Questo lavoro è stato sostenuto in parte dai National Institutes of Borse Salute AI067548 R01, R01 GM081520, GM086200 R01, R01 AI049194 e P01 GM066521 a GJJ così come l&#39;Howard Hughes Medical Institute, l&#39;Istituto Beckman al Caltech, e doni a Caltech dal Gordon and Betty Moore Foundation e Agouron Institute. MSL è supportato dal NIH concedere 2R37-A1041239-06A1 di Pamela S. Björkman. Leica Microsystems Inc. gentilmente messo a disposizione contenuti video della collezione cryosection. I risultati rappresentativi della presenza di Treponema primitia sono stati raccolti e trattati da Gavin E. Murphy, e pubblicato in Microbiologia molecolare con il titolo &quot;Novel ultrastrutture della presenza di Treponema primitia e delle loro implicazioni per la motilità&quot;. (Murphy, G. et al. Mol. Microbiol. 67, 1184-1195, 2008).

<ol>
	<li>Jensen, G. J., Briegel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+electron+cryotomography+is+opening+a+new+window+onto+prokaryotic+ultrastructure.">How electron cryotomography is opening a new window onto prokaryotic ultrastructure.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 17, 260-267 (2007).</li><li>Li, Z., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography:+a+new+view+into+microbial+ultrastructure.">Electron cryotomography: a new view into microbial ultrastructure.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 333-340 (2009).</li><li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+biological+complexity.">Three-dimensional imaging of biological complexity.</a> J. Struct. Biol. 138, 85-91 (2002).</li><li>Iancu, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography+sample+preparation+using+the+Vitrobot.">Electron cryotomography sample preparation using the Vitrobot.</a> Nat. Protocols. 1, 2813-2819 (2007).</li><li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing.">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J. Microsc. 203, 285-294 (2001).</li><li>Ladinsky, M. S., Pierson, J., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitreous+cryosectioning+of+cells,+facilitated+by+a+micromanipulator.">Vitreous cryosectioning of cells, facilitated by a micromanipulator.</a> J. Microsc. 224, 129-134 (2006).</li><li>Pierson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+technique+of+vitreous+cryo-sectioning+for+cryo-electron+tomography:+Electrostatic+charging+for+section+attachment+and+implementation+of+an+anti-contamination+glove+box.">Improving the technique of vitreous cryo-sectioning for cryo-electron tomography: Electrostatic charging for section attachment and implementation of an anti-contamination glove box.</a> J. Struct. Biol. 169, (2009).</li><li>Suloway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated,+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon.">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J. Struct. Biol. 167, 11-18 (2009).</li><li>Fernando, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markov+random+field+based+automatic+image+alignment+for+electron+tomography.">Markov random field based automatic image alignment for electron tomography.</a> J. Struct. Biol. 161, 260-275 (2008).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).</li><li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-axis+tomography:+an+approach+with+alignment+methods+that+preserve+resolution.">Dual-axis tomography: an approach with alignment methods that preserve resolution.</a> J. Struct. Biol. 120, 343-352 (1997).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Mostriamo in questo articolo video di come fare ECT di cellule batteriche. Limitato da spazio e tempo, mostriamo solo il protocollo generale. Maggiori dettagli possono essere trovati nei documenti, informazioni on-line o altre informazioni fornite dal produttori di apparecchiature e sviluppatori di software, e da gruppi di ricerca ECT. A seconda delle diverse specie batteriche studiate, le attrezzature utilizzate e l&#39;interesse nelle cellule, il protocollo ed i parametri sperimentali devono essere testati e ottimizzati.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Poly-L-Lysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>P8920</td>
<td>0.1% solution</td>
</tr>
<tr>
<td>MKIII Vitrobot</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FEI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gold colloid solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G1527-25ml</td>
<td>10 nm</td>
</tr>
<tr>
<td>Bovine serum Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P2489</td>
<td>10%</td>
</tr>
<tr>
<td>Nr 1 Filter paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>1001 055</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextran</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>31389</td>
<td>15-25%, MW 39000</td>
</tr>
<tr>
<td>Brass-domed planchet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Swiss Precision Company</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bal-Tec HPm 010 high pressure freezer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cryo-ultra microtome UC6/FC6</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica Microsystems Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Diamond cryo trim 45</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diatome US Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Static line II ioniser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diatome US Inc</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CX100 Dry shipper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Taylor-Wharton-Cryogenics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MSH loading station</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gatan</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ti E/B inverted microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom</td>
</tr>
<tr>
<td>Cryo LM stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FEI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom</td>
</tr>
<tr>
<td>TF30-polara</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>FEI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>With UltraCam from Gatan</td>
</tr>
<tr>
<td>Amira</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Visage Imaging</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

electron cryotomography of bacterial cells

Mentre molto è già noto circa il metabolismo di base delle cellule batteriche, molte questioni fondamentali sono ancora senza risposta sorprendentemente, tra cui per esempio il modo in cui generare e mantenere forme cella specifica, stabilire la polarità, segregare i loro genomi, e dividere. Per capire questi fenomeni, sono necessarie tecnologie di imaging che colmare il divario risoluzione tra luce e microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione metodi come la cristallografia a raggi X e spettroscopia NMR. Electron cryotomography (ECT) è una tecnologia emergente che fa proprio questo, che consente l&#39;ultrastruttura delle cellule da visualizzare in un quasi-stato nativo, in tre dimensioni (3D), con risoluzione &quot;macromolecolari&quot; (~ 4 Nm). 1, 2 In ECT, le cellule vengono esposte in un vitreo, stato &quot;congelato-idratata&quot; in un microscopio elettronico a trasmissione crio (cryoTEM) a bassa temperatura (&lt;-180 ° C). Per le celle sottili (fino a ~ 500 nm di spessore 3), le cellule sono intatte tuffo congelati all&#39;interno dei media di tutto EM griglie in criogeni come etano o etano / propano miscele. Cellule più spesse e biofilm può anche essere ripreso in uno stato vetroso in primo luogo &quot;ad alta pressione congelamento&quot; e poi, &quot;crio-sezionamento&quot; loro. Una serie di immagini bidimensionali proiezione vengono poi raccolti attraverso il campione in modo incrementale in quanto è inclinato lungo uno o due assi. Una ricostruzione tridimensionale, o &quot;tomogramma&quot; può essere calcolata dalle immagini. Mentre ECT richiede una strumentazione costosa, negli ultimi anni, è stato utilizzato in un paio di laboratori per scoprire le strutture delle varie appendici esterne, le strutture di buste cellulari diversi, le posizioni e le strutture di filamenti del citoscheletro, e le posizioni e le architetture dei grandi macromolecolari assemblee come motori flagellare, scomparti interni e array chemiorecettori. 1, 2 In questo articolo video che illustra come celle di immagine con ECT, compresi i processi di preparazione del campione, raccolta dei dati, la ricostruzione tomogramma, e l&#39;interpretazione dei risultati attraverso la segmentazione e in alcuni casi di correlazione con il microscopio ottico.

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Electron Cryotomography of Bacterial Cells

Illustriamo qui come utilizzare elettroni cryotomography (ECT) per studiare l&#39;ultrastruttura delle cellule batteriche in quasi native stati, a &quot;macromolecolari&quot; (~ 4 nm) risoluzione.

Cryotomography elettrone di cellule batteriche

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

electron-cryotomography-of-bacterial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

25.2K Views.  California Institute of Technology - Caltech. Illustriamo qui come utilizzare elettroni cryotomography (ECT) per studiare l'ultrastruttura delle cellule batteriche in quasi native stati, a "macromolecolari" (~ 4 nm) risoluzione.