Questo protocollo consente l'erogazione di campi elettrici a impulsi da parte di un'elettronica flessibile per studiare i loro effetti terapeutici sul glioblastoma. Lo facciamo visualizzando il microambiente tumorale in vivo con l'imaging. La bioelettronica si sta integrando in questo protocollo utilizzando diversi modelli di complessità crescente al fine di studiare l'effetto dei campi pulsanti sul cancro.
Le tecniche di microfabbricazione presentate in questo lavoro possono anche essere testate come mezzo per trattare altri tipi di tumori, compresi gli xenotrapianti derivati dal paziente. Questo si muove verso l'idea di medicina di precisione su misura per ogni singolo paziente. Queste sonde sono realizzate con tecniche di microfabbricazione standard, quindi la produzione è semplice e chiunque abbia una camera bianca può realizzarle.
Per la modellazione di elettrodi d'oro, depositare uno strato di tre micrometri di parylene C con un sistema di deposizione di parylene posizionando i vetrini puliti nella camera di deposizione. Pesare sei grammi di parylene C in una barca di alluminio, metterlo nella fornace, evacuare la macchina e iniziare la deposizione con i parametri descritti nel manoscritto. Quando la deposizione è terminata e la temperatura del vaporizzatore è inferiore a 40 gradi Celsius, spegnere il refrigeratore, il vaporizzatore, il forno.
Sfiatare la macchina e raccogliere i campioni. Spin coat i campioni trattati al plasma con un fotoresist negativo a 1.000 volte G per 40 secondi. Esporre il fotoresist attraverso una maschera che presenta il design dell'elettrodo interdigitato.
Quindi immergere i campioni in uno sviluppatore privo di ioni metallici per tre minuti per rimuovere il fotoresist non esposto. Per depositare uno strato di adesione di 20 nanometri di cromo e uno strato di 300 nanometri di oro con un evaporatore termico, sfiatare la macchina dell'evaporatore e ritagliare i campioni sulla piastra rotonda superiore con viti metalliche. Riempire i crogioli dedicati rispettivamente con cromo e oro.
Sigillare ed evacuare la macchina e avviare la rotazione del portacampioni. Selezionare il crogiolo contenente cromo e aumentare lentamente la corrente fino a quando la velocità di deposizione raggiunge 0,2 angstrom al secondo. Aprire l'otturatore, attendere fino alla deposizione di 20 nanometri di cromo, chiudere l'otturatore e scendere lentamente la corrente fino a zero milliampere.
Selezionare il crogiolo contenente oro e aumentare lentamente la corrente fino a raggiungere una velocità di deposizione di 0,2 angstrom al secondo. Aprire l'otturatore per far evaporare l'oro, attendere fino alla deposizione di 10 nanometri di oro, quindi aumentare la velocità di deposizione a 1,5 angstrom al secondo fino a depositare circa 300 nanometri. Chiudere l'otturatore e ridurre lentamente la corrente fino a zero milliampere.
Immergere i campioni in un becher contenente acetone. Quindi sciacquare i campioni con isopropanolo e asciugarli con un fucile ad aria compressa. Spin coat quattro strati di soluzione PEDOT:PSS a 150 volte G per 35 secondi.
Rimuovere lo strato sacrificale di parylene C immergendo i campioni in acqua. Immergere i campioni in acqua deionizzata per 30 minuti per rimuovere il sapone rimanente e i composti a basso peso molecolare nel film PEDOT:PSS e staccare i campioni dal substrato di vetro. Aggiungere 75 microlitri di soluzione fusa all'1% di agarosio in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti con attenzione e lasciare solidificare per 15 minuti a temperatura ambiente.
Staccare le cellule di glioblastoma trasdotte ottenute durante la generazione della linea cellulare stabile. Aggiungere 10.000 cellule di glioblastoma per pozzetto e portare il volume totale a 150 microlitri per pozzetto utilizzando DMEM contenente un grammo per litro di glucosio, L-glutammina, piruvato di sodio e bicarbonato di sodio, siero bovino fetale al 10%, 100 unità per microlitri di penicillina e 100 microgrammi per microlitri di streptomicina. Sostituire metà del terreno con mezzi freschi ogni due giorni fino a ulteriori esperimenti, mantenendo la punta della pipetta nella parte superiore del pozzetto per evitare danni all'agarosio o allo sferoide stesso.
Metti le uova fecondate della quaglia giapponese, Coturnix japonica, in un'incubatrice su vassoi con un rotatore automatico che gira le uova ogni due ore. Questo giorno è considerato embrionale giorno zero. Il terzo giorno embrionale, aprire delicatamente le uova usando una pinzetta con punte sottili pre-lavate con etanolo al 70%.
