Ringrazio il Dott. Jessica Dominguez Rieg per la lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association (Scientist Development Grant 10SDG2610034), un Carl W. Gottschalk Research Grant della Società Americana di Nefrologia, l&#39;Istituto Nazionale del Diabete e Malattie Digestive e Renali O&#39;Brien Centro di danno renale acuto di ricerca ( P30DK079337), e il Department of Veterans Affairs.

1. Soluzioni <ol><li> 0,85% NaCl: 8,5 g NaCl / 1 l DDH 2 O (8,5 g / L). </li><li> 0,5 mol / L HEPES pH 7,4 (sciogliere 59,6 g di HEPES a 0,5 L di DDH 2 0 e regolare il pH a 7,4 con NaOH 10 N). </li></ol> 2. Preparazione di FITC-inulina Injection Solution <ol><li> Pesare FITC-inulina per preparare una soluzione al 5% e sciogliere in NaCl 0,85% (generalmente 100 mg / 2 ml 0,85% NaCl) mediante riscaldamento a 90 ° C fino a completa dissoluzione. </li><li> Pesare disciolto soluzione FITC-inulina e peso nota. </li><li> Tagliare un pezzo di 20 centimetri di membrane per dialisi (peso molecolare di cut-off: 1.000) e mettere in DDH 2 O per 30 minuti per rimuovere residui di NaN 3 dalla membrana e lavare un paio di volte dopo. </li><li> Riempire disciolto FITC-inulina in membrana di dialisi e sigillare correttamente con chiusure. </li><li> Pesare tutta la membrana di dialisi. </li><li> Mettere la membrana di dialisi in 1 L soluzione 0,85% di NaCl e mescolare lentamente luce-protetto per 24 ore a rotemperatura om. </li><li> Pesare nuovamente tutta la membrana di dialisi e calcolare la nuova concentrazione (acqua si sposta osmoticamente nella membrana e non legati FITC, o legati FITC-inulina &lt;1,000 peso molecolare si sposterà all&#39;esterno della membrana, quindi, la concentrazione di FITC-inulina diminuirà sostanzialmente) . </li><li> La nuova concentrazione FITC-inulina (c) è calcolato utilizzando la seguente formula: C = n / V, dove n = quantità iniziale di FITC-inulina, V = volume nuovo (differenza di peso del tubo di dialisi, prima e dopo la dialisi più un volume iniziale di soluzione FITC-inulina). </li><li> Prima dell&#39;uso sterilizzare dializzato soluzione FITC-inulina per filtrazione con un filtro a siringa da 0,22 micron. </li><li> Tenere FITC-inulina riparo dalla luce (foglio di alluminio) a 4 ° C. Dializzato e sterilizzata FITC-inulina può essere utilizzato per un massimo di 2 settimane. Partecipato FITC-inulina può essere sciolto da ri-riscaldamento a 90 ° C per alcuni minuti. </li></ol> Nota: se si utilizzaFITC-sinistrin 16-18, che non richiede la dialisi, tutte le fasi necessarie per la dialisi possono essere saltati. 