L'uso della litografia focalizzata del fascio ionico, o FIB, consente ai ricercatori di migliorare l'interazione della superficie cellulare progettando superfici materiali che hanno aumentato la biocompatibilità e l'integrazione con il tessuto nativo. Con FIB, le caratteristiche possono essere incise su una varietà di materiali, come silicio, metalli e polimeri. Le superfici non planari possono anche essere utilizzate e la post-elaborazione può essere eseguita su singoli dispositivi.
In generale, questo metodo può essere utilizzato su altri microscopi. Tuttavia, diversi produttori di microscopi hanno versioni uniche del software di patterning, che devono essere ottimizzate per ogni sistema. A dimostrare la procedura, sarà la signorina Shreya Mahajan, una studentessa laureata del mio laboratorio.
Per prepararsi al montaggio, utilizzare forcep sottovuoto a punta fine per raccogliere con cura la striscia pulita delle sonde di silicio. Posizionarli su uno stub di alluminio pulito utilizzato per la scansione dell'imaging e dell'incisione FIB al microscopio elettronico. Utilizzare uno stuzzicadenti per posizionare una piccola goccia di vernice argentata sul bordo del substrato di silicio che circonda la sonda.
Fissare la striscia spargendo la vernice argentata attorno ai lati del substrato di silicio che circonda la sonda. Lasciare asciugare completamente la vernice argentata prima di posizionare lo stub di alluminio nel SEM FIB. Quindi, fate clic sul pulsante Sfiato nella scheda Controllo travi (Beam Control) per sfogare la camera FIB SEM.
Premere MAIUSC F3 per eseguire la fase iniziale. Confermare la selezione selezionando il pulsante Home Stage nella finestra popup. Al termine dello stadio iniziale, spostare lo stage in coordinate X=70 millimetri, Y=70 millimetri, Z=0 millimetri, T=0 gradi, R=0 gradi.
Una volta ventilata la camera, indossare guanti di nitrile puliti e aprire la porta della camera. Inserire lo stub in alluminio che tiene le sonde nella parte superiore dell'adattatore dello stadio. Fissare lo stub in alluminio stringendo la vite impostata sul lato dell'adattatore del palco.
Assicurarsi che l'altezza sia regolata in modo appropriato. Utilizzare la chiave esagonale di 1,5 millimetri per questa attività. Aprire con attenzione il braccio della telecamera di navigazione fino a quando non si ferma.
Lo stadio del microscopio si sposterà automaticamente in una posizione sotto la fotocamera. Guarda l'immagine in diretta mostrata nel Quadrante Tre dell'interfaccia utente del microscopio. Una volta che il livello di luminosità si regola automaticamente a un livello appropriato, acquisire l'immagine premendo il pulsante verso il basso sulla staffa della fotocamera.
Questo richiede circa 10 secondi. Far oscillare il braccio della fotocamera in posizione chiusa. Il palco tornerà alla posizione originale.
Chiudere con cura la porta della camera del microscopio. Guarda l'immagine della telecamera CCD nel Quadrant Four mentre chiudo la porta. Assicurarsi che i campioni e lo stadio siano distanti in sicurezza da qualsiasi componente critico nella camera del microscopio.
Selezionare il pulsante Pompa con pulizia campioni nel software dell'interfaccia utente per avviare la pompa per vuoto a camera e il pulitore al plasma integrato. Attendere circa otto minuti per completare il tempo di pompaggio e il ciclo di pulizia del plasma della camera del microscopio. Una volta che l'icona nell'angolo in basso a destra dell'interfaccia utente diventa verde, premere il pulsante Riattiva nella linguetta di controllo del fascio che accende i fasci di elettroni e ioni.
Selezionate il quadrante uno e impostate il segnale del fascio su Fascio di elettroni. Quindi impostare il quadrante due su Fascio ionico. Ora, impostate la tensione SEM su cinque kilovolt, la corrente del fascio SEM a 0,20 nanoamp, il rilevatore SEM su ETD e la modalità rivelatore agli elettroni secondari.
