un dente sterili scegliere o filo inoculazione ago. NOTA: Noi preferiamo quest&#39;ultimo metodo perché diminuisce la probabilità di schizzi dell&#39;inoculo e impedisce l&#39;aggiunta di umidità aggiuntiva alla superficie sciame. </li></ol></li><li> Swarm Assay incubazione <ol><li> Per analisi generale, incubare le piastre saggio sciame a 30 °C o 37 ° C (o anche 42 ° C per B. subtilis, tabella 1): è un batterio specifico. Invertire le piastre durante l&#39;incubazione in modo che l&#39;eccesso di umidità si condensa sul coperchio, non il agar. NOTA: La temperatura può influenzare il fenotipo e cinetica. Per P. sciami aeruginosa, incubazione a 37 ° C porta ad espansione di sviluppo e sciami veloce di incubazione a 30 ° C; Tuttavia, la morfologia di questi sciami spesso differisce con questo cambiamento di temperatura. </li><li> Per l&#39;imaging time-lapse, incubare le piastre sciame alla giusta temperatura prima del trasferimento nella stazione di imaging (vedi Tabella 1 per i dettagli). NOTA: Questo incubazione pre-immagini permette sciami di iniziare il loro sviluppo ed insediamento, prima di essere trasferita in un nuovo ambiente, che può o non può essere ottimale per sciamatura motilità. </li></ol></li></ol> 2. Imaging macroscopica di Surface motilità Assays 7,8 &lt;ol&gt; <li> Per l&#39;imaging time-lapse, dopo le pre-immagini piastre luogo periodo di incubazione di analisi sciame su un piatto di imaging chiaro all&#39;interno di un in vivo Imaging Station commerciale. Immagine fino a sei, diametro 60 mm o quattro, 100 mm di diametro piastre alla volta. Poiché la fotocamera cattura immagini da sotto il piano di imaging, capovolgere le piastre in modo che il percorso ottico non ostruire 8. In alternativa, incubare a 30 ° C o 37 ° C (Tabella 1) per tutta la durata dell&#39;esperimento, e rimuovere le piastre per essere ripreso dal termostato ad intervalli di tempo prestabiliti. </li><li> Posizionare i coperchi delle piastre Petri verticalmente sopra controparte piastra che contiene il supporto inoculata. Riempire i coperchi delle capsule di Petri con acqua per evitare l&#39;essiccamento eccessivo durante l&#39;imaging, e racchiudere l&#39;intero set up con un altro vassoio chiaro a mantenere l&#39;umidità tutto l&#39;esperimento. </li><li> Utilizzando Imaging Molecolare (MI) 12 software, test eseguire (s) a temperatura ambiente utilizzando l&#39;iminvecchiamento impostazioni descritte nella tabella 2. Per l&#39;imaging time-lapse, impostare un protocollo con i passi e le specifiche necessarie. </li></ol> 3. Elaborazione dati e interpretazione 7,8 <ol><li> Image Processing <ol><li> Utilizzare il software MI per lotti esportare le immagini come file TIFF a 16 bit: File&gt; Esporta o esportare più&gt; Select file (s) per esportare e posizione di esportazione. </li><li> Utilizzare ImageJ per aprire una singola immagine o importare una serie di time-lapse: <ol><li> Aprire una sola immagine: File&gt; Apri </li><li> Import time-lapse sequenza di immagini: File&gt; Importa sequenza, e selezionare &quot;nomi Ordina numericamente&quot;. <ol><li> Per i file time-lapse grandi, selezionare &quot;Utilizza stack virtuale&quot; nella finestra &quot;Importa Sequence&quot; per impilare le immagini esportate in categorie appropriate (ad esempio, GFP, RFP, etc.). </li></ol></li></ol></li><li> Se necessario, modificare le immagini da file a 16 bit in file a 8 bit: Immagine&gt; Tipo&gt; 8-bit NOTA: Alcuni strumenti di ImageJ richiedono immagini a 8-bit. </li><li> Determinare se il segnale di intensità per una sequenza di immagini o time-lapse deve essere invertita. Posizionare il cursore su un punto luminoso nell&#39;immagine (ad esempio, la crescita fluorescente) e notare l&#39;intensità del segnale &quot;Value&quot; dalla barra degli strumenti ImageJ. Quindi, posizionare il cursore in una macchia scura di fuori dell&#39;area piastra e notare l&#39;intensità del segnale. Se l&#39;intensità del segnale per il punto nero è maggiore l&#39;intensità del punto luminoso, l&#39;intensità del segnale di immagine deve essere invertita (seguire sottofasi 1-2 sotto). <ol><li> Invertire i segnali di intensità: Modifica&gt; Inverti </li><li> Invertire la tabella di ricerca: Immagine&gt; Tabelle di ricerca&gt; Inverti LUT </li></ol></li><li> Sottrarre il fondo: Processo&gt; Sottrai sfondo, e utilizzare un &quot;raggio di rotolamento della sfera&quot; con un raggio di pixel che è la metà di una dimensione dell&#39;immagine (ad esempio, 1.000 pixel per una 2.000 x 2.000 pimmagine Ixel). </li><li> Artificialmente colorare un&#39;immagine o time-lapse