Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Silvia B Campos-Bilderback e George J. Rhodes per il completamento di interventi chirurgici che coinvolgono il posizionamento di linee di accesso venoso. Si vorrebbe anche ringraziare Sara E Wean per mantenere le colonie Monaco-Wistar comprendenti sia Simonsen e ceppi Frömter.

1. Coniugazione di Rat albumina sierica di solfo-rodamina 101 Sulfonyl Cloruro (Texas Red) <ol><li> Sciogliere 100 mg di albumina sierica Rat (RSA) in 6,667 ml di 100 mM Sodio bicarbonato pH 9,0; concentrazione finale di 15 mg / ml in un tubo da 50 ml conica. </li><li> Soluzione luogo in bicchieri di ghiaccio / acqua e raffreddare a tra 0-4 ° C. </li><li> Aggiungere 200 ml di dimetilformammide anidra di alta qualità (DMF) per una fiala 10 mg di Texas Red Sulfonyl Cloruro (TRSC); vortice sul medio per 15 sec. </li><li> Soluzione Vortex RSA sul medio e aggiungere il TRSC sciolto. </li><li> Wrap 50 ml conica in lamina (Parafilm può essere utilizzato per assicurare una tenuta stagna è formata), posto in orizzontale w / ice solo e luogo il rocker ad agitare lentamente soluzione (evitare la formazione di bolle) nel secchio di ghiaccio, permettono la reazione di continuare a 0 a 4 ° C per 1 ora. </li><li> Fai 5 L di soluzione salina allo 0,9%, e bagnare un peso molecolare 50 kDa tagliato fuori da camera, che può essere sia una) membrana di dialisi con clip, b) ditubi ALISI come in un float-a-lizzatore, oppure c) cassette slide-a-lizzatore (tutti adatti per la rimozione TRSC non coniugata). </li><li> Posto miscela di reazione nella camera di dialisi e posto nel contenitore 5 L w / soluzione salina 0,9%, dializza notte a 4 ° C con una leggera agitazione mediante un agitatore. </li><li> Cambiare la soluzione di dialisi 5 L in mattinata e nel tardo pomeriggio, fino a quando una notte i risultati di incubazione in praticamente nessun cambiamento di colore (Questo richiede in genere ~ 48 ore con almeno 4 scambi). Ulteriormente, con il MWCO di 50 kDa essere così vicino al MW di RSA, 66kDa, è possibile mai produrre una soluzione limpida; questo sarà dipendente dalla distribuzione delle dimensioni dei pori della membrana; 60 hr e 5 scambi è tempo più che sufficiente. </li><li> Volume di misura e dividere il peso iniziale di 100 mg per il volume ad una concentrazione approssimativa di TR-RSA; variano tipicamente concentrazioni 10-13 mg / ml. Il colorante finale: rapporto albumina dovrebbe essere ~ 4:1, 1 fluoroforo per 15,000 Daltons di proteine ​​MW. Conservare a 4 ° C; MAI congelare la soluzione TR-RSA, come risultanti frammentazione che potrebbe verificarsi altererà i valori di permeabilità. </li></ol> 2. Preparazione del microscopio invertito fase di imaging / Microscopio Impostazioni <ol><li> Posto ~ 4-7 pezzi di nastro autoclave (circa ¾ &quot;lungo) perfettamente impilati uno sopra l&#39;altro in un piatto di 50 mm con un fondo coprioggetto 40 millimetri (coprioggetto piatto inferiore). Questi dovrebbero essere messi più vicino ad uno dei bordi in modo che la bordo del nastro farà contatto con il bordo di curvatura del rene ma non bloccare il percorso della luce oggettiva (Figure 1A e 1B); ratti più grandi richiedono più spazio tra il nastro e il bordo del piatto. </li><li> Mettere 2 Repti-therm pad vicino al palco a fianco del piatto di 50 mm (Figura 1A). Mettere una coperta d&#39;acqua giacca riscaldamento sopra il palco. </li><li> Massimizzare l&#39;efficienza nella raccolta immagini, assicurando la torretta obiettivo ha un 10x di aria oR 20x (immersione con aria o acqua) obiettivo e un obiettivo ad immersione in acqua alimentato superiore a raccogliere le immagini per la quantificazione. </li><li> Durante l&#39;imaging il modo più efficiente di aggiungere acqua agli obiettivi è per ruotarli al lato e aggiungere acqua utilizzando una siringa da 1 cc con un lungo pezzo di tubo in PE-200 che può raggiungere la cima degli obiettivi. </li><li> Impostare l&#39;intensità di eccitazione del laser 10watt a ~ 15-20% usando i filtri a densità neutra sul software. Il gallio-arseniuro di fosfuro fotorilevatori non descanned sono impostati a 750 per raccogliere le emissioni di verde e 625 per raccogliere le emissioni rossi. Blue emissione (come il nucleare macchia Hoechst 33342) vengono raccolte utilizzando un rivelatore multialkaline nondescanned standard con una impostazione tra 750-800. </li><li> Per garantire la corretta riscossione delle emissioni a bassa intensità all&#39;interno dello spazio di Bowman, assicurarsi che i limiti inferiori di rivelatori sono tarati in modo da non escludere questi valori. Marcatori di avvertimento visivi indicheranno se la sensibilitàregolazione bassa e questi valori vengono date un valore di intensità pari a zero. </li><li> Caricare una siringa da 1 cc con ~ 5-8 mg di soluzione di albumina fluorescente diluito con 0,9% soluzione salina sterile per portare il volume totale a 1 cc. </li></ol> 3. L&#39;esposizione del rene in un Munich Wistar Rat per intravitale 2-Photon Imaging <ol><li> Inizia con un topo pre-anestetizzato con Pentabarbitol (50 mg / ml soluzione, μl/100 120 g di peso corporeo), Inactin (130 mg / ml soluzione, μ/100 120 g di peso corporeo), o isofluorano (5% induzione, 1,5 al 2,5% di manutenzione), una linea di accesso venoso a permanenza (sia venoso giugulare o femorale), e il fianco sinistro rasate da appena sotto la gabbia toracica appena sopra la coscia sinistra. </li><li> Posizionare il topo piatta sul lato destro in modo che la sinistra, lato rasato è rivolto verso l&#39;alto, assicurarsi che sia in piano sul tavolo, con la sua postura allungata e non rannicchiato, con le zampe anteriori che si toccano e posteriore zampe che si toccano (Figura 2A). </li&gt; <li> Molto palpare delicatamente per sentire il rene per determinare dove si stabilisce naturalmente all&#39;interno del retroperitoneo e disegnare una linea retta parallela al corpo (dalla cassa toracica a coscia) utilizzando un pennarello (Figura 2A). </li><li> Sollevare la pelle con un paio di pinze dentate, e pizzicare la pelle lungo la linea tracciata con un paio di pinze emostatiche per schiacciare i tessuti e prevenire le emorragie. Tagliare lungo l&#39;incisione utilizzando un paio di forbici chirurgiche. Schiacciare la pelle esterna e gli strati muscolari prima del taglio sarà drasticamente ridurre ed eliminare il sanguinamento in genere. </li><li> Ripetere questa procedura per lo strato muscolare esterno, che è sottile. </li><li> Per l&#39;incisione nello strato muscolare interno, che espone il peritoneo, ri-palpare il rene per stimare