Impostare la tensione FIB su 30 kilovolt, il fascio FIB su 24 picoamp, il rilevatore FIB sul rilevatore ICE e la modalità rivelatore sull'elettrone secondario. Fare doppio clic sulla sonda di silicio nell'immagine della telecamera di navigazione, quadrante tre, per spostare lo stage nella posizione approssimativa della sonda. Fare clic sul quadrante Uno per selezionarlo come quadrante attivo e premere il pulsante di pausa per avviare la scansione SEM.
Impostare il tempo di permanenza della scansione su 300 nanosecondi e disattivare Scan Interlacing, Line Integration e Frame Mediaaging. Impostare Rotazione scansione su zero nella scheda Controllo trave. Fate clic con il pulsante destro del mouse sull'aggiustatore 2D Beam Shift e selezionate zero.
Regolare l'ingrandimento al valore minimo ruotando la manopola di ingrandimento in senso antiorario sul pannello dell'interfaccia utente del microscopio. Regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine utilizzando le manopole del pannello dell'interfaccia utente o l'icona della barra degli strumenti della luminosità a contrasto automatico. Spostare lo stage facendo doppio clic a sinistra sul mouse di una feature per centrarlo.
Quindi spostare la sonda di silicio desiderata da modellare al centro dell'immagine SEM. Individuare un bordo o un'altra feature, ad esempio una particella di polvere o un graffio. Aumentare l'ingrandimento a 2000x ruotando la manopola di ingrandimento in senso orario.
Regolare lo stato attivo del SEM ruotando le manopole di messa a fuoco grossolane e fini sull'interfaccia utente del microscopio, fino a quando l'immagine non è a fuoco. Una volta messa a fuoco l'immagine, selezionare il pulsante Collega esempio Z alla distanza di lavoro sulla barra degli strumenti. Verificare che l'operazione sia stata completata esaminando la coordinata dell'asse Z nella scheda di spostamento.
Il valore dovrebbe essere di circa 11 millimetri. Digitare 4,0 millimetri nella posizione dell'asse Z e premere il pulsante Vai a con il mouse. Spostare lo stadio in X e Y per localizzare la spalla della sonda di silicio.
Posizionarlo il più vicino possibile al centro del SEM. Modificare l'inclinazione dello stadio a 52 gradi digitando 52 nella coordinata T e colpendo Invio. Osservare se la spalla della sonda sembra spostarsi verso l'alto o verso il basso nell'immagine.
Utilizzate il dispositivo di scorrimento Stage Z per riportare la spalla della sonda al centro dell'immagine SEM. Regolare solo la posizione Z. Non spostare l'asse X, Y, T o R.
Eseguire la funzione di allineamento XT integrata, disponibile nel menu a discesa stage. Utilizzare il mouse per fare clic su due punti paralleli al bordo della sonda. Assicurarsi che il pulsante di opzione orizzontale sia selezionato nella finestra popup e fare clic su Fine.
Lo stadio ruoterà per allineare la sonda all'asse X dello stadio. Regolare lo stage in XY utilizzando il mouse per mettere nuovamente la spalla inferiore della sonda al centro dell'immagine SEM. Selezionare il FIB nel quadrante due e assicurarsi che la corrente del fascio sia ancora di 24 picoamp.
Impostare l'ingrandimento su 5000X e il tempo di dimora su 100 nanosecondi. Digitare Control-F sulla tastiera per impostare lo stato attivo FIB su 13 millimetri. Nella scheda Controllo trave fare clic con il pulsante destro del mouse nel regolatore Stigmator 2D e selezionare zero.
Inoltre, fate clic con il pulsante destro del mouse nel regolatore 2D Beam Shift e selezionate zero. Impostare la rotazione dell'analisi su zero gradi e fare clic sul pulsante di luminosità a contrasto automatico sulla barra degli strumenti. Cerca un'immagine della spalla della sonda nel Quadrante Due.
Utilizzare lo strumento snapshot per acquisire un'immagine nel FIB. Verificare che la spalla della sonda si trova al centro dell'immagine FIB. In caso meno, fare doppio clic sulla spalla della sonda per spostarla al centro.
Spostare il palco a sinistra premendo il tasto freccia sinistra sulla tastiera circa 10-15 volte. Scatta un'altra istantanea e osserva se il lato sonda è ancora al centro del FIB. Dopo aver ripetuto questi passaggi fino a quando il bordo della spalla della sonda non è perfettamente allineato con l'asse X dello stadio, utilizzare il FIB per spostare lo stadio verso la spalla inferiore della sonda.