sequenza: Immagine&gt; Tabelle di ricerca e selezionare il colore appropriato dalle opzioni della lista. </li><li> Per i film con due o più canali, unire e bilanciare i colori prima di salvare come un film (Image Processing, Punto 8). Per unire le immagini insieme, aperto tutte le pile di immagini di ImageJ, quindi selezionare Immagine&gt; Colore&gt; Unisci canali e assegnare ogni pila di un canale di colore. </li><li> Risparmia sequenza time-lapse, come AVI o QuickTime Movie: File&gt; Salva con nome e scegliere il formato e le specifiche desiderate. </li></ol></li><li> Analisi Dei Dati <ol><li> Acquisire batterica Area Crescita Surface per quantificare espansione Tasso <ol><li> Apri l&#39;immagine (s) in ImageJ </li><li> Per calcolare il diametro della piastra in pixel, tracciare una linea attraverso il centro di una piastra di dosaggio con lo strumento &quot;diritta&quot; dal e misurare la lunghezza: Analizzare&gt; Misura </li><li> L&#39;unità di misura predefinita in ImageJ è pixel. Ottenere un fattore di conversione dividendo il diametro della piastra di dosaggio (per esempio, 60 per una piastra 60 mm) per la lunghezza pixel ottenuto nel passaggio precedente. </li><li> Modificare l&#39;unità di misura da pixel a mm: Immagine&gt; Proprietà <ol><li> Modificare la &quot;Unità di lunghezza&quot; a &quot;mm&quot;, e il &quot;Pixel Width&quot;, &quot;altezza Pixel&quot;, e &quot;Voxel Depth&quot; per il fattore di conversione calcolata nel passaggio precedente. Selezionare la casella &quot;Global&quot; per mantenere questo fattore di conversione su più immagini. NOTA: Se ImageJ è chiuso e riaperto, o il campo di vista di un&#39;immagine viene modificato (cioè, un&#39;immagine viene ingrandita più di un altro), il fattore di conversione deve essere ricalcolata. In alternativa, eseguire tutte le analisi in pixel e poi convertito in mm. </li></ol></li><li> Per ogni frame, tracciare e misurare l&#39;area sciame utilizzando funzione &quot;a mano libera selezioni&quot; nella barra degli strumenti per tracciare il ouTLIN dello sciame e misurare l&#39;area utilizzando: Analizza&gt; Misura. Questo genererà un log misure che possono essere salvate per ulteriori analisi in Microsoft Excel o altri programmi simili: File&gt; Salva con nome </li></ol></li><li> Acquisire batterica Intensità Crescita Surface per quantificare Surface Tasso di crescita <ol><li> Una volta che il fondo viene sottratta (Image Processing, punto 5), utilizzare l&#39;ultimo fotogramma della sequenza per determinare la superficie massima di sciame (Analisi dei dati, Step 1). </li><li> Utilizzare lo strumento di selezione &quot;Oval&quot; dalla barra degli strumenti per disegnare un riquadro attorno alla crescita della superficie batterica. </li><li> Impostare la misurazione dell&#39;intensità di pixel nella casella utilizzando significa: Analizza&gt; Set misurazioni, e selezionare &quot;Valore medio grigia&quot;. </li><li> Per ottenere misure di segnali di intensità per ogni fotogramma della sequenza time-lapse, mentre sul primo fotogramma della sequenza andare a: Analizza&gt; Misura. Questo genererà un log misure che possono essere salvate per ulteriori analisi in Microsoft Excel o programmi simili: File&gt; Salva con nome </li></ol></li><li> Alternativa alla sezione precedente (Analisi dei dati, punto 2). Utilizzare il plugin ImageJ macro per impostare e gestire una crescita superficiale sceneggiatura misura intensità Macro. <ol><li> Setup uno script di misurazione automatica per analizzare più fotogrammi contemporaneamente: Plugin&gt; Nuovo&gt; Macro, e incollare lo script fornito (sotto) nella casella e salvare come file di testo ImageJ Macro: File&gt; Salva, e salvare la cartella dell&#39;applicazione ImageJ sotto &quot; macro &quot;. numberOfFrames = N for (i = 0; i &lt;numberOfFrames; i ++) { eseguire (&#39;misura&#39;); eseguire (&#39;Next Slice [&gt;]&#39;); } NOTA: Qui la variabile &quot;N&quot; è un numero indefinito di fotogrammi. </li><li> Modificare le &quot;numberOfFrames&quot; nel plug macro per ogni esperimento per riflettere il numero di fotogrammi in sequenza di immagini prima di eseguire lo script. Uso: Plugin&gt; Macro&gt;Modifica e digitare il numero corretto di fotogrammi in sequenza e salvare (File&gt; Salva). </li><li> Seguire substeps 1-3 in Data Analysis-Step 2, e mentre sul primo fotogramma della sequenza di esecuzione il plugin macro: Plugin&gt; Macro&gt; Esegui. Questo genererà un log misure che possono essere salvate per ulteriori analisi in Microsoft Excel o altri programmi simili: File&gt; Salva con nome </li></ol></li></ol></li></ol>

