Questa ricerca è stata sostenuta da fondi del clima Yale e Energy Institute e la National Science Foundation.

1. Grasshoppers allevamento sotto stress e le condizioni di stress gratis <ol><li> Con 0,5 m 2 circolare, mesocosmi chiusi per prevenire l&#39;emigrazione o immigrazione di specie animali (Figura 1). Costruire mesocosmi con 2,4 m di lunghezza di 1,5 m di altezza da ¼ &quot;in alluminio recinzione in rete come un ponteggio. Coprire la scherma con 2,5 m lunghezza 1,75 screening di alluminio finestra alta m ripiegato sopra la parte superiore e inferiore della scherma e pinzati insieme lungo piega. Unisciti alla scherma finisce per formare un cerchio chiuso e quindi il fiocco finestra sovrapposta di screening insieme per creare un sigillo. Impostare il mesocosmo nel terreno nel campo scavando a 10 cm di profondità di 4 cm larghezza trincea intorno alla base del mesocosom, affondare il mesocosmo in la trincea e poi pesta la zolla della trincea intorno il ribassamento del mesocosmo. Staple un pezzo circolare di screening finestra nella parte superiore del mesocosmo. </li><li> Mesocosmi Array in un replicato designazione abbinato sperimentalen nel campo. Località Plot dovrebbe essere selezionati per abbinare l&#39;identità delle specie vegetali e relativa copertura vegetale. Lavello gabbie 10 centimetri nel terreno nel sito di trama. </li><li> Utilizzando una rete di sweep, la raccolta precoce (2 °) instar ninfe cavalletta e immagazzinarli nei mesocosmi a densità dei campi naturali. </li><li> Utilizzando una rete di sweep, catturare individui di una dominante sit-and-wait caccia (non web tessitura) ragno specie predatrici. Incollare chiuse la cheliceri ragno (apparato boccale utilizzati per sottomettere prede) con rapida essiccazione cemento agli effetti del rischio disaccoppiati dalla selezione sopravvivenza reale favorendo cavallette individuali con migliori capacità di eludere predazione ragno. Immagazzinare i ragni a densità di campo a uno mesocosmo di ciascuna coppia. Questo sarà il trattamento stress. Mesocosmi senza ragni sarà il trattamento senza stress. </li><li> Lasciare ninfe cavalletta di sviluppare al fine (4 ° e 5 °) Ciclo di instar. Raccogliere tutti gli individui dalle gabbie e randomly assegnare gli individui da ogni gabbia a uno dei tre gruppi di analisi successive: (1) la convalida dello stato di stress fisiologico, (2) la convalida di spostamento stechiometria corpo elementare, (3) decomposizione microbica. </li></ol> 2. Convalida Grasshopper stress Stato <ol><li> Misurare cavalletta standard di tasso metabolico (SMR), in quanto il tasso di emissione di biossido di carbonio ( <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> ) In un flusso continuo incurrent sistema respirometria con una portata d&#39;aria di 200 ml / min. Eliminare l&#39;acqua in vapore facendo passare l&#39;aria che scorre, attraverso essiccante. </li><li> A seguito di privazione di cibo per 16 ore (l&#39;acqua deve essere disponibile), pesare cavallette individuali (± 0,1 mg), e metterli in trasparente 50 ml (9,2 cm L x 2,0 cm P) respirometro camere e permettere loro di recuperare da gestire per almeno 10 min prima di iniziare le misurazioni. </li><li> In media costante tem<html> temperatura (temperatura ± 1% Variazione errore standard) all&#39;interno della camera respirometro, analizzare l&#39;aria respirata utilizzando raggi infrarossi analizzatore di CO2 (ad esempio Qubit S151-risoluzione di 1 ppm). Misurare la media minima allo stato stazionario <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> per 10 min. </li><li> L&#39;analizzatore dispone di CO 2 concentrazione frazionale (parti per milione), ma SMR deve essere riportato come un tasso, per cui bisogna trasformare le registrazioni da <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq1highres.jpg"/> FR = i ( <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> - <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq3.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq3highres.jpg"/> ) / {1 - <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> [1 - (1/RQ)]}, doveiles/ftp_upload/50061/50061eq3.jpg &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50061/50061eq3highres.jpg &quot;/&gt; = concentrazione incurrent frazionario di CO 2; <img src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2.jpg" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061eq2highres.jpg"/> = Concentrazione excurrent frazionata di CO 2; FR = portata (ml min -1); RQ = quoziente respiratorio, assunto pari a 0.85 in animali erbivori. </li></ol> 3. Spostamento Convalida in Stechiometria Corpo Elementale <ol><li> Valutare carbonio: azoto (C: N) contenuto di un campione di cavallette raccolti dai mesocosmi campo. </li><li> Ridurre la variazione di C: N a causa di consumo di alimenti recente rimuovendo contenuto intestinale cavalletta sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Liofilizzare l&#39;intestino vuoto e il corpo per 48 ore e poi macinare la carcassa individuale e intestino a una polvere omogenea. </li><li> Misura C: N contenuto della polvere utilizzando un autoanalizzatore CNH. </li></ol> 