Ringraziamo il Dott Cindy N. Chiu aiuto per elettroforesi su gel, e Andy Zhou e Michael Grodick per la loro generosa donazione di DNA e di enzima di restrizione. Noi riconosciamo con gratitudine il professor J. Heath e il professor D. Prober per l&#39;accesso generoso attrezzature e materiali. Ringraziamo il Dott Karn Sorasaenee per utili suggerimenti. Ringraziamo Mary H. Tang per creare la figura utilizzata nella panoramica schematica nel video. Il finanziamento è stato fornito da Johnson &amp; Johnson e USC Y86786.

NOTA: Quando si lavora con l&#39;RNA mantenere un ambiente di lavoro pulito per evitare la contaminazione da DNasi e RNasi enzimi che degradano il DNA e l&#39;RNA. Assicurarsi che i puntali e tubi sono DNasi e RNasi gratuito. E &#39;utile anche per pulire le superfici di laboratorio e le attrezzature, come pipette, titolari di tubi, ecc, con una soluzione di decontaminazione. 1. RNA trascrizione con trattamento Corrole <ol><li> Preparare la corrole e inibitore composti in un 0.01: 1 rapporto molare [complesso]: [DNA]. NOTA: Nel nostro caso, il rapporto era di 4,3 complessa fmol: 0.43 pmol DNA, dove il modello di DNA usato era APET-28c vettoriale con liga gene da E. coli sotto il controllo del promotore T7. Altri DNA con il promotore T7 sono anche candidati validi per l&#39;esecuzione del test di trascrizione. <ol><li> Sciogliere Actinomicina D, triptolide, tpfc, e Ga (tpfc) in dimetilsolfossido (DMSO) in contenitori separati puliti. Ottenere la concentrazione finale di 0,01: 1 rapporto molare [complex]: [DNA] utilizzando diluizioni seriali con acqua priva di nucleasi. <ol><li> Sciogliere 1 mg Actinomicina D in 1,8 ml DMSO. Aliquotare 10 microlitri di un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1/100. Aliquota 1 ml di diluizione ad un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1 / 1.000. NOTA: La concentrazione della soluzione finale di actinomicina D è 4,3 fmol. </li><li> Sciogliere 1 mg triptolide a 0.64 ml DMSO. Aliquota 1 ml ad un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1 / 1.000. Aliquota 1 ml di diluizione ad un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare un secondo 1 / 1.000 di diluizione. NOTA: La concentrazione della soluzione finale di triptolide è 4.3 fmol. </li><li> Sciogliere 1 mg tpfc in 2,9 ml DMSO. Aliquotare 10 microlitri di un contenitore separato e diluire a 1 ml con acqua priva di nucleasi per creare un 1/100 dilution. Aliquota 1 ml di diluizione ad un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1 / 1.000. NOTA: La concentrazione della soluzione finale di tpfc è 4.3 fmol. </li><li> Sciogliere 1 mg Ga (tpfc) in 2,6 ml DMSO. Aliquotare 10 microlitri di un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1/100. Aliquota 1 ml di diluizione ad un contenitore separato e portare ad 1 ml di acqua priva di nucleasi per creare una diluizione 1 / 1.000. NOTA: La concentrazione della soluzione finale di Ga (tpfc) è 4.3 fmol. NOTA: Queste corroles e inibitori non sono solubili in acqua e devono essere pre-sciolti in DMSO. Piccole quantità di DMSO (inferiore all&#39;1%) non inducono citotossicità in cellule (dati non pubblicati). </li></ol></li></ol></li><li> Prima di iniziare la reazione di trascrizione, preparare i reagenti necessari singolarmente o acquistare da un fornitore commerciale. <ol><li> Thaw sul ghiaccio tutto congelaton reagenti (fare riferimento alla Tabella 1 per un elenco di reagenti congelati). </li><li> Lasciare che il 10X Reaction Buffer e il 4 ribonucleotide (ATP, CTP, GTP, e UTP) soluzioni tempo a mescolare fino a quando non sono completamente sciolti in soluzione. </li><li> Centrifugare brevemente tutti i reagenti per prevenire la perdita di materiale sul bordo del tubo. Una volta scongelato, negozio ribonucleotidi sul ghiaccio, mantenendo il 10x Reaction Buffer a RT. </li><li> Combine reagenti per la reazione di trascrizione in RT (vedi Tabella 2 per un elenco di reagenti). NOTA: La spermidina nella 10x tampone di reazione può