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Spese di pubblicazione di questo articolo sono stati parzialmente sponsorizzati da Bruker Corporation.

Raggiungere sciamatura riproducibile in laboratorio può essere impegnativo, come saggi sciami sono molto sensibili a fattori ambientali, come l&#39;umidità e le sostanze nutrienti disponibili. L&#39;aspetto più critico di una superficie dosaggio piastra motilità è umidità sulla superficie di agar. Prima di inoculazione, i media sciame deve essere sufficientemente asciutto per evitare le cellule batteriche dal nuoto attraverso il liquido di superficie, ma non così secco da inibire brulicante motilità 5. L&#39;incubazione deve avvenire in un ambiente sufficientemente umido: troppo poca umidità può causare il test essiccazione durante l&#39;incubazione, mentre troppa umidità può portare a superficie artificiale o artefatta diffusione. A meno che un incubatore umidità controllata è a portata di mano, incubatore e laboratorio di umidità può variare notevolmente. Di conseguenza, un serbatoio supplementare di acqua, un umidificatore o un deumidificatore nella incubatore potrebbero essere necessarie per prevenire l&#39;essiccazione o sopra l&#39;accumulo di umidità in eccesso mantenendo la relative umidità vicino all&#39;80%. Il mantenimento di tale umidità ideale può risultare difficile se i cambiamenti di umidità stagionali sono significative. Se questo è il caso, il protocollo test sciame richiederà alcuni adeguamenti per tener conto delle variazioni stagionali di umidità. Abbiamo scoperto che modificando il tempo di supporto sciame di essiccazione è il modo più semplice per regolare per variazioni di umidità stagionali. Monitoraggio di umidità costante, sia all&#39;interno che all&#39;esterno dell&#39;incubatrice, è raccomandato. Inoltre, si raccomanda che i ricercatori calibrare e validare i loro strumenti, incubatori, bilance, ecc errori come minori di temperatura, volume o quantità di componenti multimediali possono influire riproducibilità di questi test. Va inoltre osservato che il tipo e le dimensioni della piastra usato nel saggio possono influenzare piastra umidità, e pertanto brulicante. Piastre ermetica Non sfogare fuori l&#39;umidità in eccesso, incoraggiando così il nuoto motilità. Al contrario, le piastre a doppia facciata permettono troppa umidità a fuggire. Un piatto di Petrifornisce un ambiente ideale perché sfoga fuori abbastanza umidità in eccesso per evitare l&#39;accumulo di liquidi, ma mantiene abbastanza umidità per evitare che il supporto si secchi. Questo metodo dettagli di un protocollo test motilità superficie che permette l&#39;imaging di alta qualità. Per mantenere l&#39;agar chiara per l&#39;imaging 60 millimetri Ø piatti sono pieni di 7,5 ml di agar. Se non è richiesto l&#39;imaging dettagliato, i volumi fino a 20 ml possono anche fornire risultati riproducibili. Mentre brulicante motilità può essere realizzato su una vasta gamma di concentrazioni di agar, la gamma ottimale di agar necessaria per sciamare dipende dalla specie. Nel complesso, le concentrazioni più elevate di agar inibiscono brulicante motilità, e di conseguenza il tempo necessario per produrre un&#39;immagine-ready sciame aumenta. P. aeruginosa generalmente sciami sulle concentrazioni agar tra 0,4-0,7% 1, ma troviamo che sciamare ottimale si verifica in un range molto ristretto (0,4-0,5%). Altri, come B. subtilis e S. entericouno sciame al 0,6% agar, e Vibrio parahaemolyticus al 1,5% agar 10. La concentrazione di agar necessaria viene determinata anche dal tipo e marca di agar. Superiori agar purezza, come agar Noble, aumentano fortemente brulicante in P. aeruginosa e sono preferite rispetto granulato agar 13,14. Tuttavia, queste versioni purificati di agar sono anche più inclini a caramellizzazione durante il ciclo di sterilizzazione in autoclave; a seconda dello strumento, un / sequenza di sterilizzazione modificato ridotto (per modificare, eventualmente, il ciclo di scarico per evitare l&#39;esposizione al calore prolungato) può essere richiesto per preparare supporti sciame con agar Noble. Composizione media svolge anche un ruolo nel sciame fenotipo osservata 3. P. aeruginosa studi brulicante motilità sono di solito eseguite con terreni di coltura minimo. Preferiamo FAB medio 4,8 (Materials Table), ma anche altri media, come M9, LB, o leggere variazioni a questi mezzi comuni,sono stati utilizzati con successo 9,15,16. Formazione Tendril migliore avviene nelle FAB terreno minimo addizionato con glucosio come fonte di carbonio e acidi Casamino (CAA), ma senza una fonte di azoto addizionale (cioè, (NH 4) 2 SO 4) 6,13. Se la formazione viticcio o la morfologia non è l&#39;obiettivo principale dello studio, quindi FAB terreno minimo (Materiali tabella; Tabella 1) priva di CAA si raccomanda in modo che gli effetti di fonti di carbonio specifici e / o sostanze nutrienti supplementari possono essere studiati in dettaglio. Altre specie, come B. subtilis (presentato qui), sono swarmers versatili, capaci di sciamare su LB e agar granulato. Queste specie sciame facilmente, richiede solo ~ 10 ore per sviluppare uno sciame completo. Questo rapido tasso brulicante fa seguito alla progressione dello sciame potenzialmente difficile, ma il nostro protocollo rende tale monitoraggio molto fattibile. La possibilità di eseguire sciame time-lapse imaging fornisce un sostanziale facilità di acquisizione dati sciame, in particolare da tali sciami accaniti. Introduciamo un robusto, completo, protocollo a due fasi e le linee guida volte a migliorare l&#39;esecuzione e la riproducibilità di batteri ricerche motilità superficie ed abbiamo soprattutto sottolineato gli aspetti importanti per esaminare sciamatura flagellare-mediata. Dettagli Questo protocollo test sciame aspetti importanti della composizione e la movimentazione delle lastre motilità superficie media per garantire una maggiore coerenza e riproducibilità all&#39;interno e tra gruppi di ricerca. Ciò permetterà di migliorare la base di confronto tra i diversi studi di ricerca. Inoltre, l&#39;approccio presentato e protocollo prevede mezzi per fare ricerca sulla brulicante e di superficie motilità meno sensibili alle variazioni ambientali, rendendo ricercatori consapevoli che tali fattori influenzano il loro lavoro e fornire possibili soluzioni (ad esempio, come piccoli cambiamenti nella agar influiscono brulicante 4,5 ). Inoltre, il protocollo fornitoquantificare aspetti macroscopici di sciamare, offre la possibilità di misurare molti attributi di crescita superficie batterica che erano in precedenza quantificabile. Non abbiamo esaminato tutti i batteri mobili di superficie per lo sviluppo di questo protocollo. Come tale, si prevede che modifiche protocollo saranno necessari per specie non qui presentati. L&#39;efficienza di questo protocollo è limitata dai limiti intrinseci delle apparecchiature e dei materiali impiegati. Per esempio, gli studi relativi alla temperatura non sono possibili ancora con la stazione di imaging Bruker, poiché il controllo della temperatura non è una caratteristica dell&#39;apparecchiatura. Inoltre, l&#39;uso di coloranti (ad esempio Nilo Red macchiare rhamnolipids) può avere limitazioni cinetiche e concentrazione 8. Questa tecnica si basa fortemente sul trattamento e analisi di immagini digitali; migliore automazione dell&#39;analisi di dati (ad esempio, usando macro supplementari funzione di script in ImageJ) sarebbe ridurre il tempo necessario per l&#39;analisied espandere l&#39;utilità dei dati. Infine, a causa della robustezza del protocollo di imaging, le applicazioni future devono mirare ad espandere questa tecnica per esaminare le superfici di crescita meno uniformi che sono più rilevanti per le superfici colonizzate dai batteri ambientali e patogeni.