4.Decomposizione microbica <ol><li> Luogo replicato coppie di collari in PVC (15,4 cm dia., Inserito ~ 4 cm al suolo) nel sito di campo (Figura 3C). Rimuovere tutta la vegetazione al loro interno tramite ritaglio sulla superficie del suolo. Questi collari sono utilizzati per misure di decomposizione. Inoltre, definire una serie di collari in PVC attraverso il sito campo di agire come 13 C naturale abbondanza di controllo (vedi sotto), a cui si aggiungono né cavallette né erba lettiera. </li><li> Per un collare in ogni coppia aggiungere 2 intatti, liofilizzati carcasse di cavallette (registrare la biomassa aggiunto) allevati con il rischio di predatore come sopra descritto utilizzando field-gabbie. Per il collare altro in ogni coppia aggiungere 2 intatte liofilizzati carcasse allevati senza rischi predatore. </li><li> Coprire i collari in PVC con uno schermo per impedire la rimozione cavalletta da spazzini delle trame e lasciare che le carcasse cavalletta decomporsi per 40 giorni. </li><li> Mentre le carcasse sono in decomposizione, etichetta erba-litter con 13 C. <ol><li> Costruire una camera di plexiglass trasparente (60 cm x 60 cm x 1,5 m) con un ingresso e valvola di scarico (Figura 3B). </li><li> Lavello un quadrato di 60 cm x 60 centimetri telaio in legno con una guarnizione di gomma rivestito con grasso al silicone 5 centimetri nel terreno (Figura 3B). </li><li> Far scorrere la camera sulla parte superiore del telaio di legno in modo che la camera diventa sigillata dalla gomma (Figura 3B). </li><li> Collegare gli ingressi delle camere per bombole di gas compressi contenenti il 99% atomo di 13 CO 2. Piante all&#39;interno della camera sarà marcato con 13 C, in cui sono mantenute concentrazioni di CO 2 a livelli ambiente (in quanto le concentrazioni elevabili partizionamento pianta altera carbonio). Livelli ambientali sono mantenuti da solo pulsante etichettato di CO 2 per brevi periodi di tempo. Inoltre, la temperatura nella camera sono monitorati e camere vengono rimossi se le temperature raggiungono i 5 ° C aBove ambiente. </li><li> Una settimana dopo l&#39;etichettatura, confrontare δ 13 C dell&#39;erba-lettiera con valori di abbondanza naturali raccolti da un campione casuale di specie erbacee identici utilizzando una Thermo DELTAplus rapporto isotopico spettrometro di massa (Thermo, San Jose, CA, USA). </li></ol></li><li> Dopo 40 giorni, aggiungere 10 g di aria secca 13 C-marcato erba lettiera ad ogni collare che era stato modificato in precedenza con le carcasse cavalletta. </li><li> Monitorare la velocità di mineralizzazione dell&#39;erba-lettiera in situ in 75 giorni dalla tappatura ogni collare e il monitoraggio sia la respirazione totale del suolo e la respirazione di 13 CO 2. Questa operazione viene eseguita utilizzando un flusso attraverso la tecnica della camera in cui vengono monitorati campioni di gas da ogni collo, in tempo reale, per 8 minuti ciascuna cavità con ring-down spettroscopia (CRDS, Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA; Modello: G1101 -i). CRDS permette di monitorare contemporaneamente sia totale e δ 13 Cdi respirazione del suolo. </li><li> Stima del contributo di 13 C-marcato erba lettiera alla respirazione totale del suolo utilizzando le equazioni di isotopi di miscelazione. La quantità di erba lettiera derivato CO 2 è calcolato come segue: (. Δ 13 C respirazione - δ 13 C nat.abn) C erba lettiera derivata totale = C × / (δ 13 C grass-rifiuti - δ 13 C nat . ABN), dove C totale è la quantità totale di C respirato nel corso di una data misura, δ 13 C respirazione è il δ 13 C di respirato-C per collari addizionati con la lettiera erba etichettato, δ 13 C nat.abn. è la media δ 13 C di C respirata nei tre collari abbondanza naturale (vale a dire quelle che non sono state modificate con i rifiuti), e δ 13 C erba lettiera è il δ 13 C della cucciolata erba aggiunto al collars. </li><li> Monitorare sia la temperatura del suolo e l&#39;umidità in tutta l&#39;esperimento utilizzando sonde portatili per correggere le differenze di respirazione del suolo a causa di differenze di temperatura e umidità. </li><li> Anche se destinati ad uso sul campo, l&#39;anello verso il basso strumento di spettroscopia cavità (Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA; Modello: G1101-i) le letture sono sensibili al movimento. Pertanto, si dovrebbe erigere una stazione di misura base centrale a tutti i grafici contenenti collari in PVC, e collegare lo strumento ai collari con lunghezze di tubo in PVC. </li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodical+cicadas+and+resource+pulses+in+North+American+forests.">Periodical cicadas and resource pulses in North American forests.</a> Science. 306, 1565 (2004).</li><li>Belovsky, G. E., Slade, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+herbivory+accelerates+nutrient+cycling+and+increases+plant+production.">Insect herbivory accelerates nutrient cycling and increases plant production.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14412 (2000).</li><li>Frost, C. J., Hunter, M. 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Non abbiamo nulla da rivelare.