dimensioni. Pizzicare una linea di incisione più piccola del rene, assicurando l&#39;incisione è appena oltre il rene. E &#39;meglio per rendere questa incisione troppo piccolo e rendere più grande se necessario. Se questo è fatto troppo grande, la sutura sarà richiesto.Questa ultima incisione è fondamentale; troppo oltre in qualsiasi direzione influenzerà la stabilità sul palco e indurre sia gli artefatti da movimento di respirazione (best case scenario) oppure si allungherà la perfusione renale peduncolo e negativamente ridurre renale (worst case scenario). </li><li> Individuare il rene (come mostrato in Figura 2B) e l&#39;impugnatura grasso circostante usando pinze, lavorando verso il polo inferiore del rene in una mano sopra mano moda. </li><li> Una volta raggiunto il polo inferiore del rene, tirare delicatamente il rene attraverso l&#39;incisione, mentre molto delicatamente stringendo sotto il rene per esteriorizzare. Se l&#39;incisione è troppo piccolo, schiacciare lo strato muscolare e tagliare ampliarlo; ripetere la procedura per esteriorizzarmi rene. </li></ol> 4. Posizionamento del Munich Wistar Ratto sullo stage per l&#39;imaging <ol><li> Collocare il rene verso il bordo del piatto coprioggetto con il rene leggermente ruotato verso il dorsale (lato posteriore) della ratto così la faccia ventrale del rene is prendere contatto con il piatto inferiore coprioggetto (Figura 1A). Aggiungi una riscaldata, soluzione fisiologica sterile 09.% Al piatto. </li><li> Guardare attraverso l&#39;obiettivo 10x o 20x e verificare la presenza di movimento. Se viene rilevato un movimento, rotolare il topo sopra un po &#39;in modo che il torace è più lontano dal piatto fondo vetrino; assicurarsi che il rene è il più vicino al bordo del piatto senza allungare il peduncolo renale (Figura 1B). </li></ol> 5. Acquisizione di immagini per quantificare permeabilità renale di albumina <ol><li> Calcolo della permeabilità glomerulare (Glomeruluar setaccio coefficiente; GSC) di qualsiasi macromolecola richiede assunzione di riferimento immagini dei singoli glomeruli fondo prima dell&#39;infusione della molecola fluorescente. Se il microscopio è dotato di uno stadio motorizzato capace di posizioni di marcatura, trovare e Centro singoli glomeruli con l&#39;obiettivo di bassa potenza e contrassegnare ogni posizione. Un doppio passaggio fluoresceina / Rodamina epifluorescenza filter è l&#39;ideale per questa procedura, anche se uno dei due filtri emissione funzionerà (contrasto di fase o di altre fonti non fluorescenza di illuminazione non funziona). Glomeruli apparirà come strutture circolari vuote circondate da tubuli prossimali hanno un autoflourescence giallo-arancio inerente se visto attraverso il filtro a doppio passaggio. </li><li> Se il microscopio non ha uno stadio motorizzato, eseguire la scansione del rene in un modello raster, con l&#39;obiettivo a basso e fare una rudimentale mappa di dove si trovano i glomeruli individuale, basandosi su punti di riferimento naturali come i grandi vasi sanguigni superficiali situati sopra la capsula renale o macchie di grasso. </li><li> Passare la torretta alla potenza obiettivo ad immersione d&#39;acqua superiore e prendere set di dati 3D di ogni glomeruli assicurandosi che le anse capillari e lo spazio di Bowman sono chiaramente visibili. Utilizzando una tavolozza pseudocolore (qualcosa di diverso da B / N) vi aiuterà a visualizzare queste strutture. </li><li> Concentrandosi su un vaso sanguigno superficiale lentamente infondere in tegli fluorescente albumina fare il tempo che è dato per consentire la distribuzione sistemica. Per molecole con bassa GSC è essenziale per massimizzare i valori di intensità nel plasma ma non raggiungere livelli che satura il fotorivelatori nel microscopio. Questo aumenta la rilevabilità di molecole filtrate. Nota: di solito c&#39;è un 5-7 sec intervallo tra il momento della fluorescenza albumina viene introdotto al tempo che viene visualizzato sullo schermo (l&#39;acquisizione di immagini complete a ~ 1 frame / secondo). </li><li> Attendere circa 10 minuti per consentire eventuali piccoli frammenti di peso molecolare per chiarire prima di acquisire volumi 3D ad intervalli di 1 micron per essere utilizzate nel calcolo GSC albumina. In genere, la deformazione del Simonsen di Monaco ratti Wistar ha molti meno glomeruli di superficie, in modo tutto ciò che può essere visualizzato vengono esposte e quantificato. Il ceppo Frömter ha un numero di gran lunga maggiore in modo da limitare il numero quantificato a ~ 10. </li><li> Alla fine dello studio il ratto è eutanasia tramite un sovradosaggio di anesteticiic utilizzato nello studio. Un doppio pneumothoracotamy viene eseguita per assicurare eutanasia. </li></ol> 6. Calcolo GSC per fluorescente albumina da volumi 3D <ol><li> Utilizzando il software di elaborazione delle immagini Metamorph caricare i set di dati 3D per ogni glomeruli, sia lo sfondo set e set presa dopo l&#39;infusione della fluorescenza albumina. </li><li> Nel volume contenente il fluorescente albumina individuare un ciclo capillare superficiale con abbastanza spazio libero spazio tra i margini definiti e il bordo della capsula di Bowman. </li><li> Nel volume sfondo localizzare sullo stesso piano focale, che dovrebbe contenere tutte le indicazioni visive dell&#39;immagine contenente albumina. Seleziona una regione all&#39;interno del ciclo capillare di interesse e annotare la lettura media intensità. Quindi selezionare una regione all&#39;interno dello spazio di Bowman e annotare il valore medio di intensità. Questi saranno utilizzati come valori di fondo. </li><li> Per la quantificazione, selezionare la regione di simile nello spazio di Bowman nel albumina cimmagine ontaining. Fate questo per almeno altre due regioni a prendere un valore medio per l&#39;intensità media all&#39;interno dello spazio di Bowman. </li><li> Selezionare il ciclo capillare con l&#39;intensità di plasma luminoso e disegnare una regione intorno ad esso. Avanti con la funzione soglia, evidenziare i valori luminosi all&#39;interno del plasma circolante, evitando le striature scure che circolano RBC. Notare i valori medi di intensità dello spazio plasma selezionato. E &#39;importante selezionare preferenzialmente le aree luminose di plasma perché fattori all&#39;interno del sangue serviranno solo a provocare e sottostima dei livelli plasmatici di fluorescenza. </li><li> Utilizzando un foglio elettronico Microsoft Excel immettere i valori per calcolare il GSC dove: </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" />

