I batteri intestinali possono influenzare molteplici processi fisiologici degli ospiti degli insetti. Preparare e mantenere le larve axeniche è un potente strumento per studiare le funzioni dei batteri intestinali. I principali vantaggi di questo protocollo sono che la coltura del tessuto vegetale viene utilizzata per ottenere foglie prive di germi per allevare gli insetti carnici derivati da foglie axeniche derivate da uova sterilizzate in superficie e che questo metodo non è limitato da diete artificiali.
Questo metodo è conveniente e aumenta la visibilità del mantenimento degli insetti astonici per futuri studi sui batteri intestinali, in particolare per gli insetti non modello senza diete artificiali ben sviluppate. Mantenere la popolazione di P.versicolora in una camera di crescita a 27 gradi Celsius e 70% di umidità relativa, con una luce di 16 ore e un fotoperiodo scuro di otto ore. Metti gli insetti in scatole di plastica perforate con carta assorbente bagnata inclinata e dai loro da mangiare rami di pioppo freschi.
Spruzzare acqua pulita sulla carta assorbente per mantenere l'umidità e cambiare i rami ogni due giorni. Isolare gli adulti per l'ovodeposizione dopo la pupa e dar loro da mangiare foglie tenere per ottenere più uova. Entro 24 ore, raccogliere le uova appena deposte e metterle su carta assorbente umida per 60 ore per preparare le larve asferiche.
Preparare MS medium in un milligrammo per millilitro di acido alfa-naftalene acetico o soluzioni stock NAA. In una cappa di biosicurezza, aggiungere 50 microlitri della soluzione madre NAA a 500 millilitri di mezzo MS e agitare per mescolare bene. Quindi versare circa 50 millilitri per contenitore di coltura tissutale e attendere la solidificazione.
Sterilizzare bisturi e pinze in una fiamma di lampada ad alcool nella cappa di biosicurezza. Tagliare segmenti di gambo da tre a quattro centimetri con gemme apicali o gemme laterali da piantine di pioppo a circa un mese di crescita e inserirli nel terreno di coltura, uno o due segmenti di gambo per contenitore. Incubare questi segmenti di stelo in una camera di crescita per circa 30 giorni.
E usa queste foglie prive di germi per nutrire le larve asferiche. Piastre di Petri in autoclave, pennelli, carta da filtro, acqua distillata in una capsula di Petri contenente LB agar medium. Metti le foglie con uova aderenti in una capsula di Petri.
Quindi rimuovere con cura le uova dalle foglie usando una pinza e trasferirle in un'altra capsula di Petri. Lavare queste uova con etanolo al 75% per otto minuti. Quindi ripetere il lavaggio quattro volte con acqua sterile.
Trasferire le uova sul mezzo LB agar per preservare l'umidità per la schiusa. Posizionare la capsula di Petri in una camera di crescita e attendere che le uova si schiudano entro 24 ore. In una cappa di biosicurezza, piastrella tre pezzi di carta da filtro bagnata in una capsula di Petri e posiziona foglie di pioppo prive di germi sulla carta.
Raccogli le larve e mettile sulle foglie. Sigillare la capsula di Petri con Parafilm e incubarla in una camera di crescita. Cambia le foglie ogni due giorni.
Per i gruppi allevati convenzionalmente, trasferire le uova dalle foglie a una capsula di Petri contenente carta da filtro umida e nutrire queste larve con foglie di pioppo prive di germi. Seleziona casualmente tre larve di prima, seconda e terza stella dai gruppi privi di germi e allevati convenzionalmente. Seziona le terze larve di instar con forbici e pinze sterili al microscopio stereo e raccogli le loro viscere in tubi di microcentrifuga.
Raccogli le larve intatte della prima e della seconda stella in tubi. Aggiungere 100 microlitri di PBS e tre sfere di acciaio ai tubi da 1,5 millilitri e macinare i tessuti in omogeneizzati utilizzando un omogeneizzatore che batte le perline. Aggiungere 100 microlitri dell'omogeneizzato al mezzo lb agar e alla piastra utilizzando un'asta di diffusione del vetro sterile.
Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 24 ore. Quindi osservare le colonie batteriche. Estrarre il DNA totale dei tessuti precedentemente ottenuti utilizzando un kit di estrazione del DNA e misurare la concentrazione di DNA con uno spettrofotometro.
Amplificare il gene rRNA batterico 16S utilizzando primer universali di rRNA 16S con PCR, impostando la reazione come descritto nel manoscritto di testo. Conservare i prodotti PCR a quattro gradi Celsius fino a ulteriori analisi. Mescolare i prodotti PCR con colorante acido nucleico e analizzarli utilizzando l'elettroforesi su un gel di agarosio all'1% in tampone 1X TAE.
Utilizzare 10 microlitri di un marcatore del DNA come riferimento. Osserva il gel con un transilluminatore UV e cerca il frammento target intorno a 1.500 paia di basi. Sebbene non siano state osservate colonie batteriche in nessun gruppo privo di germi, sono state osservate in tutti i gruppi allevati convenzionalmente, indicando che le larve di uova sterilizzate che sono state alimentate con foglie di pioppo coltivate con tessuti non contenevano batteri.
Le bande PCR a 1.500 coppie di basi sono apparse in tutti i gruppi allevati convenzionalmente. Al contrario, nessuna banda è stata osservata nei gruppi privi di germi o nel controllo negativo, il che implica che non esistevano batteri intestinali nelle larve astoniche. Per le specie di insetti con uova minuscole, i tipi di disinfettanti e la durata della sterilizzazione dovevano essere ottimizzati.
Inoltre, le endofite nelle piante coltivate con tessuti dovrebbero essere notevoli. Questo protocollo fornisce un nuovo metodo per mantenere gli insetti privi di germi, che è uno strumento utile per facilitare gli studi di interazione insetto-batteri intestinali, in particolare per gli insetti non modello senza diete artificiali ben sviluppate.