La sequenza dei metodi qui presentati dovrebbero consentire la misurazione sistematica dello stress modo in specie in cui rientra fuori terra catene alimentari possono prime comunità microbica del terreno in modo da ridurre al alterazione della successiva decomposizione della lettiera vegetale. I metodi sono ideali per lo studio degli ecosistemi composti da consumatori artropodi e piante erbacee, perché le catene alimentari intatti possono essere spazialmente circoscritto e contenuto all&#39;interno mesocosmi. Variabilità spaziale può esistere a causa di gradienti di umidità del suolo, fondo, temperatura del suolo, il contenuto di elementi nutritivi, ecc Il progetto dello studio permette di mescosms matrice e collari in PVC per bloccare spaziali lungo gradienti ambientali e quindi conto di tale variazione ambientale quando si analizzano gli effetti. Anche se destinati ad uso sul campo, l&#39;anello verso il basso strumento di spettroscopia cavità (Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA; Modello: G1101-i) se le letture sononsitive al movimento. Pertanto, si dovrebbe erigere una stazione di misura base centrale a tutti i grafici contenenti collari in PVC, e collegare lo strumento ai collari con lunghezze di tubo in PVC. Cucciolata decomposizione nel suolo è stato tradizionalmente misurata racchiudendo quantità note di rifiuti in sacchetti di rete in fibra di vetro, depositare i sacchetti sulla superficie del suolo in campo e periodicamente ri-misura le borse di quantificare scomparsa tasso di lettiera (decomposizione). Il limite di questo metodo è che si è in grado di tracciare il destino della materia decomposta o determinare il contributo di CO 2 mineralizzazione dell&#39;emendamento suolo (lettiera aggiunto) dal suolo, fondo di CO 2 mineralizzazione. Il metodo del gas tracciante con l&#39;etichetta di CO 2 presentato qui aiuta ad alleviare questo vincolo logistico. Ecologia degli ecosistemi e biogeochimica hanno operato sotto il paradigma di lavoro che, a causa dell&#39;impianto non consumati-Rifiuti comprende la maggior parte dei detriti, processi degli ecosistemi ipogea sono solo marginalmente influenzate da input di biomassa provenienti da livelli trofici superiori in reti trofiche fuori terra, come erbivori stessi 6. Tuttavia, vi è una crescente evidenza che le specie a livelli trofici superiori degli ecosistemi possono avere una profonda influenza sui processi ipogea 1,4,5. Il metodo qui presentato si distingue per migliorare la quantificazione del contributo dei livelli trofici superiori, sia direttamente attraverso la biomassa da deposizione carcassa (ad esempio 12, 13) o l&#39;escrezione e egestion (ad esempio 14, 15) o indirettamente attraverso l&#39;alterazione della composizione vegetale comunità (ad esempio 9 ) sull&#39;uso della bicicletta ecosistema dei nutrienti. Tale quantificazione può aiutare a rivelare i meccanismi attraverso i quali gli animali controllano la dinamica degli ecosistemi come parte di uno sforzo concertato per migliorare e rivedere il paradigma di lavoro corrente di controllo biotico sul funzionamento degli ecosistemi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente o attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Anello cavità verso il basso spettroscopio </td><td> Picarro Inc., Santa Clara, CA, USA </td><td> Model # G1101-i </td><td></td></tr><tr><td> CO2 respirometro </td><td> Sistemi Qubit, Kingston, ON, Canada </td><td> Model # S151 </td><td></td></tr><tr><td> 13C </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 372382 </td><td></td></tr><tr><td> Spettrofotometro </td><td> Thermo, San Jose CA, USA </td><td> Modello: Delta V Plus Spettrofotometro rapporto isotopico di massa </td><td></td></tr></tbody></table>