<ol>
	<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells;+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states.">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504 (2007).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).</li><li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats.">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).</li><li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides,+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat:+Effects+of+molecular+size+and+conformation.">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy.">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy.">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I passaggi evidenziati qui rappresentano ciò che sentiamo di essere quelli che producono valori di permeabilità coerenti e precise, perché aggirano i seguenti problemi: <ol><li> Scattering: L&#39;uso di un rosso fluorofori che emettono permetterebbe una maggiore efficienza di raccolta della luce dal più fotoni di lunghezza d&#39;onda sono meno inclini a disperdersi. Utilizzando sia fluorofori che emettono verdi o blu introdurrà maggiore variazione in GSC della causa della maggiore variabilità nei valori di int...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope</td>
 <td>Olympus America</td>
 <td></td>
 <td>Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td>
 <td>Spectra-Physics</td>
 <td></td>
 <td>Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallium arsenide phosphide photodetectors</td>
 <td>Hamamatsu Corp</td>
 <td></td>
 <td>Note: Front or Side mounted configurations available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metamorph Image processing Software</td>
 <td>Molecular Dynamics</td>
 <td></td>
 <td>Note: Version 6.1r1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsoft Excel</td>
 <td>Microsoft Corportation</td>
 <td></td>
 <td>2007 version</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Handling Forceps</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78266-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mayo Dissecting Scissors</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72962</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78180-1C3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72930</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Jacket Blanket + Heating Pad</td>
 <td>Gaymar</td>
 <td></td>
 <td>T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repti-Therm Under Tank Heater</td>
 <td>ZooMed</td>
 <td></td>
 <td>RH-4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Texas Red Sulfonyl Chloride</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>Cat# T-353</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat Serum Albumin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# A-6272</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Quality Anhydrous DMF</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# 270547</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>Cat# 11-889-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 70665-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats

Malattie renali con perdita urinaria di grandi macromolecole essenziali, quali albumina sierica, sono stati a lungo pensato per essere causato da alterazioni nella permeabilità della barriera composto podociti, cellule endoteliali vascolari, e una membrana basale lavorano all&#39;unisono. I dati ottenuti nel nostro laboratorio utilizzando intravital microscopia a 2 fotoni rivelato una più permeabile barriera di filtrazione glomerulare (ULA) di quanto si pensasse in condizioni fisiologiche, con il recupero di filtrato albumina che si verificano in un sottoinsieme precoce di cellule chiamate cellule del tubulo prossimale (PTC) 1,2, 3. Tecniche precedenti usate per studiare filtrazione renale e stabilendo la caratteristica della barriera di filtrazione coinvolto micropuntura del lume di questi segmenti tubolari primi con campionamento del fluido contenuto e analisi 4. Questi studi determinata concentrazione di albumina nel fluido luminale essere praticamente inesistenti; corrispondente strettamentea quanto normalmente rilevata nelle urine. Tuttavia, la caratterizzazione dei polimeri di destrano con dimensioni definite da questa tecnica ha rivelato quelle di dimensioni simili all&#39;albumina sierica avevano livelli più elevati nel lume tubulare e nelle urine; suggerendo un aumento della permeabilità 5. Qui è una descrizione dettagliata della tecnica utilizzata per visualizzare direttamente e quantificare glomerulare fluorescente permeabilità albumina in vivo. Questo metodo permette di individuare filtrata albumina attraverso la barriera di filtrazione nello spazio di Bowman (la camera iniziale di filtrazione urinaria), e permette anche la quantificazione di albumina riassorbimento dai tubuli prossimali e visualizzazione di successiva transcitosi albumina 6. L&#39;assenza di fluorescenza lungo albumina successivi segmenti tubolari in rotta alla vescica evidenzia l&#39;efficienza del percorso di recupero nei segmenti tubulo prossimale precedenza. Inoltre, quando è stata applicata questa tecnica per determinare la permeabilitàdi destrani aventi dimensioni simili a valori di permeabilità praticamente identiche albumina sono stati segnalati 2. Queste osservazioni supportano direttamente la necessità di ampliare l&#39;attenzione di molte malattie renali proteinuriche ai inclusi alterazioni delle cellule del tubulo prossimale bonifica.