Salvare la posizione del palco nell'elenco delle posizione facendo clic sul pulsante Aggiungi. Modificare la corrente del fascio FIB in 2,5 nanoarti e assicurarsi che l'ingrandimento del FIB sia ancora 5000X. Eseguite la funzione di contrasto auto-luminosità e impostate il tempo di rigonfiamento FIB su 100 nanosecondi.
Premere il pulsante di pausa per avviare la scansione. Regolare la messa a fuoco FIB e l'astigmatismo nel modo più rapido e preciso possibile utilizzando le manopole di messa a fuoco grossolane e fini e le manopole dello stigmatore X e Y sul pannello dell'interfaccia utente. Premere il pulsante di pausa per interrompere la scansione FIB.
All'interno del software Nanobuilder, aprire il file per Patterning the Silicon Probes. Selezionate il menu a discesa Microscopio (Microscopio) e selezionate Imposta origine fase (Set Stage Origin). Selezionate il menu a discesa Microscopio (Microscopio), quindi Calibra rivelatori (Calibrate Detectors).
Sull'interfaccia utente del microscopio, fare clic su Quad One una volta con il mouse per selezionare Quad One. Fare clic su OK per avviare la calibrazione. Il processo richiederà circa cinque minuti.
Assicurarsi che i rilevatori ETD e ICE calibrino. All'interno del software, selezionate il menu a discesa Microscopio (Microscope) e scegliete Esegui (Execute) per avviare la sequenza di patterning. Al termine del modello, chiudere il software.
Premere Sfiato nella scheda Controllo fascio dell'interfaccia utente del microscopio per arrestare i raggi del microscopio e avviare il ciclo di sfiato. Mentre la camera si sta sfogando, spostare il palco alle coordinate adatte. Una volta ventilata la camera, indossare guanti di nitrile puliti e aprire la porta della camera.
Allentare la vite impostata sull'adattatore dello stub utilizzando la chiave esagonale da 1,5 millimetri. Rimuovere lo stub di alluminio contenente la sonda modellata dalla camera. Chiudere con cura la porta della camera del microscopio.
Guarda l'immagine della telecamera CCD nel Quadrant Four mentre chiudo la porta. Assicurarsi che l'adattatore da palco sia distante in sicurezza da qualsiasi componente critico nella camera del microscopio. Ecco le immagini SEM delle sonde di silicio mono gambo non funzionali con nano-architetture incise fib lungo il lato posteriore del gambo.
Le dimensioni finali della nano-architettura incisa erano linee parallele larghe 200 nanometri distanti 300 nanometri e avevano una profondità di 200 nanometri. Per determinare come l'incisione delle nano-architetture nella superficie della sonda influenzi la densità neuronale immediatamente intorno all'impianto, i nuclei neuronali sono stati macchiati e quantificati. La sopravvivenza neuronale è presentata come una percentuale della regione di fondo dalle stesse distanze degli animali di 50 contenitori di micron lontano dal sito dell'impianto.
C'erano molti più neuroni intorno alle sonde di nano-architettura a distanze da 100 a 150 micron dal sito implantare rispetto agli impianti di controllo lisci a quattro settimane dopo l'impianto. Le nano-architetture sono state anche incise FIB lungo il lato posteriore dei microelettrodi funzionali in silicio a gambo singolo e sono state quantificate misurazioni elettrofisiotemiche per indagare come l'incisione delle nano-architetture influenzi le prestazioni dell'elettrodo. I risultati elettrofisiologici hanno mostrato un aumento delle percentuali di canali che registrano singole unità dai microelettrodi della nano-architettura rispetto ai microelettrodi di controllo fluidi.
Non è stata eseguita alcuna analisi statistica per il microelettrodo di nano-architettura perché solo uno è stato impiantato per uno studio pilota proof of concept. L'incisione FIB consente ai ricercatori di indagare come l'aggiunta di segnali topografici sui dispositivi medici può migliorare la risposta cellulare e, in definitiva, le prestazioni del dispositivo. L'ampiezza dei dispositivi medici a cui questi metodi possono essere applicati è illimitata, poiché FIB può essere eseguita su una gamma di materiali, geometrie superficiali e, soprattutto, dispositivi già fabbricati.