linking predation risk, herbivore physiological stress and microbial decomposition of plant litter

La quantità e la qualità dei detriti che entrano nel suolo determina il tasso di decomposizione da comunità microbiche così come i tassi di riciclo di azoto (N) e carbonio (C) 1,2 sequestro. Lettiera impianto comprende la maggior parte dei detriti 3, e così si presume che la decomposizione è solo marginalmente influenzato da fattori biomassa da animali come erbivori e carnivori 4,5. Tuttavia, carnivori possono influenzare decomposizione microbica di rifiuti dell&#39;impianto tramite una catena di interazioni in cui il rischio di predazione altera la fisiologia delle loro prede erbivoro che a sua volta funzionamento microbica del suolo altera quando le carcasse degli erbivori sono decomposti 6. Una risposta allo stress fisiologico erbivori al rischio di predazione può cambiare il C: composizione elementare N della biomassa erbivoro 7,8,9 perché lo stress da rischio di predazione aumenta la domanda di energia basali erbivoro che in nutrienti limitata erbivoro sistemi di forzes a spostare il loro consumo da N-ricco di risorse per sostenere la crescita e la riproduzione di C-ricco di risorse per sostenere il metabolismo di carboidrati elevato 6. Gli erbivori hanno una capacità limitata di immagazzinare sostanze nutritive in eccesso, in modo da sottolineare erbivori espellono N in quanto aumentano il consumo di carboidrati-C 7. In definitiva, in preda sottolineato rischio di predazione aumentare il loro corpo rapporto C: N 7,10, che li rende le risorse di qualità inferiore per la piscina microbica del suolo probabilmente a causa della minore disponibilità di labile N per la produzione di enzimi microbici 6. Così, la decomposizione delle carcasse degli erbivori stress ha un effetto priming sul funzionamento delle comunità microbiche che diminuisce la capacità a seguito di microbi per decomporre lettiera vegetale 6,10,11. Vi presentiamo la metodologia per valutare i collegamenti tra rischio di predazione e la decomposizione della lettiera di microbi del suolo. Si descrivono come: indurre stress in erbivori dal rischio di predazione; meache le risposte allo stress, e misurare le conseguenze sulla decomposizione microbica. Usiamo intuizioni da un ecosistema di prateria modello comprendente la caccia ragno predatore (Pisuarina mira), un erbivoro dominante cavalletta (Melanoplus femurrubrum), e una varietà di piante e di erba forb 9.