La figura 3 mostra un esempio di immagine presa da un glomerulo superficie di un Munich Wistar Frömter ratto e le misure adottate per determinare la permeabilità di albumina fluorescente. Il valore GSC per l&#39;albumina di 0,0111 derivato per questo autunno glomerulo individuo all&#39;interno del campo visto in questo ceppo di Monaco ratti Wistar quando nella condizione alimentato 3. La stabilità visto in queste immagini è dovuta alla accurata progettazione e l&#39;esecuzione di istruzio...

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Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Una tecnica che utilizza alta risoluzione intavital microscopia a 2 fotoni di visualizzare direttamente e quantificare filtrazione gloemrular in glomeruli superficie. Questo metodo consente la determinazione diretta di caratteristiche di permeabilità di macromolecole in stati sia normali e malati.

Quantificare permeabilità glomerulare delle Macromolecole fluorescenti usando la microscopia a due fotoni a Monaco di Baviera ratti Wistar

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

quantifying-glomerular-permeability-fluorescent-macromolecules-using

Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K Views.  Indiana University School of Medicine. Una tecnica che utilizza alta risoluzione intavital microscopia a 2 fotoni di visualizzare direttamente e quantificare filtrazione gloemrular in glomeruli superficie. Questo metodo consente la determinazione diretta di caratteristiche di permeabilità di macromolecole in stati sia normali e malati.

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Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

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Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

Videomicroscopia microscopia del sistema vascolare del tumore-associati utilizzando avanzate dorsale dello Skinfold finestra Chambers su topi transgenici fluorescenti

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

Un metodo per la quantificazione degli arti superiori performance nella vita quotidiana che utilizzano accelerometri

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this patient group but has yet to be confirmed. This protocol describes a method of in vivo evaluation of neural changes especially well suitable for cranial nerve analysis using magnetic resonance imaging (MRI). MD-patients and normal hearing persons were examined in a 3-T MR-scanner using a scan protocol including strongly T2-weighted 3D gradient-echo-sequence (3D-CISS). In the patient group, MD was additionally confirmed using MRI-based assessment of endolymphatic hydrops. Morphometric analysis was performed using a freeware DICOM viewer. Evaluation of cranial nerves included measurements of cross-sectional areas (CSAs) of the nerves at different levels as well as orthogonal diametric measurements.

