Questo lavoro è stato finanziato dalla University of Virginia e del Jeffress Memorial Trust (J-971). Ringraziamo L. Colombo, K. Jain, e P. Randolph per le discussioni utili e la lettura critica del manoscritto.

1. Saggio di Benedetto per la riduzione degli Zuccheri <ol><li> Preparare una quantità adeguata di reattivo di Benedict - 940 carbonato di sodio anidro mM, 588 mM di citrato di sodio diidrato, 68 mM di rame (II) pentaidrato solfato. Questo reagente può essere conservato a temperatura ambiente (RT) per almeno sei mesi senza alcun cambiamento visibile della reattività. </li><li> Il reagente sopra è 6x. Così, per 600 reazioni ul, aggiungere 100 ml di reattivo di Benedict per un ambiente pulito 1,5 ml microcentrifuga tubo (ad esempio, Eppendorf marca), per campione da dosare. </li><li> Aggiungere ovunque da 10 microlitri di 500 microlitri di campione di questo tubo, la quantità ottimale può essere determinata in base all&#39;intensità della formazione di colore in un periodo di prova iniziale. Se il campione disponibile è sufficiente quindi iniziare tali prove al massimo volume del campione possibile (cioè, i cinque sesti del volume di reazione totale, 500 ml di campione in questo caso), e poi diluire in saggi successivi. </li><li> Aggiungi DDH 2 O al tuessere quello di portare il volume finale a 600 microlitri, miscelare la soluzione nel vortex o pipettaggio. </li><li> Incubare i campioni per 20 minuti in un bagno di acqua bollente. </li><li> Rimuovere il campione riscaldato dal bagno e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Centrifugare la provetta campione a&gt; 9300 xg (~ 10.000 rpm in un FA45-24-11 Eppendorf rotore ad angolo fisso) per 5 minuti in modo da sedimenti qualsiasi materiale particolato, questo passo è più importante per gli studi quantitativi piuttosto che qualitativi. </li><li> Aliquotare il surnatante da questo tubo in una cuvetta pulita. </li><li> Azzerare il Spettrofotometro UV-VIS con l&#39;acqua. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza di questo campione a 475 nm. </li></ol> 2. Assay orcinol Bial per Zuccheri pentosi <ol><li> Preparare una quantità adeguata di reagente Bial fresco - 24,2 mM orcinol monoidrato (vedere la Figura 2b per la struttura di questo composto), HCl 6 M, 0,025% w / v di cloruro ferrico esaidrato Nota.:Per la conservazione prolungata, reagente di Bial possono essere preparate come due soluzioni separate fotografici: (i) reagenti A [0,05% w / v FeCl3 • 6H 2 O in HCl concentrato] e (ii) Reagente B [422 mM monoidrato orcinol preparata in 95 % etanolo]. Un reagente può essere conservato a temperatura ambiente per sei mesi; B reagente può essere conservato a 4 ° C per un mese, coperto con un foglio di limitare l&#39;esposizione alla luce. Queste soluzioni madri sono miscelate in un 15 (A): 1 (B) v / v rapporto prima dell&#39;uso. </li><li> Il reagente sopra è 2x. Così, per 1,0 reazioni ml, aggiungere 500 microlitri di reagente Bial per un ambiente pulito 1,5 ml microcentrifuga tubo, per campione da dosare. </li><li> Aggiungere ovunque da 10 microlitri di 500 microlitri di campione a questo tubo. Come da nota 1.3 (sopra), se il campione è disponibile sufficiente quindi iniziare reazioni di prova utilizzando il massimo volume del campione possibile (cioè, la metà del volume di reazione totale, 500 microlitri di campione in questo caso) e diluire da lì. </li><li> Aggiungere DDH 2 O al tubo per portare il finale del volume a 1,0 ml, mescolare la soluzione nel vortex o pipettaggio. </li><li> Incubare i campioni per 20 minuti in un bagno di acqua bollente. </li><li> Rimuovere il campione riscaldato dal bagno e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Centrifugare la provetta campione a&gt; 9300 xg (~ 10.000 rpm in un FA45-24-11 Eppendorf rotore ad angolo fisso) per 5 minuti in modo da sedimenti