3. Iniezione e prelievo di sangue <ol><li> Prendere peso corporeo (pc) dei topi prima dell&#39;esperimento. </li><li> Anestetizzare topi brevemente con isoflurano. </li><li> Ad alta velocità di 6 topi si prega di seguire il protocollo previsto in Figura 3. </li><li> Iniettare 2 ml / g di peso corporeo del dializzato FITC-inulina nella retroorbital plesso 24 utilizzando un G30 ½ a spillo (rimuovere le bolle d&#39;aria da 100 l siringa Hamilton da prima utilizzando un G26 ½ in ago e poi passare a un G30 ½ in ago per iniezione). </li><li> Tagliare 1 mm coda di topo con le forbici volta e raccogliere il sangue a 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 e 75 minuti dopo l&#39;iniezione in Na-eparina minicapillaries. Seal minicapillaries dopo la raccolta del sangue con Cha-sigillo. </li><li> Conservare i campioni al riparo dalla luce. </li><li> Mettere sigillato minicapillaries all&#39;interno hematocrit capillari e centrifugare per 5 min. </li><li> Rompere minicapillaries utilizzando un tagliatore di diamanti e il trasferimento dell&#39;intera plasma pipettando in una provetta da 0,2 ml. </li><li> Effettuare una diluizione 1:10 utilizzando 2 ml di plasma e 18 microlitri 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4) in una nuova provetta 0,2 ml (campioni potrebbero essere memorizzati notte a 4 ° C per misure di fluorescenza). </li><li> Misura 2 ml di campione diluito con NanoDrop 3300 a duplicati. La descrizione e l&#39;utilizzo dello strumento è descritto qui 5. </li></ol> 4. Elaborazione di norme <ol><li> Raccogliere il sangue da topi dello stesso ceppo di fondo rivestito in eparina ematocrito capillari, spin down e diluire 1:10 con 0.5 mol / L HEPES (pH 7,4), di solito 80 ml di plasma + 720 HEPES microlitri. </li><li> Diluire soluzione iniettabile FITC-inulina con il plasma del mouse diluito per ottenere le seguenti diluizioni standard: 1:10: 10 microlitri diluito soluzione FITC-inulina + 90 microlitri di plasma topo diluito 1:100: 10 &amp; mu, L (1,10) soluzione + 90 ml di plasma topo diluito 1:1.000: 10 microlitri (1:100) soluzione + 90 ml di plasma topo diluito 1:2.000: 30 microlitri (1:1) soluzione + 30 ml di plasma topo diluito 1:10.000: 10 ml (1,5) soluzione + 40 ml di plasma topo diluito 1:20.000: 20 l (1:1) soluzione + 20 ml di plasma topo diluito 1:100.000: 10 ml (1,5) soluzione + 40 ml di plasma topo diluito La concentrazione degli standard dipenderà dalla dialisi e sarà sempre diverso per ogni preparazione di FITC-inulina. È necessario inserire la concentrazione per la curva standard nuovo ogni volta. </li><li> Analizzare i dati per calcolare GFR con il software appropriato (per esempio Prism GraphPad) utilizzando una funzione di decadimento esponenziale a due fasi, come descritto in qui 15, 20 e mostrato nella sezione Risultati Rappresentante. </li></ol>