Molti batteri muovono su superfici con diversi mezzi di auto-propulsione. Alcuni fenotipi motilità possono essere ricercate in laboratorio utilizzando saggi targa che sono influenzati dall&#39;ambiente liquido associato alla semi-solida composizione test piatto. Un sottogruppo di superficie utile test piastra motilità coinvolgere ulteriormente un aereo gas fase tipicamente stanza. Di conseguenza, il risultato di un particolare dosaggio motilità superficie, richiede un attento controllo dell&#39;interfaccia di tre fasi: la superficie solida ambientale locale, ambiente liquido, e proprietà dell&#39;ambiente gas. La modalità motilità più comunemente studiato in tale dosaggio trifase è noto come brulicante. Swarming motilità è il movimento coordinato gruppo di cellule batteriche che sono spinto dalla loro flagelli attraverso film liquidi sottili su superfici 1. E &#39;tipicamente studiato nei laboratori utilizzando test piastra semi-solidi contenenti 0,4% -0,8% (peso / volume) agar 1. Una serie dipatogeni umani sfruttano questo comportamento motilità di esplorare e colonizzare l&#39;ospite umano. Ad esempio, Proteus mirabilis utilizza brulicante motilità per spostare l&#39;uretra, raggiungere e colonizzare la vescica e reni 2. Swarming motilità è generalmente considerato un passo precursore formazione di biofilm, la prima causa di patogenesi in molti patogeni umani 3. Il fenotipo brulicante è molto varia tra le specie batteriche; successo sperimentale e riproducibilità fortemente basano su fattori quali la composizione nutritiva, agar tipo e composizione, protocollo di sterilizzazione (ad esempio, in autoclave), polimerizzazione supporti semi-solido, e umidità ambientale (ad esempio, variazioni stagionali), tra gli altri 3-5. La variabilità delle risposte motilità superficie sottolinea le sfide incontrate in questi studi e dei media influenza notevole e l&#39;ambiente può esercitare. Per alcune specie brulicanti, come Pseudomonas, brulicante motility può verificarsi in una varietà di composizioni di media, anche se il fenotipo osservato e accompagnamento tasso di espansione sciame variano notevolmente 3. Insieme, questi fattori possono fare studi di motilità superficie estremamente impegnativo. La variabilità stagionale all&#39;interno di un laboratorio in grado di influenzare questi test trifase: saggi possono funzionare meglio in umido con aria di estate e peggio in aria secca dell&#39;inverno. Qui vi presentiamo le linee guida generali per aggirare alcune delle sfide più importanti quando si eseguono studi piastra motilità superficie. Per alcuni studi motilità superficie, lo sviluppo di specifici fenotipi è di grande interesse. La maggior parte, ma non tutti, gli studi pubblicati per esaminare brulichio di P. aeruginosa mostrano la formazione di viticci o frattali irradiano da un centro di inoculazione 3-9. Differenze tra P. ceppi aeruginosa sono stati documentati 5,8, ma gran parte della presenza o assenza di viticci può essere attribuito alla specific medi e protocollo utilizzato per questi test piastra sciame motilità. Qui includiamo i dettagli su come promuovere sciami-viticcio formatura per P. aeruginosa. Poiché P. aeruginosa è solo uno dei tanti batteri brulicanti, includiamo anche i dettagli per il nostro metodo di esaminare brulichio di Bacillus subtilis e volo a vela di Myxococcus Xanto. Come P. aeruginosa, ricerca attuale in B. subtilis e M. Xanto si estende su una vasta gamma di argomenti, come i ricercatori stanno lavorando a discernere gli aspetti della sporulazione, motilità, la risposta allo stress, e il comportamento di transizione 1,10. Vi è la necessità di quantificare gli schemi e le dinamiche del comportamento specifico (s) per queste cellule in gruppi che sciamano. Acquisizione dati motilità superficiale, analisi e interpretazione può essere ingombrante e qualitativa. Abbiamo sviluppato un protocollo per l&#39;analisi macroscopica dettagliata di sciami batteriche che fornisce oltre a sciamare zona morfologia e size (ad esempio, di diametro), informazioni dinamiche quantitative riguardanti tasso di espansione sciame e batterica o la densità di distribuzione bioproduct 7. Inoltre, questo metodo può usufruire di proteine ​​disponibili fluorescenti, luminescenza e coloranti per ottenere una visione completa delle interazioni batteriche 8, nonché per monitorare la sintesi di bioprodotti (ad esempio, P. aeruginosa rhamnolipid 7,8) all&#39;interno di uno sciame.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials table</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Amount</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagentsa:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAB Minimal Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A4418</td>
			<td>2 g</td>
			<td>Not used in P. aeruginosa tendril formation studies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td>9 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>3 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH8014</td>
			<td>3 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C79</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace metal solution (see below)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trace Metal Solution:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaSO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>255548</td>
			<td>200 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnSO4 x H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7634</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 x 5H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C493</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4750</td>
			<td>20 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6768</td>
			<td>10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaMoO4 x 2H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6646</td>
			<td>10 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A74</td>
			<td>5 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4 x 7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7002</td>
			<td>200 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTT Media:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0234</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td>0.1 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M65</td>
			<td>0.8 ml</td>
			<td>Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 &#956;m pore).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casitone</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>225930</td>
			<td>1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional Reagents:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Diagnostics</td>
			<td>240230</td>
			<td>2 % (wt/vol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media</td>
			<td>Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino acids (CAA)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>J851</td>
			<td>0.10 % (wt/vol)</td>
			<td>Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Noble</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5431</td>
			<td>0.45 % (wt/vol)</td>
			<td>Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Noble&#160;</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>10907</td>
			<td>1.50 % (wt/vol)</td>
			<td>Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar, Granulated</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423</td>
			<td>0.60 % (wt/vol)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Higgins Waterproof Black India Ink</td>
			<td>Higgins</td>
			<td>HIG44201</td>
			<td>0.50 % (vol/vol)</td>
			<td>Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO&#174; 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-11346</td>
			<td></td>
			<td>Use 4 &#956;l (for P. aeruginosa) or 8 &#181;l (for M. xanthus) of SYTO&#174; 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Relevant Materials and Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-326</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia.x H)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Vivo Xtream</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker MI software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays

Motilità superficie batterica, come sciamatura, è comunemente esaminato in laboratorio utilizzando saggi piastra che necessitano di specifiche concentrazioni di agar e talvolta inclusione di specifici nutrienti nel mezzo di crescita. La preparazione di tali mezzi espliciti e condizioni di crescita della superficie serve a fornire le condizioni favorevoli che permettano non solo la crescita batterica, ma la motilità coordinato di batteri su queste superfici all&#39;interno film liquidi sottili. Riproducibilità della piastra sciame e altri test piastra motilità superficie può essere una grande sfida. Soprattutto di più &quot;swarmers temperate&quot;, che mostrano la motilità solo all&#39;interno di intervalli di agar di 0,4% -0,8% (peso / volume), piccole modifiche nel protocollo o ambiente di laboratorio può influenzare notevolmente i risultati del test sciame. &quot;Bagnabilità&quot;, o contenuto di acqua all&#39;interfaccia liquido-solido-aria di questi saggi piastra, è spesso una variabile chiave da controllare. Una sfida ulteriore per valutare sciamatura è come quantificare odifferenze bserved tra due (o più) esperimenti. Qui abbiamo i dettagli di un protocollo a due fasi versatile per preparare e saggi immagine sciame. Includiamo linee guida per aggirare le sfide comunemente associati con test sciame preparazione di terreni e la quantificazione dei dati da questi test. Abbiamo specificamente Dimostriamo il nostro metodo con batteri che esprimono reporter genetici fluorescenti o bioluminescenti come il verde proteina fluorescente (GFP), luciferasi (lux operon), o macchie cellulari per consentire imaging ottico time-lapse. Dimostriamo ulteriormente la capacità del nostro metodo per tenere traccia competere specie sciamare nella stessa sperimentazione.