qualsiasi materiale particolato, questo passo è più importante per gli studi quantitativi piuttosto che qualitativi. </li><li> Aliquotare il surnatante da questo tubo in una cuvetta pulita per l&#39;ispezione visiva. </li><li> Per le analisi semi-quantitativa, il vuoto Spettrofotometro UV-VIS con l&#39;acqua e misurare l&#39;assorbanza del campione a 660 nm cuvetta. </li></ol> 3. Dische di test Difenilammina per 2&#39;-deoxypentose Zuccheri <ol><li> Preparare una opportuna quantità di reagente di difenilammina Dische - 60 mM difenilammina, 11 M di acido acetico glaciale, 179 mM di acido solforico, 62% v / v di etanolo. Questo reagente può essere prerispetto in anticipo e conservato a temperatura ambiente in un contenitore scuro, o ricoperto di un foglio, per limitare l&#39;esposizione alla luce. A causa della sensibilità alla luce il reagente non deve essere conservata indefinitamente, anche se in pratica può essere preparato ogni due-tre mesi con nessun cambiamento apparente reattività. </li><li> Il reagente sopra è 2x. Così, per 1,0 reazioni ml, aggiungere 500 microlitri di reagente Dische di un ambiente pulito 1,5 ml microcentrifuga tubo, per campione da dosare. </li><li> Aggiungere ovunque da 10 microlitri di 500 microlitri di campione a questo tubo. Come da nota 1.3 (sopra), se il campione è disponibile sufficiente quindi iniziare reazioni di prova utilizzando il massimo volume del campione possibile (cioè, la metà del volume di reazione totale, 500 microlitri di campione in questo caso) e diluire da lì. </li><li> Aggiungere DDH 2 O al tubo per portare il volume finale di 1,0 ml, miscelare la soluzione con vortex o pipettamento. </li><li> Incubare i campioni per 20 minuti in un bagno di acqua bollente. </li><li> Togliere il campione riscaldato dal bagno e allow raffreddare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Centrifugare la provetta campione a&gt; 9300 xg (~ 10.000 rpm in un FA45-24-11 Eppendorf rotore ad angolo fisso) per 5 minuti in modo da sedimenti qualsiasi materiale particolato, questo passo è più importante per gli studi quantitativi piuttosto che qualitativi. </li><li> Aliquotare il surnatante da questo tubo in una cuvetta pulita per l&#39;ispezione visiva. </li><li> Per le analisi semi-quantitativa, il vuoto Spettrofotometro UV-VIS con l&#39;acqua e misurare l&#39;assorbanza del campione a 600 nm cuvetta. </li></ol> 4. Note sull&#39;utilizzo Ulteriori <ol><li> Le seguenti classi di molecole sono composti di riferimento adatti per reazioni di controllo positivi e negativi per ogni saggio: <ul><li> Benedetto - Positivo = libero ribosio, fruttosio, glucosio, negativo = RNA, DNA, ATP, ecc. (Qualsiasi saccaride manca una funzionalità senza zucchero riducente) </li><li> Bial I - Positivo = RNA (ad esempio estratto di lievito del panettiere), ribosio, ATP, UMP, negativo = bovina serum (BSA) o qualsiasi altra proteina </li><li> Dische I - Positivo = DNA (ad esempio timo di vitello); Negativo = RNA, ATP, ecc. (Qualsiasi non-2&#39;-deossigenata nucleotide) </li></ul></li><li> Questi saggi sono stati trovati per essere abbastanza resistente ai composti spesso utilizzati nella purificazione della proteina, per esempio, sali comuni come NaCl, (NH 4) 2 SO 4, e K 2 SO 4 non interferiscono, e le reazioni sembrano generalmente insensibile il contenuto del diluente. Detergenti o agenti caotropici come urea può influenzare la reattività dei saggi se il pH è altamente base; un neutro a pH acido è generalmente più ottimale per la Bial e Dische di saggi a causa della reazione chimica di base (vedi il testo ed i protoni in figura 2b, c). Condizioni di reazione potenzialmente interferenti non ottimali, sospetti, ecc. dovrebbe essere esaminato caso per caso, mediante il controllo positivo e negativo esperimenti wcomposti di riferimento esimo. </li></ol>