<ol>
	<li>Bauer, J. H., Brooks, C. S., Burch, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+appraisal+of+creatinine+clearance+as+a+measurement+of+glomerular+filtration+rate.">Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate.</a> Am. J. Kidney Dis. 2 (3), 337-346 (1982).</li><li>Carrie, B. J., Golbetz, H. V., Michaels, A. S., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatinine:+an+inadequate+filtration+marker+in+glomerular+diseases.">Creatinine: an inadequate filtration marker in glomerular diseases.</a> Am. J. Med. 69 (2), 177-182 (1980).</li><li>Chasis, H., Ranges, H. A., Goldring, W., Smith, H. 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D., Sharma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+endogenous+creatinine+clearance+as+a+measure+of+renal+function+in+mice.">Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice.</a> Kidney Int. 65 (5), 1959-1967 (2004).</li><li>Eisner, C., Faulhaber-Walter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Major+contribution+of+tubular+secretion+to+creatinine+clearance+in+mice.">Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice.</a> Kidney Int. 77 (6), 519-526 (2010).</li><li>Faulhaber-Walter, R., Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+A1+adenosine+receptors+augments+diabetic+hyperfiltration+and+glomerular+injury.">Lack of A1 adenosine receptors augments diabetic hyperfiltration and glomerular injury.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 19 (4), 722-730 (2008).</li><li>FINGL, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+excretion+of+creatinine+in+the+rat.">Tubular excretion of creatinine in the rat.</a> Am. J. Physiol. 169 (2), 357-362 (1952).</li><li>Keppler, A., Gretz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+creatinine+determination+in+mice+and+rats:+an+enzymatic+method+compares+favorably+with+a+high-performance+liquid+chromatography+assay.">Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay.</a> Kidney Int. 71 (1), 74-78 (2007).</li><li>Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+creatinine+and+renal+function.">Serum creatinine and renal function.</a> Annu. Rev. Med. 39, 465-490 (1988).</li><li>Lorenz, J. N., Gruenstein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+nonradioactive+method+for+evaluating+single-nephron+filtration+rate+using+FITC-inulin.">A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin.</a> Am. J. Physiol. 276, 172-177 (1999).</li><li>Meyer, M. H., Meyer, R. A., Gray, R. W., Irwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picric+acid+methods+greatly+overestimate+serum+creatinine+in+mice:+more+accurate+results+with+high-performance+liquid+chromatography.">Picric acid methods greatly overestimate serum creatinine in mice: more accurate results with high-performance liquid chromatography.</a> Anal. Biochem. 144 (1), 285-290 (1985).</li><li>Qi, Z., Breyer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice.">Measurement of glomerular filtration rate in conscious mice.</a> Methods Mol. Biol. 466, 61-72 (2009).</li><li>Qi, Z., Whitt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance.">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286 (3), F590-F596 (2004).</li><li>Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+glomerular+filtration+rate+using+FITC-sinistrin+in+rats.">Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats.</a> Nephrol. Dial Transplant. 24 (10), 2997-3001 (2009).</li><li>Schock-Kusch, D., Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+assessment+of+renal+function+in+conscious+rats+with+a+device+for+measuring+FITC-sinistrin+disappearance+curves.">Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves.</a> Kidney Int. 79 (11), 1254-1258 (2011).</li><li>Schreiber, A., Shulhevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+conscious+mice.">Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 303 (5), F783-F788 (2012).</li><li>Shemesh, O., Golbetz, H., Kriss, J. P., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+creatinine+as+a+filtration+marker+in+glomerulopathic+patients.">Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients.</a> Kidney Int. 28 (5), 830-838 (1985).</li><li>Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+glomerular+filtration+rate+by+single-bolus+inulin:+a+comparison+of+estimation+analyses.">Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses.</a> J. Appl. Physiol. 84 (6), 2154-2162 (1998).</li><li>Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+[corrected]+type+1+diabetes+mellitus:+a+tubulo-centric+view.">Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 14 (2), 530-537 (2003).</li><li>Vallon, V., Eraly, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+organic+anion+transporter+OAT3+in+renal+creatinine+secretion+in+mice.">A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302 (10), F1293-F1299 (2012).</li><li>Vallon, V., Schroth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+A(1)+receptors+determine+glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+streptozotocin+diabetes+mellitus.">Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus.</a> Nephron. Physiol. 111 (1), 30-38 (2009).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim. (NY. 40 (5), 155-160 (2011).</li></ol>