Un esempio di trama cavalletta tariffe standard metabolici in condizioni di stress e lo stress liberi sono presentati nella figura 2. A causa delle differenze di massa corporea tra cavallette individuali, e il fatto che il tasso metabolico varia con la massa corporea, trame dovrebbe presentare tassi metabolici in relazione alla massa corporea cavalletta. Tendenze parallele per i diversi trattamenti indicano che il tasso metabolico aumenta come un multiplo costante di standard tasso metabolico (cioè non vi è massa corporea x interazione metabolica rate) per tutti gli individui stressati. Grasshopper corpo C e contenuto N elementari a rischio e condizioni di libertà sono riportati in Tabella 1. È da notare che vi è un piccolo (4%) differenza di corpo C: N rapporti tra i trattamenti. Tuttavia, queste piccole differenze possono tradursi in notevoli differenze di decomposizione erba lettiera in piscina microbica del suolo (Figura 3). </p&gt; L&#39;aggiunta di lettiera erba per collari in PVC precedentemente modificato con cavallette stressate o senza stress porta a diversi gradi di decomposizione della lettiera, che si riflette nelle curve che descrivono cumulare rilascio di CO 2 dal suolo dovuto alla respirazione microbica (Figura 3). Gli esperimenti devono essere monitorati fino cumulare le curve iniziano a saturare. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Stress </td><td> Stress Free </td></tr><tr><td> Carbonio (%) </td><td> 48,44 ± 0,32 </td><td> 44,73 ± 0,46 </td></tr><tr><td> Azoto (%) </td><td> 12,11 ± 0,08 </td><td> 11,62 ± 0,12 </td></tr><tr><td> Carbonio: Azoto </td><td> 4,00 ± 0,03 </td><td> 3,85 ± 0,04 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Confronto tra il contenuto chimico auto herbivore cavallettacasses dalle condizioni in cui hanno affrontato il rischio di predazione (stress) e in cui il rischio di predazione è assente (senza stress). I valori sono media ± 1 errore standard. <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Illustrazione del disegno del campo mesocosmi utilizzato nell&#39;esperimento e schema generale della valutazione sperimentale rischio di effetti sulla decomposizione della lettiera. <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Un grafico di tasso metabolico erbivoro norma in rapporto alla massa del corpo erbivoro. I dati sono suddivisi in due classi in base al trattamento sperimentale: cavallette di mesocosmi contenenti predatori (predazione) per indurre lo stress, e mesocosmi senza predatori (controllo) e quindi non lo stress indotto. I dati sono da D. HalwenaGU e Schmitz 2010, inedito. <img src="/files/ftp_upload/50061/50061fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50061/50061fig3highres.jpg"/> Figura 3. Curve descrivono cumulativo CO 2 rilascio da parte del pool di decomposizione microbica mentre sperimentali ingressi erba lettiera in collari in PVC. Valori tracciati sono media ± 1 errore standard. Il grafico dimostra che il suolo innescato con stressati carcasse cavalletta (predatore) risultato nel 19% inferiore (ANOVA F 1,6 = 9.06, p &lt;0.05) di piante tassi di decomposizione della lettiera terreni già vaccinati con le carcasse senza stress cavalletta (controllo). L&#39;inserto mostra l&#39;apparato collare PVC nel campo. Figura riprodotta da Hawlena et al. 6 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50061/50061fig3large.jpg" target="_blank">Scattare qui per ingrandire la figura</a> .