Variazione piastra preparazione può influenzare notevolmente brulicante motilità. L&#39;indurimento o essiccazione dopo versamento di agar fuso colpisce la sottile pellicola di liquido presente sulla superficie saggi di motilità e la motilità batterica nel tempo. Cambiamenti nella composizione nutrizionale influenzano anche sciamio per diversi batteri. La figura 1A mostra un effetto a breve termine del tempo di asciugatura su diffusione India inchiostro e diffusione di un inoculo iniziale di Bacillus subtilis 11. Figura 1B mostra l&#39;effetto del tempo di essiccazione e spettacoli Figura 1C gli effetti di solfato di ammonio [(NH 4) 2 SO 4] upon successivo sviluppo tendril di sciamio P. aeruginosa 5. Dati quantificabili possono essere ottenuti da immagini endpoint della motilità superficie utilizzando strategie di imaging più. La figura 2 mostra risultati rappresentativi della crescita della superficie per <em&gt; P. la sua immagine di fluorescenza GFP associata aeruginosa brulicante e; B. la sua immagine bioluminescenza associata subtilis swarming e; e la crescita della superficie Myxococcus Xanto e l&#39;immagine di fluorescenza rossa associata di SYTO cellule 64-macchiato. Espansione di acquisizione dati oltre la semplice ispezione e imaging risultati end-point consente lo studio del comportamento dinamico (s) per i batteri crescono superficiali. Figura 3 7 mostra un esempio di P. aeruginosa brulicante (ripreso per le cellule GFP esprimere), e la sua produzione rhamnolipid associato (ripreso con Nile Red macchia lipidi) viene visualizzato anche -la quantificazione dei dati di queste immagini per mostrare il tasso di espansione di P. aeruginosa brulicante. Video 1 mostra un time-lapse di B. subtilis sciamatura ripreso con luminescenza di un ceppo esprimente lux. Video 2 8 mostra un time-lapse di P. aeruginosa </em&gt; Typhimurium (verde-esprimono GFP) e Salmonella enterica sierotipo (rosso-esprimono lux) in un test di sciame competitivo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig1.jpg" /> Figura 1: Esempi di fattori in preparazione della superficie saggio motilità che influenzano il risultato del test Effetto di (A) Tempo di essiccazione su agar agar umidità superficiale e diffusione di inoculo per B.. subtilis (Ref 8), (B) tempo di essiccazione su agar P. aeruginosa brulicante (ristampato da Ref 5 con permesso), e (C) la presenza o l&#39;assenza di solfato di ammonio in P. aeruginosa swarming e la formazione viticcio. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig2.jpg" /> Figura 2: Alternative approcci per la crescita di superficie l&#39;imaging e la motilità dei batteri utilizzando una stazione di imaging Bruker. Side immagine lato di una telecamera (a sinistra) e da immagine Bruker (a destra) mostra (A) P. aeruginosa esprimono GFP-ripreso utilizzando le impostazioni Verde di fluorescenza, (B) B. subtilis esprimono lux bioluminescenza giornalista-ripreso utilizzando le impostazioni di luminescenza, e (C) M. xanthus colorati con SYTO 64 ripreso con impostazioni Red fluorescenza II. Vedere la Tabella 2 per l&#39;impostazione dettagli. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52338/52338fig3.jpg" /> Figura 3:. Analisi qualitativa e quantitativa di un saggio motilità superficiale (A) analisi time-lapse di distribuzione di densità delle cellule, la produzione rhamnolipid (lipidi macchia Nile Red ripreso utilizzando la fluorescenza rossaI impostazioni; barra della scala = 15 mm), e (B) quantificazione del tasso di espansione da immagini distribuzione densità cellulare di una P. aeruginosa sciame. (Ristampato dal rif 6 con permesso.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52338/52338vid1.mov" target="_blank">Video 1.</a> Time-lapse imaging di B. subtilis sciame. B. subtilis esprimendo lux e registrati utilizzando le impostazioni di luminescenza. Vedere la Tabella 2 per l&#39;impostazione dettagli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52338/52338vid2.mov" target="_blank">Video 2.</a> concorrenza Interspecie visualizzato dal time-lapse imaging. Sciami di P. aeruginosa (verde, esprimono GFP e registrati utilizzando le impostazioni verde fluorescenza) e S. enterica sierotipo Typhimurium (rosso; exprescantare lux e registrati utilizzando le impostazioni di luminescenza). Vedere la Tabella 2 per l&#39;impostazione dettagli. (Ristampa con il permesso di Rif. ​​7) <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> P. aeruginosa </td><td> P. aeruginosa studi di formazione viticcio </td><td> B. subtilis </td><td> M. Xanto </td></tr><tr><td> Brodo di coltura Pernottamento </td><td> FAB più 30 Glucosio mM </td><td> FAB più 30 Glucosio mM </td><td> LIBBRE </td><td> CTT </td></tr><tr><td> Brodo di cultura Pernottamento temperatura di incubazione </td><td> 37 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 30 ore a 30 ° C </td></tr><tr><td> Supporti Swarm </td><td> FAB </td><td> FAB meno (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 2% (peso / volume) LB </td><td> CTT </td></tr><tr><td>Supporti Swarm: componenti aggiuntivi </td><td> 12 mM glucosio a </td><td> 10% (peso / volume) CAA, 12 mm glucosio a </td><td> n / a </td><td> SYTO® 64 a </td></tr><tr><td> Tipo Agar </td><td> Agar, Nobile </td><td> Agar, Noble </td><td> Granulato agar </td><td> Agar, Noble Affymetrix </td></tr><tr><td> Concentrazione Agar (peso / volume) </td><td> 0,45% </td><td> 0,45% </td><td> 0,60% </td><td> All&#39;1,50% </td></tr><tr><td> Dimensioni piastra Swarm </td><td> 60 millimetri </td><td> 60 millimetri </td><td> 100 millimetri </td><td> 150 millimetri </td></tr><tr><td> Volume supporto per piastra </td><td> 7,5 ml </td><td> 7,5 ml </td><td> Versato a mano </td><td> Versato a mano </td></tr><tr><td> Impostazione del supporto Swarm / metodo di essiccazione </td><td> Hood; piastre scoperto </td><td> Hood; piastre scoperto </td><td> Da banco; piastre coperte </td><td> Da banco; piatti coperti </td></tr><tr><td> Impostazione mezzi Swarm / tempo di asciugatura </td><td> 30 min </td><td> 30 min </td><td> Overnight (20 -24 ore) </td><td> Overnight (20 -24 ore) </td></tr><tr><td> Swarm temperatura test di incubazione </td><td> 30 o 37 ° C </td><td> 30 ° C </td><td> 37 ° C </td><td> 30 ° C </td></tr><tr><td> Incubazione per l&#39;imaging lasso di tempo </td><td> 30 ° C per almeno 4 ore </td><td> 30 ° C per almeno 4 ore </td><td> 37 ° C per 2 ore </td><td> RT per 12 ore </td></tr><tr><td> Time-lapse di lunghezza di cattura </td><td> 24 ore </td><td> 24 ore </td><td> 10 hr </td><td> 66 hr </td></tr><tr><td> Impostazione Time-lapse </td><td> 1 frame / 10 min </td><td> 1 frame / 10 min </td><td> 1 frame / 6 min </td><td> 1 frame / 10 min </td></tr><tr><td colspan="3"> una aggiunti dopo la sterilizzazione in autoclave. </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Specifiche per superfici motilità Assay Preparazione Include superficiesaggio motilità specifiche di preparazione per P. aeruginosa, B. subtilis, e M. Xanto. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Segnale </td><td> Verde Fluorescence </td><td> Red fluorescenza I </td><td> Red fluorescenza II </td><td> Luminescence </td></tr><tr><td> Proteine ​​o dye </td><td> Verde Fluorescence Protein (GFP) </td><td> proteine ​​mCherry o macchia Nile Red rhamnolipid </td><td> SYTO® 64 </td><td> Luciferase da lux operon </td></tr><tr><td> Eccitazione (nm) </td><td> 480 ± 10 </td><td> 540 ± 10 </td><td> 590 ± 10 </td><td> Spento </td></tr><tr><td> Onda di emissione (NM) </td><td> 535 ± 17,5 </td><td> 600 ± 17,5 </td><td> 670 ± 17,5 </td><td> Nessun filtro </td></tr><tr><td> Tempo di esposizione (sec)</td><td> 30 </td><td> 60 </td><td> 60 </td><td> 240 </td></tr><tr><td> fermata f- </td><td> 4.0 </td><td> 4.0 </td><td> 2.5 </td><td> 1.1 </td></tr><tr><td> FOV (mm) </td><td> 190 </td><td> 190 </td><td> 140 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> Piano focale (mm) </td><td> 27.5 </td><td> 27.5 </td><td> 12.2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Categorizzazione (pixel) </td><td> Nessuno </td><td> 2 x 2 </td><td> Nessuno </td><td> 8 x 8 </td></tr></tbody></table> Tabella 2: Imaging Specifiche tecniche stazione di imaging Bruker per fluorescenza rossa e verde, e la luminescenza di imaging di crescita della superficie batterica..