<ol>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

<html> I saggi colorimetrici presentati qui offrono un approccio semplice per valutare rapidamente la natura chimica di miscele biomolecolari, come si incontrano quando purificare proteine, RNA o complessi di cellule intere lisato in preparazione per ulteriori studi. Come biologia strutturale persegue assemblee più nativa, come le sfide progressivamente più grandi, come ad esempio l&#39;eterogeneità del campione, sarà posta dai complessi complesse e multi-componente. Supramolecolari sono spesso solo marginalmente sta...

Molto di biologia cellulare avviene attraverso interazioni molecolari che coinvolgono DNA e RNA. 4 Questi acidi nucleici naturali (AN) interagiscono tra loro, 5, 6 con proteine ​​e con una serie di piccole molecole composti e ligandi in vivo (ad esempio, cationi bivalenti 7). Le interazioni possono essere di breve o di lunga durata (cineticamente), può variare da elevata a moderata a bassa affinità (forza termodinamico), e può anche esporre sostanziale variazione delle proprietà chimiche e specificità - alcune associazioni sono molto specifici (ad esempio, il DNA · · · i fattori di trascrizione, RNA · · · fattori di splicing), mentre le altre interazioni sono necessariamente molto più generico (ad esempio, il DNA · · · batteriche come le proteine ​​istone-HU 8). Non specifiche interazioni con agenzie nazionali possono avere conseguenze pratiche per gli esperimenti in vitro che coinvolgono miscele di biomolecules, in quanto è possibile, e anche probabile, che qualche AN assocerà con le biomolecole di interesse, almeno in alcuni sottoinsieme delle condizioni sperimentali impiegate (forza ionica, pH soluzione, ecc). Si consideri, ad esempio, la produzione di una proteina di interesse (POI) eterologa tramite sovra-espressione della proteina ricombinante in coltura di cellule di Escherichia coli, tale procedura viene eseguita di routine in qualsiasi laboratorio di biologia strutturale 9 Nella preparazione per ulteriori esperimenti, quali. come caratterizzazione biochimica / biofisica, cristallizzazione, ecc., sforzi iniziali in genere in modo di ottenere una sufficiente quantità di POI come pura forma possibile, idealmente come un campione chimicamente omogenea e biofisico, monodisperse. Dopo la rottura di cellule ospiti, le prime fasi di un flusso di lavoro tipico purificazione lo scopo di isolare il POI da E. coli proteine, acidi nucleici, parete detriti cellulari,e altri componenti del lisato cellulare. Tuttavia, AN ospite può co-purificare con il POI per diversi motivi fisico - un POI fortemente basico può non specificamente tendina ospitante DNA / RNA, il POI può avere un generico NA attività di legame (ad esempio, il già citato HU); il POI può essere abbastanza specifico NA-binding protein ma mostra reattività crociata con RNA host o DNAs; ospitante AN può interagire con una matrice di cromatografia e quindi semplicemente co-eluire con il POI, e così via. Indiscriminato, ad alta affinità di legame di host AN verso un PDI può rappresentare un problema fastidioso in quanto le impurità NA probabilmente interferire con gli esperimenti a valle (ad esempio, analisi di anisotropia di fluorescenza di POI • RNA binding 10). In alternativa, POI imprevisto · · · associazioni NA può essere visto anche fortuitamente, come tali interazioni illuminare il POI acido nucleico capacità di legame. In entrambi i casi, se AN sono componenti chiave o contaminanti, si deve prima quantificare eidentificare il tipo (DNA, RNA) di co-purificazione AN in preparazione per esperimenti a valle. Esistono diversi metodi analitici per rilevare e quantificare AN in un campione. La maggior parte dei metodi disponibili sono fondamentalmente o spettrofotometrica (ad esempio, A 260 valori di assorbanza e A 260 / A 280 rapporti), fluorimetrica (ad esempio, il legame di tiazolo arancione o altri coloranti fluorescenti a NA), o colorimetrico (suscettibilità di nucleosidi a reazioni chimiche rendimento che cromofori assorbenti in UV-VIS regione dello spettro elettromagnetico), come recentemente descritto da De Mey et al. 1 Tuttavia, il passo cruciale di identificare il tipo di polinucleotide come RNA o DNA è oltre la portata di molti di questi quantificazione approcci. Qui forniamo una serie di test colorimetrici di individuare rapidamente i tipi di componenti NA in un campione proteico. I protocolli descritti qui cun essere efficacemente eseguito senza ulteriori fasi di isolare le impurità potenziali NA, e si basano su test Benedetto per zuccheri riducenti 11, il saggio di orcinol pentosi 12,13, 14,15 e reazioni difenilammina di 2&#39;-deoxypentoses (figure 1 e 2) . Test del Benedetto (Figura 2a) utilizza la capacità del lineare, forma a catena aperta (aldeide) di