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Linking Predation Risk, Herbivore Physiological Stress and Microbial Decomposition of Plant Litter

Vi presentiamo i metodi per valutare come rischio di predazione può alterare la qualità chimica delle prede erbivoro inducendo cambiamenti nella dieta per soddisfare le esigenze di stress elevato, e come la decomposizione delle carcasse di questi erbivori stress rallenta la successiva decomposizione della lettiera vegetale da microbi del suolo.

Collegamento rischio di predazione, stress Herbivore fisiologica e decomposizione microbica dei Rifiuti vegetali

The quantity and quality of detritus entering the soil  determines the rate of decomposition by microbial communities as well as  recycle rates of ...

linking-predation-risk-herbivore-physiological-stress-microbial

Research

JoVE Journal

Biology

12.9K Views.  Yale University. Vi presentiamo i metodi per valutare come rischio di predazione può alterare la qualità chimica delle prede erbivoro inducendo cambiamenti nella dieta per soddisfare le esigenze di stress elevato, e come la decomposizione delle carcasse di questi erbivori stress rallenta la successiva decomposizione della lettiera vegetale da microbi del suolo.

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Testing the Physiological Barriers to Viral Transmission in Aphids Using Microinjection

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When an uninfected aphid feeds on an infected plant it contracts the virus through the plant phloem. Once ingested, the virus must pass from the insect gut to the hemolymph (the insect  blood ) and then must pass through the salivary gland, in order to be transmitted back to a new plant. An aphid may take up different viruses when munching on a plant, however only a small fraction will pass through the gut and salivary gland, the two main barriers for transmission to infect more plants. In the lab, we use physalis plants to study PLRV transmission. In this host, symptoms are characterized by stunting and interveinal chlorosis (yellowing of the leaves between the veins with the veins remaining green). The video that we present demonstrates a method for performing aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut is preventing viral transmission.
The video that we present demonstrates a method for performing Aphid microinjection on insects that do not vector PLVR viruses and tests whether the gut or salivary gland is preventing viral transmission.

Aphids are effective transmitters of plant viruses. Aphid microinjection of virus, the procedure we will show you today, is a technique allowing researchers to inject virus directly into the hemocoel of the aphid, bypassing the gut, one of the 2 major barriers for virus transmission in a circulative manner. The same technique is also used to inject dsRNA for RNAi.

Test della barriere fisiologiche di trasmissione virale in Afidi Utilizzando Microiniezione

Potato loafroll virus (PLRV), from the family Luteoviridae infects solanaceous plants. It is transmitted by aphids, primarily, the green peach aphid. When ...

Ricerca

Biologia

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. Among the most severe stresses are insect herbivory, pathogen infection, and drought stress. For each of these stresses a specific set of hormones and/or combinations thereof are known to fine-tune the responses, thereby ensuring the plant's survival. The major hormones involved in the regulation of these responses are jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and abscisic acid (ABA). To better understand the role of individual hormones as well as their potential interaction during these responses it is necessary to monitor changes in their abundance in a temporal as well as in a spatial fashion. For the easy, sensitive, and reproducible quantification of these and other signaling compounds we developed a method based on vapor phase extraction and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis (1, 2, 3, 4). After extracting these compounds from the plant tissue by acidic aqueous 1-propanol mixed with dichloromethane the carboxylic acid-containing compounds are methylated, volatilized under heat, and collected on a polymeric absorbent. After elution into a sample vial the analytes are separated by gas chromatography and detected by chemical ionization mass spectrometry. The use of appropriate internal standards then allows for the simple quantification by relating the peak areas of analyte and internal standard.

A simple method is provided that allows for the rapid extraction and analysis of multiple plant hormones from small tissue samples. The procedure uses vapor phase extraction as the solemn purification step. Samples are analyzed by GC/MS with chemical ionization that produces mainly (M+1)+ ions.