Versare l'embrione in un contenitore di pesatura di plastica, coprirlo con un altro battello di pesatura e metterlo in un'incubatrice umidificata standard a 37 gradi Celsius per tre giorni. Il sesto giorno embrionale, fare una piccola incisione nella membrana corioallantoica con un ago di calibro 23. Posizionare uno sferoide di sette giorni sull'incisione usando una pipetta e riportare l'embrione all'incubatrice per tre giorni fino a ulteriori esperimenti.
Posizionare una goccia di DPBS per coprire la craniotomia. Posizionare l'elettrodo flessibile sulla goccia di DPBS e posizionare delicatamente la parte posteriore della sonda con i cuscinetti di contatto sul dorso del mouse. Assorbire la goccia DPBS con un piccolo pezzo di carta fino a quando la sonda può distendersi sulla dura e seguire la curvatura del cervello, assicurandosi che il piccolo strato di soluzione salina rimanga sotto gli elettrodi per fungere da barriera contro lo spillover della colla.
Posizionare una piccola goccia di adesivo siliconico sulla sonda e coprirla con un vetro di copertura rotondo da cinque millimetri. Spingere il vetro di copertura verso il basso fino a quando il silicone è distribuito uniformemente e la distanza tra il vetro di copertura e la sonda è minima. Quindi attendere 30 secondi affinché il silicone si solidifichi.
Per fissare il vetro di copertura, applicare rapidamente la supercolla sui lati e spingerla verso il basso fino a quando la colla diventa solida. Applicare la super colla sul collo della sonda usando uno stuzzicadenti facendo attenzione che la super colla venga disegnata sotto il collo per fornire un supporto stabile. Coprire il cranio con cemento dentale per costruire un cappuccio cronico e prestare particolare attenzione a coprire solo i bordi del vetro di copertura.
Sollevare la parte posteriore della sonda e applicare il cemento sotto il collo della sonda. Resto della sonda sul cemento prima che si polimerizzi. Spingere delicatamente verso il basso il collo della sonda per posizionare la sua superficie allo stesso livello del vetro di copertura e non nel modo dell'obiettivo del microscopio durante l'esperimento.
Coprire la parte superiore del collo della sonda con non più di 1,5 millimetri di strato di cemento dentale per ottenere una presa salda sulla sonda. Costruire un pozzo di cemento che presenti una cresta di 1,5 millimetri da uno a due millimetri attorno al vetro di copertura per creare un bacino per il fluido di immersione per l'imaging a due fotoni. Dopo che il cemento si è indurito, somministrare l'analgesia postchirurgica e mantenere l'animale caldo fino al recupero avvolgendolo in un tovagliolo di carta e posizionandolo vicino a una lampadina a infrarossi.
Gli elettrodi rivestiti PEDOT:PSS mostrano le tipiche regioni dominate capacitive e resistive separate da una frequenza di taglio, mentre gli elettrodi non rivestiti mostrano solo un comportamento capacitivo. La crescita degli sferoidi osservata con un microscopio a campo chiaro ha rivelato che sono necessari almeno due o tre giorni per ottenere sferoidi sferici e densi a seconda della linea cellulare e del numero di cellule seminate. Nel modello in ovo, l'innesto di sferoidi nella membrana corioallantoica può essere valutato mediante microscopia a fluorescenza poiché le cellule viventi hanno calcio intracellulare e la vascolarizzazione del tumore può essere valutata iniettando un colorante fluorescente nei vasi sanguigni.
Rispetto all'impedenza in soluzione salina, si prevede un aumento dell'impedenza in vivo a frequenze superiori a 100 hertz a causa della presenza di un ambiente biologico. Il parenchima neurale vascolarizzato e l'infiltrazione tumorale possono essere osservati e caratterizzati attraverso il substrato trasparente per settimane mediante microscopia a due fotoni. L'uso di animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti nelle cellule di interesse può dimostrare il minimo processo infiammatorio indotto dalla sola impiantazione di elettrodi.
Può mostrare la presenza di microglia e monociti 26 giorni dopo l'impianto campi elettrici pulsati stimolati elettrodo. Sia le cellule microgliali derivate dai monociti periferici che quelle risonanti cerebrali sono state trovate intorno e all'interno del tumore. Il punto critico per il successo nella procedura di impianto è garantire la tenuta e la planarità della finestra cranica e ottimizzare la qualità del contatto con la sonda.
Oltre all'imaging intravitale, cosa potrebbe considerare la combinazione del nostro protocollo con altre misure e tecniche come i campionamenti e le misure di analisi del sangue per le citochine, lo stato immunitario mediante citometria a flusso o persino l'analisi comportamentale. Questo lavoro apre la strada all'uso di dispositivi impiantabili flessibili per il cancro e apre nuove prospettive per l'uso della medicina bioelettronica per questa malattia cronica.