zucchero aldosio ridurre Cu 2 +, con concomitante ossidazione del carbonile zucchero di una porzione carbossilato e produzione di Cu 2 O come insolubile precipitato rosso. Questa reazione test positivo con libero zuccheri riducenti come aldosi e chetosi (che convertono le aldosi corrispondenti attraverso intermedi enediol), ma non con zuccheri pentosi che sono bloccati in forma ciclica come parte della spina dorsale covalente di un DNA o RNA polinucleotide. A causa del requisito minimalista di una funzionalità senza emiacetale, altri compounds che potrebbero test positivo in questo saggio - e quindi agiscono come potenziali interferenti - sono α-idrossi-chetoni e oligosaccaridi brevi (ad esempio il maltosio disaccaride). Sia il Bial di orcinol (Figura 2b) e Dische di difenilammina (figura 2c) reazioni sono basate sulla distruzione iniziale del backbone polinucleotide, tramite depurination del nucleoside e acido o ulteriore base-catalizzata idrolisi dei nucleotidi madri, per ottenere furan-2 -carbaldehyde (furfurolo) derivati; questi derivati ​​poi reagire sia con un poliidrossi fenolo come orcinol (Bial) o difenilammina (Dische di) reagenti per formare prodotti di condensazione colorate di struttura chimica in gran parte sconosciute. Il DNA RNA rispetto specificità del test del Dische deriva dal fatto che lo zucchero pentoso deve essere 2&#39;-deossigenata per essere suscettibili di ossidazione per ω-hydroxylevulinyl aldeide, che reagisce ulteriormente con difenilamminain condizioni acide per ottenere un blu brillante condensa (figura 2c). Utilizzando i protocolli semplificati descritti qui, abbiamo trovato che queste reazioni colorimetriche zucchero-specifici può distinguere tra RNA e DNA, e indicherà la presenza di zuccheri riducenti liberi quali glucosio, fruttosio, ribosio o in un campione biomolecolare.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente o attrezzature </td><td> Fornitore / società </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti, note </td></tr><tr><td> Sodio carbonato anidro </td><td> Fisher Scientific </td><td> S263 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio citrato diidrato </td><td> Sigma </td><td> S-4641 </td><td></td></tr><tr><td> Di rame (II) solfato pentaidrato </td><td> VWR </td><td> VW3312-2 </td><td></td></tr><tr><td> Monoidrato orcinol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O1875 </td><td></td></tr><tr><td> HCl concentrato </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro ferrico esaidrato </td><td> Sigma </td><td> F-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Difenilammina </td><td> Aldrich </td><td> 112763 </td><td></td></tr><tr><td> Acido acetico glaciale </td><td> Fisher Scientific </td><td> A28 </td><td></td></tr><tr><td> Acido solforico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 258105 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Koptec </td><td> V1101 </td><td></td></tr><tr><td> Ribosio </td><td> Sigma </td><td> R-7500 </td><td> prep a 1% w / v in H 2 O </td></tr><tr><td> L&#39;acido ribonucleico da lievito di birra (S. cerevisiae) </td><td> Sigma </td><td> R6750 </td><td> preparazione a 10 mg / ml in H 2 O, conservare a -20 ° C </td></tr><tr><td> Acido desossiribonucleico (sale sodico), da timo di vitello </td><td> Sigma </td><td> D1501 </td><td> preparazione a 10 mg / ml in H 2 O, conservare a 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti, strumentazione e sicurezza Materiali sono elencati nella following tabella nell&#39;ordine in cui appaiono nella sezione Protocollo. Se non specificato diversamente (sopra), tutti i reagenti possono essere conservati a temperatura ambiente e l&#39;illuminazione. Per tutti gli articoli non elencati di seguito (per esempio, provette da microcentrifuga), la marca solita / modello / varietà trovato in un laboratorio biochimico di serie può essere utilizzata (ad esempio, di marca Eppendorf da 1,5 ml microcentrifuga tubi). Standard di provette per microcentrifuga plastica deve essere utilizzato per operazioni che coinvolgono centrifugazione (ad esempio, al materiale particolato sedimenti vicino alla fine di ciascun protocollo). Nessuna particolare materiale è preferibile, purché i tubi possono essere sigillata; le provette di polipropilene tipici presenti nei laboratori di biochimica funziona bene. In termini di problemi di sicurezza e di smaltimento dei rifiuti, le precauzioni standard di laboratorio (occhiali di sicurezza, cappe) deve essere esercitata nel pre-sbucciatura, lavorare con, e lo smaltimento di soluzioni contenenti concentrato acetico, cloridrico o solforico. Per i reagenti organici come orcinol o diphenylamine, guanti di nitrile sono preferibili al lattice comune (gomma naturale) varietà. </td></tr></tbody></table>