L&#39;autore ha ricevuto finanziamenti per coprire i costi di questa pubblicazione da Thermo Fisher Scientific.

Il presente studio descrive una tecnica per la determinazione di GFR nei topi coscienti mediante iniezione a singolo bolo e l&#39;analisi di fluorescenza a 8 campioni di sangue da due fasi di decadimento esponenziale. Una misura GFR in 1 mouse prende 75 min. Utilizzando uno speciale diagramma di flusso, è possibile misurare la GFR di 6 topi in 130 min. È possibile ripetere questo protocollo flow-chart fino a 4 volte al giorno e misurare GFR in 24 topi. Abbiamo modificato il metodo in modo che sia possibile raccogliere sangue da un piccolo elemento di cattura coda anziché coda puntura venosa, che è più veloce e più facile per gli investigatori di eseguire rispetto a coda vena puntura. Utilizzando 10 microlitri ematocrito capillari e una diluizione 1:10, è possibile ridurre la quantità totale di sangue necessario per &lt;100 microlitri. Infine, la fluorescenza viene misurata utilizzando un NanoDrop 3300 fluorospectrometer, che permette la determinazione della fluorescenza in 1-2 ml di campione diluito. Questo metodo darà il investigato interessatora vero valore GFR. Al contrario, i livelli di creatinina nel topo hanno diversi punti deboli, tra cui &quot;Campo cieco creatinina&quot; e difficoltà legate alla determinazione specifica e sensibile. Il &quot;range cieco creatinina&quot; limita la sua funzione come marker per GFR perché creatinina sierica rimane nel range normale fino il 50% della funzione renale è perduto 19. Dal momento che molti ricercatori utilizzano topi geneticamente modificati nella loro ricerca per studiare la fisiologia e la fisiopatologia renale, questo porta il seguente problema: ipotizzando un topo knockout del gene X avrebbe un GFR notevolmente inferiore (del 40%) rispetto a un topo wild-type, una screening semplice confrontando creatininemia non rileva questa differenza. La necessità di un buon metodo di determinazione accurata GFR diventa più critica più piccole le differenze di GFR diventano. I topi hanno alte concentrazioni di chromagens non creatinina nel plasma e nelle urine che interferiscono con il commerciodisponibili saggi creatinina. Come conseguenza, saggi basati sulla picrato alcalino Jaffé reazione sovrastima concentrazione di creatinina nel plasma confrontati con cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) determinazione 6, 13. Un&#39;altra limitazione è che la creatinina sierica è al di sotto dei limiti di rilevazione di vari saggi disponibili in commercio rispetto alla determinazione HPLC. Tuttavia, utilizzando reazioni enzimatiche ricercatori potevano determinare plasmatica di creatinina nel topo 10, 22. GFR in un range simili sono stati trovati in topi coscienti usando un metodo di iniezione a singolo bolo comparabili nonché urinario gioco FITC-inulina 14. In contrasto con il loro protocollo, il nostro protocollo utilizzando la coda snip non richiede particolari precauzioni per preservare l&#39;integrità del vaso rispetto a vena della coda o di puntura della vena safena. Per la clearance urinaria / plasma basato FITC-inulina è necessario impiantare chirurgicamente due mi osmoticanipumps. Due pompe sono necessarie per raggiungere lo steady-state le concentrazioni di FITC-inulina abbastanza alto, che sono chiaramente distinguibili dallo sfondo. Questo richiede anche l&#39;uso di gabbie metaboliche per una completa raccolta dell&#39;urina e temporizzato. Le gabbie devono essere sciacquati per tenere conto di una perdita del 25-37% di FITC-inulina, che altrimenti si verifica senza risciacquo. Le insidie ​​di utilizzo di questo metodo FITC-inulina sono limitati. Gli investigatori dovrebbero essere a conoscenza di quanto segue: (i) assicurare che non vi siano bolle d&#39;aria nella siringa utilizzata per l&#39;iniezione del FITC-soluzione, (ii) la completa iniezione retrobulbare deve essere raggiunto, perché la quantità iniettata determina la GFR calcolata, e ( iii) topi molto probabilmente urinare durante l&#39;esperimento GFR 75 min, quindi evitare di contaminare campioni di sangue con l&#39;urina, che avrà una concentrazione molto elevata FITC-inulina come conseguenza della capacità di concentrazione reni. Vantaggi generali of questo metodo FITC-inulina sono i seguenti: (i) è una tecnica non radioattivi, (ii) è possibile ripetere le misurazioni più volte nella stessa topo, (iii) l&#39;analisi può essere eseguita in topi coscienti, ( iv) nessuna raccolta dell&#39;urina è richiesto, e (v) un&#39;opzione alto-rendimento può essere utilizzato. Svantaggi per l&#39;iniezione in bolo singolo includono la necessità di dialisi di FITC-inulina, che può essere superato utilizzando una migliore FITC-marcatore, coniugati con sinistrin, che è già disponibile e può essere misurato transcutanea mediante uno speciale dispositivo miniaturizzato 18. Anche se GFR è misurata, non è possibile misurare escrezioni frazionarie di fluido o ioni con questo metodo. Nel loro insieme, questo metodo fornisce la fattibilità di un metodo ad alta velocità per la misura di GFR in topi coscienti. Così, questa tecnica potrebbe essere di interesse per altri ricercatori che sono interessati nel determinare la funzione renale nei topi.