Monitoraggio ormoni vegetali Durante risposte allo stress

Plant hormones and related signaling compounds play an important role in the regulation of plant responses to various environmental stimuli and stresses. ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo Profiling di massa (OLIMP) di polisaccaridi extracellulari

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Agar-Block Microcosms for Controlled Plant Tissue Decomposition by Aerobic Fungi

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; agar-block). It is well-accepted that soil-block microcosms yield higher decay rates, fewer moisture issues, lower variability among studies, and higher thresholds of preservative toxicity. Soil-block testing is thus the more utilized technique and has been standardized by American Society for Testing and Materials (ASTM) (method D 1413-07). The soil-block design has drawbacks, however, using locally-variable soil sources and in limiting the control of nutrients external (exogenous) to the decaying tissues. These drawbacks have emerged as a problem in applying this method to other, increasingly popular research aims. These modern aims include degrading lignocellulosics for bioenergy research, testing bioremediation of co-metabolized toxics, evaluating oxidative mechanisms, and tracking translocated elements along hyphal networks. Soil-blocks do not lend enough control in these applications. A refined agar-block approach is necessary.
Here, we use the brown rot wood-degrading fungus Serpula lacrymans to degrade wood in agar-block microcosms, using deep Petri dishes with low-calcium agar. We test the role of exogenous gypsum on decay in a time-series, to demonstrate the utility and expected variability. Blocks from a single board rip (longitudinal cut) are conditioned, weighed, autoclaved, and introduced aseptically atop plastic mesh. Fungal inoculations are at each block face, with exogenous gypsum added at interfaces. Harvests are aseptic until the final destructive harvest. These microcosms are designed to avoid block contact with agar or Petri dish walls. Condensation is minimized during plate pours and during incubation. Finally, inoculum/gypsum/wood spacing is minimized but without allowing contact. These less technical aspects of agar-block design are also the most common causes of failure and the key source of variability among studies. Video publication is therefore useful in this case, and we demonstrate low-variability, high-quality results.

This video demonstrates a controlled environment approach to study degradation of lignocellulosic plant tissues by aerobic fungi. The ability to control nutrient sources and moisture is a key advantage of agar-block microcosms, but the approach often yields mixed success. We address critical pitfalls to yield reproducible, low-variability results.

Agar-Block Microcosmi per decomposizione controllata tessuti vegetali da Funghi aerobica

The two principal methods for studying fungal biodegradation of lignocellulosic plant tissues were developed for wood preservative testing (soil-block; ...

Herbivore-induced Blueberry Volatiles and Intra-plant Signaling

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2. These HIPVs are mainly regulated by the defensive plant hormone jasmonic acid (JA) and its volatile derivative methyl jasmonate (MeJA)3,4,5. Over the past 3 decades researchers have documented that HIPVs can repel or attract herbivores, attract the natural enemies of herbivores, and in some cases they can induce or prime plant defenses prior to herbivore attack. In a recent paper6, I reported that feeding by gypsy moth caterpillars, exogenous MeJA application, and mechanical damage induce the emissions of volatiles from blueberry plants, albeit differently. In addition, blueberry branches respond to HIPVs emitted from neighboring branches of the same plant by increasing the levels of JA and resistance to herbivores (i.e., direct plant defenses), and by priming volatile emissions (i.e., indirect plant defenses). Similar findings have been reported recently for sagebrush7, poplar8, and lima beans9..
Here, I describe a push-pull method for collecting blueberry volatiles induced by herbivore (gypsy moth) feeding, exogenous MeJA application, and mechanical damage. The volatile collection unit consists of a 4 L volatile collection chamber, a 2-piece guillotine, an air delivery system that purifies incoming air, and a vacuum system connected to a trap filled with Super-Q adsorbent to collect volatiles5,6,10. Volatiles collected in Super-Q traps are eluted with dichloromethane and then separated and quantified using Gas Chromatography (GC). This volatile collection method was used n my study6 to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants. These methods are described here. Briefly, undamaged blueberry branches are exposed to HIPVs from neighboring branches within the same plant. Using the same techniques described above, volatiles emitted from branches after exposure to HIPVs are collected and analyzed.