rapid colorimetric assays to qualitatively distinguish rna and dna in biomolecular samples

Sperimentazione biochimica generalmente richiede una conoscenza accurata, in una fase iniziale, l&#39;acido nucleico, proteine ​​e altri componenti biomolecolari in campioni potenzialmente eterogenei. Gli acidi nucleici possono essere rilevati tramite diversi approcci stabiliti, compresi metodi analitici spettrofotometrico (ad esempio, A 260), fluorometrico (ad esempio, il legame di coloranti fluorescenti), o colorimetrica (nucleoside-specifiche reazioni chimiche cromogeni). 1 Anche se non può facilmente distinguere RNA da DNA, la A 260 / A 280 rapporto è comunemente impiegato, in quanto offre un semplice e rapido 2 valutazione del contenuto relativo di acido nucleico, che assorbe prevalentemente vicino 260 nm e proteine, che assorbe principalmente vicino 280 nm. Rapporti &lt;0,8 sono presi come indicativo di &quot;puri&quot; i campioni di proteine, mentre il puro acido nucleico (NA) è caratterizzata da rapporti di&gt; 1,5 3. HoWever, ci sono scenari in cui la proteina / NA contenuto non può essere nel modo più chiaro e affidabile dedurre da semplici misure spettrofotometriche UV-VIS. Per esempio, (i) i campioni possono contenere una o più proteine ​​che sono relativamente privo degli amminoacidi aromatici responsabili di assorbimento a 280 nm (≈ Trp, Tyr, Phe), come è il caso con alcuni piccoli RNA-binding proteins, e (ii) i campioni possono presentare intermedi A 260 / A 280 rapporti (~ 0.8 &lt;~ 1.5), dove la proteina / NA contenuto è molto meno chiara e può anche riflettere un po &#39;alta affinità associazione tra la proteina e componenti NA. Per tali scenari, si descrive qui una suite di test colorimetrici per distinguere rapidamente RNA, DNA, e zuccheri riduttori in un campione potenzialmente misto di biomolecole. I metodi si basano sulla sensibilità differenziale di pentosi e altri carboidrati a Benedetto, Bial di (orcinol), e di Dische (difenilammina) reagenti; protocolli ottimizzati possono essere comcompletato in pochi minuti, senza ulteriori passaggi di dover isolare i componenti. I saggi possono essere eseguiti in parallelo per distinguere tra RNA e DNA, così come indica la presenza di zuccheri riducenti liberi quali glucosio, fruttosio, ribosio e (Figura 1).

Risultati sono mostrati in Figura 3 per l&#39;applicazione di tali saggi colorimetrici ai composti di riferimento noti. Rappresentativi dati qualitativi sono indicati per il Benedetto (a), orcinol Bial di (b), e Dische di difenilammina (c) saggi, e le curve standard per questi tre saggi sono illustrati nella Figura 4. In pannelli 3 (ac), i pannelli di sinistra mostra positive / negative esperimenti di controllo utilizzando analiti opportunamente reattivi / non reattivi; questi risultati...

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Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Una suite di test colorimetrici è descritto per le proteine ​​rapidamente distinguere, RNA, DNA, e la possibilità di ridurre gli zuccheri in campioni biomolecolari potenzialmente eterogenei.

Rapid test colorimetrici per distinguere qualitativamente RNA e del DNA nei campioni Biomolecolari

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

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Video: Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Rapid High Throughput Amylose Determination in Freeze Dried Potato Tuber Samples

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in starch. Iodine forms complexes with both amylose and long chains within amylopectin. After the addition of iodine to a starch sample, the maximum absorption of amylose and amylopectin occurs at 620 and 550 nm, respectively. The amylose/amylopectin ratio can be estimated from the ratio of the 620 and 550 nm absorbance values and comparing them to a standard curve in which specific known concentrations are plotted against absorption values. This high throughput, inexpensive method is reliable and reproducible, allowing the evaluation of large populations of potato clones.&#160;

Rapid High Throughput amilosio Determinazione in liofilizzati campioni dei tuberi

This protocol describes a high through put colorimetric method that relies on the formation of a complex between iodine and chains of glucose molecules in ...