La velocità di formazione del plasmatico a livello glomerulare è diventata la base per valutare la funzionalità renale (velocità di filtrazione glomerulare, GFR). Il marcatore ideale per determinare la velocità di filtrazione glomerulare deve essere filtrata liberamente, né secreta o riassorbita e non metabolizzato. Tale comportamento è stato trovato per essere vero per inulina, e la clearance inulina è diventata un gold standard per la determinazione del GFR 3. Considerando che la clearance della creatinina è ampiamente utilizzato come misura del GFR in esseri umani e gli animali, la creatinina non soddisfa i requisiti di un marcatore ideale GFR. Circa il 10 - 40% della clearance della creatinina nell&#39;uomo è la conseguenza della secrezione tubulare attiva 1, 11, e la secrezione renale della creatinina è anche importante nel topo e nel ratto 4, 7, 9, 22. La disfunzione renale è noto per aumentare la secrezione tubulare di creatinina che limita il suo valore come marker di GFR 1, 2. Abbiamo precedentemente dimostrato che il trasportatore anionico organico isoforma3 (OAT3) contribuisce a murino secrezione di creatinina renale 22. Tuttavia, la clearance inulina in genere richiede l&#39;uso di radioattivo marcato inulina (3 H o 14 C). La determinazione radioattiva di inulina può essere utilizzato sia in topi anestetizzati e cosciente, ma ospita gli svantaggi dei numerosi severe norme di sicurezza e maneggiata inerenti all&#39;uso di isotopi radioattivi. Lungo queste linee, preparazioni di liquidazione chirurgici per la determinazione di GFR stanno consumando tempo così come terminale in natura. Nel 1999 Lorenz et al. 12 introdotto FITC-inulina come marcatore di singolo nefrone GFR in topi anestetizzati. Cinque anni più tardi Qi et al. Determinato 15 intero rene GFR in topi coscienti utilizzando FITC-inulina. Protocolli alternativi sono ora utilizzando FITC-inulina come marker esogeno per misurare GFR in topi coscienti e anestetizzato. Questi protocolli mantengono la sensibilità di inulina radioattivo utilizzando fluorescenza detectisu e aggirare gli svantaggi di lavorare con un marcatore radioattivo marcato. Il saggio di FITC-inulina è stata modificata da altri 7, 8 e noi 22, 23 per sfruttare la capacità microvolumi della NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Ciò consente di ridurre il volume del campione totale necessario per &lt;100 microlitri di sangue per misurazione GFR. Con il metodo di protocollo e di alta velocità offerto in questa pubblicazione, abbiamo dimostrato la fattibilità della misura GFR in un massimo di 24 topi coscienti al giorno. Questa tecnica potrebbe essere utile ad altri ricercatori che studiano murino GFR e speriamo che andrà a sostituire i metodi meno accurati come indici di funzione renale, come la creatinina e azoto ureico nel sangue.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-inulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7706</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Webster Veterinary</td>
			<td>78366551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (MWCO 1000)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132636</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane closure</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132736</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 &mu;l Hematocrit capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>22362566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocrit centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Micro-MB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l Na+-Heparin minicaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9000210</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (100 &mu;l)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80601</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorospectrometer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 3300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &mu;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>880-26464-UE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealant</td>
			<td>Ch&acirc;-seal</td>
			<td>510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (G26 &frac12; and G30 &frac12;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305111 &amp; 305106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice

La misurazione della velocità di filtrazione glomerulare (GFR) è il gold standard nella valutazione della funzione renale. Attualmente, gli investigatori determinano GFR misurando il livello di creatinina endogena o esogena biomarker applicata radioattivo etichettata inulina (3 H o 14 C). La creatinina ha lo svantaggio sostanziale che prossimali conti secrezione tubulare per ~ 50% del totale della creatinina escrezione renale e quindi la creatinina non è un indicatore affidabile GFR. A seconda del esperimento condotto, la clearance inulina può essere determinato da una singola iniezione di bolo o infusione endovenosa continua (minipump endovenosa o osmotica). Entrambi gli approcci richiedono la raccolta di plasma o plasma e urine, rispettivamente. Altri inconvenienti di inulina radioattivo etichettata comprendono l&#39;utilizzo di isotopi, richiede tempo preparazione chirurgica degli animali, e l&#39;esigenza di un esperimento terminale. Qui si descrive un metodo che utilizza un singolo bolo difluoresceina isotiocianato (FITC) inulina etichettati e la misurazione della sua fluorescenza in 1-2 ml di plasma diluito. Applicando un modello a due compartimenti, con 8 raccolte sangue per topo, è possibile misurare in GFR fino a 24 topi per giorno utilizzando un protocollo flusso di lavoro speciale. Questo metodo richiede solo breve anestesia isoflurano con tutti i campioni di sangue viene raccolto in un mouse non-sobrio e sveglio. Un altro vantaggio è che è possibile seguire i mouse su un periodo di diversi mesi e trattamenti (ad esempio facendo esperimenti in coppia con cambiamenti nella dieta o applicazioni di droga). Ci auguriamo che questa tecnica di misurazione GFR è utile per altri ricercatori che studiano la funzione renale del mouse e sostituirà i metodi meno accurati di stimare la funzione renale, come la creatinina plasmatica e di azoto ureico nel sangue.