&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&amp;#232;re&#039;s Disease Ears and Normal Hearing Ears

To evaluate morphological changes of cranial nerves such as loss of neural structures or swelling of cranial nerves in Meni&#232;re&#39;s Disease (MD) or in healthy persons in vivo, a protocol of evaluation has been developed using magnetic resonance imaging (MRI). Additional MRI-based confirmation of MD was performed.

In Vivo Analisi morfometrica dei nervi cranici umano usando la formazione immagine a risonanza magnetica in orecchie di malattia di Menière e orecchie udito normale

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

Valutazione della funzione del rene in modelli murini di malattia glomerulare

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdermico misurazione del tasso di filtrazione glomerulare in topi

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the glomerulus and reabsorbed in the tubular system up until the absorption limit is reached. Early increases in pathological albumin filtration may, thus, be missed by analyzing albuminuria. Therefore, the use of tracers to test glomerular permselectivity appears advantageous. Fluorescently labeled tracer fluorescein isothiocyanate (FITC)-polysucrose (i.e., FITC-Ficoll), can be used to study glomerular permselectivity. FITC-polysucrose molecules are freely filtered by the glomerulus but not reabsorbed in the tubular system. In mice and rats, FITC-polysucrose has been investigated in models of glomerular permeability by using technically complex procedures (i.e., radioactive measurements, high-performance liquid chromatography [HPLC], gel filtration). We have modified and facilitated a FITC-polysucrose tracer-based protocol to test early and small increases in glomerular permeability to FITC-polysucrose 70 (size of albumin) in mice. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes (5 &#181;L). This protocol contains information on how the tracer FITC-polysucrose 70 is applied intravenously and urine is collected via a simple urinary catheter. Urine is analyzed via a fluorescence plate reader and normalized to a urine concentration marker (creatinine), thereby avoiding technically complex procedures.

Here, we present a protocol to test glomerular permeability in mice using a highly sensitive, nonradioactive tracer. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes.

Misurazione altamente sensibile della permeabilità glomerare nei topi con Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero, imaging confocale e ricostruzione 3D del nodo senoatriale e atrioventricolare nel topo

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Isolamento e coltura di macrofagi cardiaci residenti dal nodo senoatriale e atrioventricolare murino

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ineffective in many patients. To improve patient care, novel and innovative therapeutic concepts causally targeting arrhythmia mechanisms are needed. To study the complex pathophysiology of arrhythmias, suitable animal models are necessary, and mice have been proven to be ideal model species to evaluate the genetic impact on arrhythmias, to investigate fundamental molecular and cellular mechanisms, and to identify potential therapeutic targets.
Implantable telemetry devices are among the most powerful tools available to study electrophysiology in mice, allowing continuous ECG recording over a period of several months in freely moving, awake mice. However, due to the huge number of data points (&gt;1 million QRS complexes per day), analysis of telemetry data remains challenging. This article describes a step-by-step approach to analyze ECGs and to detect arrhythmias in long-term telemetry recordings using the software, Ponemah, with its analysis modules, ECG Pro and Data Insights, developed by Data Sciences International (DSI). To analyze basic ECG parameters, such as heart rate, P wave duration, PR interval, QRS interval, or QT duration, an automated attribute analysis was performed using Ponemah to identify P, Q, and T waves within individually adjusted windows around detected R waves. 
Results were then manually reviewed, allowing adjustment of individual annotations. The output from the attribute-based analysis and the pattern recognition analysis was then used by the Data Insights module to detect arrhythmias. This module allows an automatic screening for individually defined arrhythmias within the recording, followed by a manual review of suspected arrhythmia episodes. The article briefly discusses challenges in recording and detecting ECG signals, suggests strategies to improve data quality, and provides representative recordings of arrhythmias detected in mice using the approach described above.

Here we present a step-by-step protocol for a semiautomated approach to analyze murine long-term electrocardiography (ECG) data for basic ECG parameters and common arrhythmias. Data are obtained by implantable telemetry transmitters in living and awake mice and analyzed using Ponemah and its analysis modules.

Analisi delle registrazioni elettrocardiografiche a lungo termine per rilevare le aritmie nei topi

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...