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Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control self-assembly and mimicking this process in vitro will bring about major advances in the areas of materials science and nanotechnology. Among the available biological building blocks, peptides have several advantages as they present substantial diversity, their synthesis in large scale is straightforward, and they can easily be modified with biological and chemical entities1,2. Several classes of designed peptides such as cyclic peptides, amphiphile peptides and peptide-conjugates self-assemble into ordered structures in solution. Homoaromatic dipeptides, are a class of short self-assembled peptides that contain all the molecular information needed to form ordered structures such as nanotubes, spheres and fibrils3-8. A large variety of these peptides is commercially available.
This paper presents a procedure that leads to the formation of ordered structures by the self-assembly of homoaromatic peptides. The protocol requires only commercial reagents and basic laboratory equipment. In addition, the paper describes some of the methods available for the characterization of peptide-based assemblies. These methods include electron and atomic force microscopy and Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR). Moreover, the manuscript demonstrates the blending of peptides (coassembly) and the formation of a &#34;beads on a string&#34;-like structure by this process.9 The protocols presented here can be adapted to other classes of peptides or biological building blocks and can potentially lead to the discovery of new peptide-based structures and to better control of their assembly.

This paper describes the formation of highly ordered peptide-based structures by the spontaneous process of self-assembly. The method utilizes commercially available peptides and common lab equipment. This technique can be applied to a large variety of peptides and may lead to the discovery of new peptide-based assemblies.

Formazione di strutture biomolecolari ordinate dalla Self-assemblaggio di piccoli peptidi

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Confocal Imaging of Confined Quiescent and Flowing Colloid-polymer Mixtures

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed assembly1-3, drug delivery4, improved hydrocarbon recovery5-7, and flowable electrodes for energy storage8. Suspensions containing fluorescent colloids and non-adsorbing polymers are appealing model systems, as the ratio of the polymer radius of gyration to the particle radius&#160;and concentration of polymer control the range and strength of the interparticle attraction, respectively. By tuning the polymer properties and the volume fraction of the colloids, colloid fluids, fluids of clusters, gels, crystals, and glasses can be obtained9.&#160;Confocal microscopy, a variant of fluorescence microscopy, allows an optically transparent and fluorescent sample to be imaged with high spatial and temporal resolution in three dimensions. In this technique, a small pinhole or slit blocks the emitted fluorescent light from regions of the sample that are outside the focal volume of the microscope optical system. As a result, only a thin section of the sample in the focal plane is imaged. This technique is particularly well suited to probe the structure and dynamics in dense colloidal suspensions at the single-particle scale: the particles are large enough to be resolved using visible light and diffuse slowly enough to be captured at typical scan speeds of commercial confocal systems10. Improvements in scan speeds and analysis algorithms have also enabled quantitative confocal imaging of flowing suspensions11-16,37.&#160;In this paper, we demonstrate confocal microscopy experiments to probe the confined phase behavior and flow properties of colloid-polymer mixtures. We first prepare colloid-polymer mixtures that are density- and refractive-index matched. Next, we report a standard protocol for imaging quiescent dense colloid-polymer mixtures under varying confinement in thin wedge-shaped cells. Finally, we demonstrate a protocol for imaging colloid-polymer mixtures during microchannel flow.

Confocal microscopy is used to image quiescent and flowing colloid-polymer mixtures, which are studied as model systems for attractive suspensions. Image analysis algorithms are used to calculate structural and dynamic metrics for the colloidal particles that measure changes due to geometric confinement.

Imaging confocale di confinati riposo e fluenti miscele colloidali e polimeri

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed ...

Preparation of Mica and Silicon Substrates for DNA Origami Analysis and Experimentation

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of these applications require interaction with and adhesion of DNA nanostructures to a substrate. Due to its atomically flat and easily cleaned nature, mica has been the substrate of choice for DNA origami experiments. However, the practical applications of mica are relatively limited compared to those of semiconductor substrates. For this reason, a straightforward, stable, and repeatable process for DNA origami adhesion on derivatized silicon oxide is presented here. To promote the adhesion of DNA nanostructures to silicon oxide surface, a self-assembled monolayer of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) is deposited from an aqueous solution that is compatible with many photoresists. The substrate must be cleaned of all organic and metal contaminants using Radio Corporation of America (RCA) cleaning processes and the native oxide layer must be etched to ensure a flat, functionalizable surface. Cleanrooms are equipped with facilities for silicon cleaning, however many components of DNA origami buffers and solutions are often not allowed in them due to contamination concerns. This manuscript describes the set-up and protocol for in-lab, small-scale silicon cleaning for researchers who do not have access to a cleanroom or would like to incorporate processes that could cause contamination of a cleanroom CMOS clean bench. Additionally, variables for regulating coverage are discussed and how to recognize and avoid common sample preparation problems is described.

Reproducible cleaning processes for substrates used in DNA origami research are described, including bench-top RCA cleaning and derivatization of silicon oxide. Protocols for surface preparation, DNA origami deposition, drying parameters, and simple experimental set-ups are illustrated.