A push-pull method for collecting plant volatiles is described. The method allows for a comparison of volatiles induced by herbivore feeding, exogenous methyl jasmonate, and mechanical damage. This technique is also used to investigate the volatile response of undamaged branches to exposure to volatiles from herbivore-damaged branches within blueberry plants.

Volatili Blueberry erbivori indotta e intra-impianto di segnalazione

Herbivore-induced plant volatiles (HIPVs) are commonly emitted from plants after herbivore attack1,2.  These HIPVs are mainly regulated by the defensive ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Using two methods to estimate gene expression in the major gustatory appendages of Aedes aegypti, we have identified the set of genes putatively underlying the neuronal responses to bitter and repulsive compounds, as determined by electrophysiological examination.

Fisiologici Registrazioni e RNA sequenziamento delle appendici gustative del Mosquito febbre gialla<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizzazione Frequenza Stromule con microscopia a fluorescenza

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

Misurazioni delle risposte allo stress fisiologico in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls requires cellular reprogramming and changes in the metabolism of the infected plant. This is necessary to establish a pathogen-oriented physiological sink toward which the host nutrients are redirected. For a complete understanding of this particular plant-pathogen interaction and the mechanisms by which host growth and development are subverted and repatterned, it is essential to track and observe the internal changes accompanying gall formation with cellular resolution. Methods combining fluorescent stains and fluorescent proteins are often employed to study anatomical and physiological responses in plants. Unfortunately, the large size of galls and their low transparency act as major hurdles in performing whole-mount observations under the microscope. Moreover, low transparency limits the employment of fluorescence microscopy to study clubroot disease progression and gall formation. This article presents an optimized method for fixing and clearing galls to facilitate epifluorescence and confocal microscopy for inspecting P. brassicae-infected galls. A tissue-clearing protocol for rapid optical clearing was used followed by vibratome sectioning to detect anatomical changes and localize gene expression with promoter fusions and reporter lines tagged with fluorescent proteins. This method will prove useful for studying cellular and physiological responses in other pathogen-triggered structures in plants, such as nematode-induced syncytia and root knots, as well as leaf galls and deformations caused by insects.

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

The present protocol describes an optimized method for the histological observation of galls induced by Plasmodiophora brassicae. Vibratome sections of hypocotyls are cleared before fluorescence imaging to study the involvement of transcription factors and phytohormones during disease progression. This protocol overcomes resin embedding limitations, enabling in planta visualization of fluorescent proteins.

Combinazione di microscopia a compensazione e fluorescenza per visualizzare i cambiamenti nell'espressione genica e le risposte fisiologiche a Plasmodiophora brassicae

Infection of Brassica crops by the soilborne protist Plasmodiophora brassicae leads to gall formation on the underground organs. The formation of galls ...

Scalable, Flexible, and Cost-Effective Seedling Grafting

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage seedlings of the small model plant, Arabidopsis thaliana, is technically challenging and time consuming due to the size and fragility of its seedlings. A growing collection of published methods describe this technique with varying success rates, difficulty, and associated costs. This paper describes a simple procedure to make an in-house reusable grafting device using silicone elastomer mix, and how to use this device for seedling grafting. At the time of this publication, each reusable grafting device costs only $0.47 in consumable materials to produce. Using this method, beginners can have their first successfully grafted seedlings in less than 3 weeks from start to finish. This highly accessible procedure will allow plant molecular genetics labs to establish seedling grafting as a normal part of their experimental process. Due to the full control users have in the creation and design of these grafting devices, this technique could be easily adjusted for use in larger plants, such as tomato or tobacco, if desired.

This protocol describes a robust seedling grafting method that requires no prior experience or training and can be executed at a very low cost using materials easily accessible in most molecular biology labs.

Innesto di piantine scalabile, flessibile ed economico

Early-stage seedling grafting has become a popular tool in molecular genetics to study root-shoot relationships within plants. Grafting early-stage ...