GFR viene calcolato con la seguente formula: GFR = n / (A/K1 + B/K2), dove n = quantità iniettata (n = c • V, dove c = concentrazione FITC-inulina, V = volume iniettato) A = Span1, intercetta y di eliminazione K1 = costante di eliminazione decadimento B = Span2, y-intercetta di distribuzione K2 = costante di decadimento per la distribuzione Nota: A, K1, K2 e B sono abbreviazioni date da GraphPad Prism, ogni software in grado di analizzare in due fasi di decadimento esponenziale può essere utilizzato, tuttavia, un altro software scientifico potrebbe utilizzare diverse sigle. Impiegando un bifase esponenziale della curva di decadimento, che si basa su concentrazioni plasmatiche di FITC-inulina, una curva simile a quella mostrata in figura 1 dovrebbe essere ottenuto. Calcolo GFR dalla formula mostrato sopra (e come descritto in qui &lt;sup&gt; 20) permette di rilevare compromissione della funzione renale o 15 glomerulare iperfiltrazione 8, 23 come si trova nei topi con diabete mellito tipo 1 (Figura 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig1.jpg" /> Figura 1. Per misurare il GFR in topi coscienti, cinetica plasmatica di FITC-inulina a seguito di una iniezione endovenosa singola dose viene utilizzato. Per il calcolo del GFR, un modello a due compartimenti è impiegato. Nel modello a due compartimenti, la fase di decadimento rapido iniziale rappresenta la ridistribuzione di FITC-inulina dal compartimento intravascolare al fluido extracellulare. La fase successiva, con lento decadimento della concentrazione FITC-inulina, riflette prevalentemente clearance sistemica dal plasma. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig2.jpg" /> Figura 2. Detection di iperfiltrazione diabetica in topi wild-type. tipo I diabete mellito è stata indotta dalla somministrazione intraperitoneale di streptozotocina (STZ, 50 mg / kg per 5 giorni consecutivi). GFR è stato determinato prima (basale) e 5 settimane dopo l&#39;induzione del diabete. Grazie al feedback tubuloglomerular, un aumento primario nel riassorbimento prossimale provoca presto iperfiltrazione diabetico 21 una constatazione che è riproducibile in topi wild-type (n = 10, p &lt;0.01 vs basale stesso mouse). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig3.jpg"/> Figura 3. Flow-chart per la misura del GFR in un set di 6 topi. Per misurare l&#39;intero rene GFR con il metodo di iniezione in bolo singolo, 8 campioni di sangue devono essere raccolti nei 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 e 75 minuti dopo iniezione FITC-inulina. I numeri indicano i punti di tempo. I numeri tra parentesi indicano il numero del campione. Punti temporali sinistra della linea rossa verticale indicano iniezionepunti temporali (a 0, 11, 22, 33, 44 e 55 min). Ogni mouse è contrassegnato da un colore diverso. Per ottenere raccolte di sangue sequenziali seguire le frecce. Caselle grigie indicano quando il prossimo mouse deve essere preparata per l&#39;anestesia isoflurano prima dell&#39;iniezione. Utilizzando questo protocollo il tempo minimo tra due collezioni di sangue da diverse topi è di 1 min.

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A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

Misurazione della velocità di filtrazione glomerulare (GFR) è il gold standard per la valutazione della funzione renale. Qui si descrive un metodo ad alta produttività che permette la determinazione di GFR nei topi coscienti utilizzando una singola iniezione in bolo, determinazione della fluoresceina isotiocianato (FITC)-inulina nel plasma e calcolo di GFR da un modello di decadimento esponenziale a due fasi.

Un metodo ad alta velocità per la misura della velocità di filtrazione glomerulare in topi coscienti

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

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Research

JoVE Journal

Biology

43.1K Views.  University of California, San Diego. Misurazione della velocità di filtrazione glomerulare (GFR) è il gold standard per la valutazione della funzione renale. Qui si descrive un metodo ad alta produttività che permette la determinazione di GFR nei topi coscienti utilizzando una singola iniezione in bolo, determinazione della fluoresceina isotiocianato (FITC)-inulina nel plasma e calcolo di GFR da un modello di decadimento esponenziale a due fasi.

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A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Un high-throughput metodo per studiare la morfologia globale organello in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Ricerca

Biologia

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

A High-Throughput Metodo per la crioconservazione dello sperma e Zebrafish In Vitro Fecondazione

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

High-Throughput misurazione e classificazione di P organici in campioni ambientali

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Un metodo per la Crescita Arabidopsis E piante di pomodoro in piastre con 96 pozzetti di High-Throughput Genotipizzazione

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Misurazione del tasso metabolico in<em&gt; Drosophila</em&gt; Utilizzando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Fisiologia Lab Dimostrazione: filtrazione glomerulare in un ratto

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate- + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3- + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.

Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.

Misura e Analisi di extracellulare Acido prodotte per determinare glicolitica Tasso

Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both ...

Methods Article

Un metodo ad alta velocità per la misura della velocità di filtrazione glomerulare in topi coscienti