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Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

Preparazione, Imaging, e la quantificazione di Surface batterica motilità Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

preparation-imaging-quantification-bacterial-surface-motility

Research

JoVE Journal

Biology

23.6K Views.  University of Notre Dame. Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques. 

Video: Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Ricerca

Biologia

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility in isolated segments of guinea pig distal colon. The complete system consists of a computer, video camera, illuminated organ bath, peristaltic and heated water bath circulating pumps, and custom GIMM software to record and analyze data. Compared with traditional methods of monitoring colonic peristalsis, the GIMM system allows for continuous, quantitative evaluation of motility. The guinea pig distal colon is bathed in warmed, oxygenated Krebs solution, and fecal pellets inserted in the oral end are propelled along the segment of colon at a rate of about 2 mm/sec. Movies of the fecal pellet proceeding along the segment are captured, and the GIMM software can be used track the progress of the fecal pellet. Rates of propulsive motility can be obtained for the entire segment or for any particular region of interest. In addition to analysis of bolus-induced motility patterns, spatiotemporal maps can be constructed from captured video segments to assess spontaneous motor activity patterns. Applications of this system include pharmacological evaluation of the effects of receptor agonists and antagonists on propulsive motility, as well as assessment of changes that result from pathophysiological conditions, such as inflammation or stress. The guinea pig distal colon propulsive motility assay, using the GIMM system, is straightforward and simple to learn, and it provides a reliable and reproducible method of assessing propulsive motility.

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Evaluation of colonic motility in the guinea pig distal colon with the Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM) is a straightforward and simple to learn approach to quantitatively evaluate propulsive motility in the gastrointestinal tract.

Monitor motilità gastrointestinale (Gimm)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ensuring cohesion within multicellular organisms. Proteins predicted to form extracellular interactions are encoded by approximately a quarter of human genes1, but despite their importance and abundance, the majority of these proteins have no documented binding partner. Primarily, this is due to their biochemical intractability: membrane-embedded proteins are difficult to solubilise in their native conformation and contain structurally-important posttranslational modifications. Also, the interaction affinities between receptor proteins are often characterised by extremely low interaction strengths (half-lives &lt; 1 second) precluding their detection with many commonly-used high throughput methods2. 
Here, we describe an assay, AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen) that overcomes these technical challenges enabling the detection of very weak protein interactions (t1/2 &le; 0.1 sec) with a low false positive rate3. The assay is usually implemented in a high throughput format to enable the systematic screening of many thousands of interactions in a convenient microtitre plate format (Fig. 1). It relies on the production of soluble recombinant protein libraries that contain the ectodomain fragments of cell surface receptors or secreted proteins within which to screen for interactions; therefore, this approach is suitable for type I, type II, GPI-linked cell surface receptors and secreted proteins but not for multipass membrane proteins such as ion channels or transporters.
The recombinant protein libraries are produced using a convenient and high-level mammalian expression system4, to ensure that important posttranslational modifications such as glycosylation and disulphide bonds are added. Expressed recombinant proteins are secreted into the medium and produced in two forms: a biotinylated bait which can be captured on a streptavidin-coated solid phase suitable for screening, and a pentamerised enzyme-tagged (&beta;-lactamase) prey. The bait and prey proteins are presented to each other in a binary fashion to detect direct interactions between them, similar to a conventional ELISA (Fig. 1). The pentamerisation of the proteins in the prey is achieved through a peptide sequence from the cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and increases the local concentration of the ectodomains thereby providing significant avidity gains to enable even very transient interactions to be detected. By normalising the activities of both the bait and prey to predetermined levels prior to screening, we have shown that interactions having monomeric half-lives of 0.1 sec can be detected with low false positive rates3.