Preparazione di Mica e Silicon substrati per il DNA Origami Analisi e sperimentazione

The designed nature and controlled, one-pot synthesis of DNA origami provides exciting opportunities in many fields, particularly nanoelectronics. Many of ...

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins (SIRT2) and Specific Protein-substrates

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further supported by recent findings in high-resolution mass spectrometry based proteomics showing that many new proteins and sites within these proteins can be acetylated. However the identity of the enzymes regulating these proteins and sites is often unknown. Among these enzymes, sirtuins, which belong to the class III histone lysine deacetylases, have attracted great interest as enzymes regulating the acetylome under different physiological or pathophysiological conditions. Here we describe methods to link SIRT2, the cytoplasmic sirtuin, with its substrates including both in vitro and in vivo deacetylation assays. These assays can be applied in studies focused on other members of the sirtuin family to unravel the specific role of sirtuins and are necessary in order to establish the regulatory interplay of specific deacetylases with their substrates as a first step to better understand the role of protein acetylation. Furthermore, such assays can be used to distinguish functional acetylation sites on a protein from what may be non-regulatory acetylated lysines, as well as to examine the interplay between a deacetylase and its substrate in a physiological context.

Deacetylation Assays to Unravel the Interplay between Sirtuins SIRT2 and Specific Protein-substrates

This protocol describes the required steps to execute in vitro and in vivo deacetylation assays in order to establish the role of proteins as specific deacetylation substrates for sirtuins and further study the role of reversible - lysine acetylation as a post-translational modification.

Deacetilazione saggi di svelare l&#39;interazione tra sirtuine (SIRT2) e specifici Protein-substrati

Acetylation has emerged as an important post-translational modification (PTM) regulating a plethora of cellular processes and functions. This is further ...

A Method to Manipulate Surface Tension of a Liquid Metal via Surface Oxidation and Reduction

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where interfacial tension is a dominant force. A variety of methods exist for controlling the interfacial tension of aqueous and organic liquids on this scale; however, these techniques have limited utility for liquid metals due to their large interfacial tension.
Liquid metals can form soft, stretchable, and shape-reconfigurable components in electronic and electromagnetic devices. Although it is possible to manipulate these fluids via mechanical methods (e.g., pumping), electrical methods are easier to miniaturize, control, and implement. However, most electrical techniques have their own constraints: electrowetting-on-dielectric requires large (kV) potentials for modest actuation, electrocapillarity can affect relatively small changes in the interfacial tension, and continuous electrowetting is limited to plugs of the liquid metal in capillaries.
Here, we present a method for actuating gallium and gallium-based liquid metal alloys via an electrochemical surface reaction. Controlling the electrochemical potential on the surface of the liquid metal in electrolyte rapidly and reversibly changes the interfacial tension by over two orders of magnitude ( &#820;500 mN/m to near zero). Furthermore, this method requires only a very modest potential (&#60; 1 V) applied relative to a counter electrode. The resulting change in tension is due primarily to the electrochemical deposition of a surface oxide layer, which acts as a surfactant; removal of the oxide increases the interfacial tension, and vice versa. This technique can be applied in a wide variety of electrolytes and is independent of the substrate on which it rests.

We present a method to control the interfacial energy of a liquid metal in an electrolyte via electrochemical deposition (or removal) of a surface oxide layer. This simple method can control the capillary behavior of gallium-based liquid metals by tuning the interfacial energy rapidly, significantly, and reversibly using modest voltages.

Un metodo per manipolare Tensione superficiale di un metallo liquido tramite ossidazione superficiale e riduzione

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where ...

Coulomb Explosion Imaging as a Tool to Distinguish Between Stereoisomers

This article shows how the COLTRIMS (Cold Target Recoil Ion Momentum Spectroscopy) or the "reaction microscope" technique can be used to distinguish between enantiomers (stereoisomers) of simple chiral species on the level of individual molecules. In this approach, a gaseous molecular jet of the sample expands into a vacuum chamber and intersects with femtosecond (fs) laser pulses. The high intensity of the pulses leads to fast multiple ionization, igniting a so-called Coulomb Explosion that produces several cationic (positively charged) fragments. An electrostatic field guides these cations onto time- and position-sensitive detectors. Similar to a time-of-flight mass spectrometer, the arrival time of each ion yields information on its mass. As a surplus, the electrostatic field is adjusted in a way that the emission direction and the kinetic energy after fragmentation lead to variations in the time-of-flight and in the impact position on the detector.
Each ion impact creates an electronic signal in the detector; this signal is treated by high-frequency electronics and recorded event by event by a computer. The registered data correspond to the impact times and positions. With these data, the energy and the emission direction of each fragment can be calculated. These values are related to structural properties of the molecule under investigation, i.e. to the bond lengths and relative positions of the atoms, allowing to determine molecule by molecule the handedness of simple chiral species and other isomeric features.

