Oggi, disporremo la tecnica della misurazione transdermica della filtrazione glomerulare o tGFR nei topi. Ci sono una serie di caratteristiche di questo metodo che penso valga la pena menzionare. Prima di tutto, attualmente il tGFR è il modo più accurato per valutare la funzione renale nei topi.
In secondo luogo, il tGFR viene eseguito in topi coscienti e liberamente in movimento in modo da evitare le complicazioni dell'anestesia. In terzo luogo, una volta padroneggiata la tecnica, è ragionevole essere in grado di eseguire misurazioni da 30 a 40 tGFR in un solo giorno. Infine, le misurazioni tGFR possono essere eseguite ripetutamente in un topo in vitro.
Ciò significa che possiamo eseguire misurazioni seriali della funzione renale in contesti di malattia acuta e cronica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente ai ricercatori di misurare il tasso di filtrazione glomerulare o GFR in topi coscienti e liberamente in movimento con alta precisione e sensibilità. Uno o due giorni prima della misurazione del tGFR, dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedino, posizionare un mouse anestetizzato nella posizione prona su un riscaldatore.
Utilizzando un rasoio elettrico, tagliare contro la direzione di crescita per rimuovere la maggior parte della pelliccia da un lato della schiena del mouse dalla parte superiore delle zampe posteriori fino al collo e attraverso le costole. Utilizzare un cotton fioc per applicare un sottile strato di crema di depilazione sulla pelle esposta contro la direzione della crescita per garantire che la crema sia applicata il più vicino possibile alla pelle e rimuovere la crema dopo uno o tre minuti con tamponi di cotone puliti e acqua tiepida. Il giorno della procedura, tagliare un cerotto adesivo di sei per tre centimetri delle dimensioni del dispositivo GFR prima di staccare la parte posteriore del cerotto e attaccare il dispositivo al lato adesivo del cerotto con i diodi emettitori di luce posizionati immediatamente sopra la finestra chiara.
Quindi attaccare un piccolo pezzo del cerotto alla batteria. Per fissare il monitor, con il mouse anestetizzato in posizione prona, pulire la pelle pre-rasata con il 70% di etanolo e regolare la larghezza di un pezzo di nastro di circa 12 centimetri strapparla longitudinalmente. Posizionare il nastro sotto il mouse con due centimetri su un lato dell'animale ripiegato su un bordo del lato destro del nastro per un facile posizionamento e rimozione dopo la misurazione.
Quindi, collegare la batteria al dispositivo, rimuovendo il supporto dalla batteria e posizionando saldamente la batteria sul dispositivo. Il dispositivo è pronto all'uso e l'acquisizione dei dati inizia quando i LED blu iniziano a lampeggiare. Rimuovere il supporto dalla patch sul dispositivo e posizionare il dispositivo sulla pelle rasata in modo che la finestra che espone i LED si trova sopra le nervature che fissano il lato destro del dispositivo con nastro adesivo.
È importante garantire un fissaggio sicuro del dispositivo senza limitare la mobilità del mouse o esercitare troppa pressione sulla pelle. Quindi avvolgere saldamente il lato sinistro del nastro attorno al mouse e al dispositivo. Consentire al dispositivo di registrare una lettura costante dello sfondo per tre minuti.
Nel frattempo, riscaldare la coda con un cuscinetto per la testa e caricare una siringa per insulina con il volume sperimentale appropriato di FITC-sinistrin per l'iniezione arrotondata ai 10 microlitri più vicini. Somministrare il FITC-sinistrin per via endovenosa in un bolo liscio ma rapido. È importante che l'utente sia a proprio agio con le iniezioni di IV in quanto è necessario somministrare con successo il FITC-sinistrin in un bolo piuttosto che su diversi tentativi che si tradurranno in più picchi nella curva di gioco.
Per misurare il tGFR, posizionare il mouse nella propria gabbia con il monitoraggio fino alla piena rimiccanza e consentire la registrazione dello spazio FITC-sinistrino per 1,5 ore. Alla fine del periodo di misurazione, posizionare il mouse sulla griglia sopra la gabbia e consentire al mouse di afferrare le barre metalliche, estrarre il nastro da sotto la pancia in un rapido movimento liscio. Quindi rimuovere qualsiasi nastro dal dispositivo e dal cerotto dalla pelle facendo attenzione che la batteria non si disconnetta dal dispositivo e restituisca il mouse alla sua gabbia.
Per valutare i dati, scollegare attentamente la batteria e utilizzare un cavo USB per collegare il dispositivo al computer. Aprire il software di lettura e fare clic su Connetti, Leggi, Rinomina e Salva. Quindi chiudere il programma ed elaborare e valutare i dati nel software di analisi secondo le istruzioni del produttore.
Mentre fitc-sinistrin viene rapidamente cancellata dalla circolazione nei topi sani, questa clearance è drammaticamente ritardata nei topi con lesione renale acuta. Nei topi con lesioni renali acute molto gravi, può esserci pochissima o nessuna clearance della fluorescenza FITC-sinistrina durante l'intero periodo di misurazione di 90 minuti che indica una completa assenza di filtrazione glomerulare. La misurazione del GFR transdermico è minimamente invasiva e quindi può essere utilizzata per monitorare i cambiamenti nella funzione renale nei singoli animali in più punti di tempo.
In effetti, in questo esperimento rappresentativo, le misurazioni sequenziali hanno dimostrato cambiamenti nella funzione renale a zero, uno, due e quattro giorni dopo la lesione da riperfusione dell'ischemia. In questo modello di malattia renale cronica del topo, la relazione inversa dell'emidità FITC-sinistrina con il GFR può essere direttamente correlata alla funzione renale compromessa osservata in questi animali. In effetti, l'emiprotezione FITC-sinistrina è strettamente correlata alla valutazione istologica semi-quantitativa della lesione tubolare su tutta la gamma di misurazioni del GFR nei topi illesi e nei topi con diverse gravità di lesione reperfusionale indotta da lesioni da ischemia.
Al contrario, la creatinina sierica e l'azoto dell'urea nel sangue dimostrano una correlazione positiva ma più debole con la clearance FITC-sinistrina che indica che le misurazioni del GFR transcutaneo forniscono una misura più affidabile della lesione renale rispetto alla creatinina sierica o all'azoto urea nel sangue. La misurazione transdermica del GFR è una misura più sensibile della funzione renale rispetto ai biomarcatori tradizionali come la creatinina e il BUN. Ciò fornisce una valutazione più accurata dell'efficacia delle nuove terapie per le malattie renali nella ricerca preclinica.
I passaggi più critici di questo metodo sono il corretto attaccamento del dispositivo alla schiena del mouse e la corretta somministrazione IV di FITC-sinistrin. Questi passaggi sono essenziali per ottenere una valutazione accurata del GFR nei topi.