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

AVEXIS is a high throughput protein interaction assay developed to systematically screen for novel extracellular receptor-ligand pairs involved in cellular recognition processes. It is specifically designed to detect transient protein interactions that are difficult to identify using other high throughput approaches.

Avidità-based Screening Interaction extracellulare (AVEXIS) per il rilevamento scalabile di bassa affinità extracellulare del recettore-ligando interazioni

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-risoluzione Imaging della Divisione Macchine batterica

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Semplice Lettura di massa di Digital acido nucleico quantificazione Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Dinamica di oligomerizzazione dei recettori delle superfici cellulari nelle cellule viventi mediante microscopia a fluorescenza totale di riflessione interna combinata con l'analisi del numero e della luminosità

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations of bacteria move over large distances in characteristic tendril-shaped communities over the course of hours. Swarming is sensitive to several factors including medium moisture, humidity, and nutrient content. In addition, the collective stress response, which is observed in P. aeruginosa that are stressed by antibiotics or bacteriophage (phage), repels swarms from approaching the area containing the stress. The methods described here address how to control the critical factors that affect swarming. We introduce a simple method to monitor swarming dynamics and the collective stress response with high temporal resolution using a flatbed document scanner, and describe how to compile and perform a quantitative analysis of swarms. This simple and cost-effective method provides precise and well-controlled quantification of swarming and may be extended to other types of plate-based growth assays and bacterial species.

We detail a simple method to produce high-resolution time-lapse movies of Pseudomonas aeruginosa swarms that respond to bacteriophage (phage) and antibiotic stress using a flatbed document scanner. This procedure is a fast and simple method for monitoring swarming dynamics and may be adapted to study the motility and growth of other bacterial species.

L'imaging time-lapse di sciami batterici e la risposta allo stress collettivo

Swarming is a form of surface motility observed in many bacterial species including Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Here, dense populations ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and cell debris, through bulk endocytosis. This pathway plays an essential role in a variety of cellular processes, including the regulation of immune responses and cancer cell metabolism. Given this importance in biological function, examining cell culture conditions can provide valuable information by identifying regulators of this pathway and optimizing conditions to be employed in the discovery of novel therapeutic approaches. The study describes an automated imaging and analysis technique using standard laboratory equipment and a cell imaging multi-mode plate reader for the rapid quantification of the macropinocytic index in adherent cells. The automated method is based on the uptake of high molecular weight fluorescent dextran and can be applied to 96-well microplates to facilitate assessments of multiple conditions in one experiment or fixed samples mounted onto glass coverslips. This approach is aimed at maximizing reproducibility and reducing experimental variation while being both time-saving and cost-effective.

Automated assays using multi-well microplates are advantageous approaches for identifying pathway regulators by allowing the assessment of a multitude of conditions in a single experiment. Here, we have adapted the well-established macropinosome imaging and quantification protocol to a 96-well microplate format and provide a comprehensive outline for automation using a multi-mode plate reader.

Imaging e analisi automatizzati per la quantificazione di macropinosomi marcati fluorescentemente

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Quantification of Interbacterial Competition using Single-Cell Fluorescence Imaging

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can be used to visualize and quantify competitive interactions between different bacterial strains at the single-cell level. The protocol described here provides methods for advanced approaches in slide preparation on both upright and inverted epifluorescence microscopes, live-cell and time-lapse imaging techniques, and quantitative image analysis using the open-source software FIJI. The approach in this manuscript outlines the quantification of competitive interactions between symbiotic Vibrio fischeri populations by measuring the change in area over time for two coincubated strains that are expressing different fluorescent proteins from stable plasmids. Alternative methods are described for optimizing this protocol in bacterial model systems that require different growth conditions. Although the assay described here uses conditions optimized for V. fischeri, this approach is highly reproducible and can easily be adapted to study competition among culturable isolates from diverse microbiomes.

This manuscript describes a method for using single-cell fluorescence microscopy to visualize and quantify bacterial competition in coculture.

Quantificazione della competizione interbatterica utilizzando l'imaging a fluorescenza a singola cellula

Interbacterial competition can directly impact the structure and function of microbiomes. This work describes a fluorescence microscopy approach that can ...

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or dissemination of many pathogenic species. Therefore, it is important to detect bacterial motility. Bacterial growth conditions, such as oxygen, pH, and temperature, can affect bacterial growth and the expression of bacterial flagella. This can lead to reduced motility or even loss of motility, resulting in the inaccurate evaluation of bacterial motility. Based on the color reaction of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC) by intracellular dehydrogenases of living bacteria, TTC was added to traditional semisolid agar for bacterial motility detection. The results showed that this TTC semisolid agar method for the detection of bacterial motility is simple, easy to operate, and does not involve large and expensive instruments. The results also showed that the highest motility was observed in semisolid medium prepared with 0.3% agar. Compared with the traditional semisolid medium, the results are easier to evaluate and more accurate.

Here, we present a protocol to detect bacterial motility based on a color reaction. Key advantages of this method are that it is easy to evaluate and more accurate, and does not require specialized equipment.

Visualizzazione della motilità batterica basata su una reazione cromatica

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...