For small chiral species, Coulomb Explosion Imaging provides a new approach to determine the handedness of individual molecules.

Formazione immagine di esplosione Coulombiana come uno strumento per distinguere tra stereoisomeri

This article shows how the COLTRIMS (Cold Target Recoil Ion Momentum Spectroscopy) or the "reaction microscope" technique can be used to distinguish ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

DNA-magnetoscopico associazione analisi di dispersione della luce dinamica ed elettroforetica

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity and convenient colorimetric readout. However, high densities of nanoparticles are typically needed for detection. The available synthesis-based enhancement protocols are either limited to gold and silver nanoparticles or rely on precise enzymatic control and optimization. Here, we present a protocol to enhance the colorimetric readout of gold, silver, silica, and iron oxide nanoprobes. It was observed that the colorimetric signal can be improved by up to a 10000-fold factor. The basis for such signal enhancement strategies is the chemical reduction of Au3+ to Au0. There are several chemical reactions that enable the reduction of Au3+ to Au0. In the protocol, Good&#39;s buffers and H2O2 are used and it is possible to favor the deposition of Au0 onto the surface of existing nanoprobes, in detriment of the formation of new gold nanoparticles. The protocol consists of the incubation of the microarray with a solution consisting of chloroauric acid and H2O2 in 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid pH 6 buffer following the nanoprobe-based detection assay. The enhancement solution can be applied to paper and glass-based sensors. Moreover, it can be used in commercially available immunoassays as demonstrated by the application of the method to a commercial allergen microarray. The signal development requires less than 5 min of incubation with the enhancement solution and the readout can be assessed by naked eye or low-end image acquisition devices such as a table-top scanner or a digital camera.

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

In this work, a protocol for signal enhancement of nanoprobe-based biosensing is presented. The protocol is based on the reduction of chloroauric acid onto the surface of existing nanoprobes that consist of gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles.

Segnale Nanosonda rapido aumento di sintesi di nanoparticelle di oro In Situ

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

Solvothermal Synthesis of MIL-96 and UiO-66-NH2 on Atomic Layer Deposited Metal Oxide Coatings on Fiber Mats

Metal-organic frameworks (MOFs), which contain reactive metal clusters and organic ligands allowing for large porosities and surface areas, have proven effective in gas adsorption, separations, and catalysis. MOFs are most commonly synthesized as bulk powder, requiring additional processes to adhere them to functional devices and fabrics that risk decreasing the powder porosity and adsorption capacity. Here, we demonstrate a method of first coating fabrics with metal oxide films using atomic layer deposition (ALD). This process creates conformal films of controllable thickness on each fiber, while providing a more reactive surface for MOF nucleation. By submerging the ALD coated fabric in solution during solvothermal MOF synthesis, the MOFs create a conformal, well-adhered coating on the fibers, resulting in a MOF-functionalized fabric, without additional adhesion materials that may block MOF pores and functional sites. Here we demonstrate two solvothermal synthesis methods. First, we form a MIL-96(Al) layer on polypropylene fibers using synthetic conditions that convert the metal oxide to MOF. Using initial inorganic films of varying thicknesses, diffusion of the organic linker into the inorganic allows us to control the extent of MOF loading on the fabric. Second, we perform a solvothermal synthesis of UiO-66-NH2 in which the MOF nucleates on the conformal metal oxide coating on polyamide-6 (PA-6) fibers, thereby producing a uniform and conformal thin film of MOF on the fabric. The resulting materials can be directly incorporated into filter devices or protective clothing and eliminate the maladroit qualities of loose powder.

Solvothermal Synthesis of MIL-96 and UiO-66-NH2 on Atomic Layer Deposited Metal Oxide Coatings on Fiber Mats

Metal-organic frameworks are effective in gas storage and heterogeneous catalysis, but typical synthesis methods result in loose powders that are difficult to incorporate into smart materials. We demonstrate a method of first coating fabrics with ALD metal oxides, resulting in conformal films of MOF on the fabrics during solvothermal synthesis.

Sintesi di Solvothermal di MIL-96 e UiO-66-NH2 su strato atomico depositato rivestimenti in ossido di metallo su stuoie di fibra

Metal-organic frameworks (MOFs), which contain reactive metal clusters and organic ligands allowing for large porosities and surface areas, have proven ...