coprecipitato DNA stampo se la reazione è montato su ghiaccio piuttosto che a RT. </li><li> Mescolare accuratamente muovendo il tubo o la miscela pipettando su e giù delicatamente. Dopo la miscelazione, centrifugare brevemente per raccogliere miscela di reazione sul fondo della provetta. </li><li> Incubare la miscela di reazione a 37 ° C per un totale di 2-4 ore. NOTA: I tempi di reazione varieranno necessariecon dimensioni del modello di DNA e la sequenza. Questo passaggio potrebbe richiedere ottimizzazione per sequenze specifiche. Modelli più brevi possono richiedere tempi di reazione più lunghi per una elevata resa di RNA totale. </li><li> Rimuovere 4 aliquote microlitri di ogni reazione dopo ogni ora e conservare a -20 ° C. Modificare come necessario per timepoints desiderati. </li></ol></li></ol> 2. RNA Spin Column <ol><li> Dopo la reazione di trascrizione, purificare l&#39;RNA usando colonne cromatografiche compatibile microcentrifuga. NOTA:. L&#39;uso di colonne RNA selezione per purificare RNA con più del 20 basi risultati in maggiore dell&#39;80% di recupero 44 NOTA: Cromatografia su colonna è un metodo comune e conveniente per purificare RNA. Altri metodi di purificazione esistono anche come cloruro di litio precipitazione, fenolo: estrazione con cloroformio, isopropanolo precipitazione, nonché altri kit disponibili in commercio. <ol><li> Uniformemente risospendere matrice Sephadex nel buffer colonna vigorosamente invertendo lacolonna di tre o più volte. A tale scopo, sfogliando colonna bruscamente. </li><li> Rimuovere il tappo superiore dalla colonna. Ci sarà qualche matrice Sephadex residua nel cap; se il tappo è riempito con la matrice, sostituire il tappo nella colonna e ripetere l&#39;operazione precedente fino maggioranza della matrice è nella colonna. </li><li> Snap al largo della punta inferiore della colonna. Nota: alcuni liquido può fuggire dalla colonna. </li><li> Riempire la colonna. <ol><li> Mettere colonna in una sterile (RNasi e DNasi gratuito) provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Centrifugare la provetta in una centrifuga da tavolo a 1.000 xg per 1 min. </li></ol></li><li> Gettare la provetta da 1,5 ml con tampone eluito dalla colonna. </li><li> Porre immediatamente la colonna in una nuova provetta sterile da 1,5 ml e pipettare il campione al centro del letto della colonna. Utilizzare 20-50 ml di campione per evitare di sovraccaricare la colonna. </li><li> Centrifugare la provetta in una centrifuga da tavolo a 1.000 xgper 1 min. NOTA: L&#39;eluente è il campione di RNA purificato. </li></ol></li></ol> 3. Agarosio elettroforesi su gel (1% agarosio Gel) 42 NOTA: bromuro di etidio reagisce dopo il legame al DNA e RNA, pertanto tali biomolecole possono essere visualizzate con luce UV incubandoli con 0,5 mg / ml di bromuro di etidio soluzione. <ol><li> Preparare una soluzione 1,000x scorta di etidio bromuro (0,5 mg / ml) sciogliendo 5 mg di bromuro di etidio in 10 ml di acqua. </li><li> Preparare Tris Acetato EDTA (TAE) buffer di corsa per elettroforesi su gel. Per fare un buffer 50x TAE combinare 2.0 M Tris-acetato con 0,05 M di acido etilendiamminotetracetico (EDTA) e regolare il pH a 8,5. </li><li> Preparare una 1% (peso / volume) gel sciogliendo 10 g UltraPure agarosio in 1 L 1x TAE buffer e la fusione agarosio con un forno a microonde convenzionale. Una volta raffreddato a 50 ° C, aggiungere 1 ml di bromuro di etidio 1,000x al 1% gel di agarosio soluzione, mescolare agitando delicatamente o capovolgendo in un contenitore chiuso, quindi versare la soluzione di agarosio in una piattaforma-gel fusione e lasciare il gel di solidificare a temperatura ambiente. NOTA: il bromuro di etidio è mutageno e potenzialmente cancerogeno. Indossare guanti e maneggiare con cura le soluzioni. Per le procedure di manipolazione di bromuro di etidio, consultare: <a href="http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667">http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</a> . </li><li> Dopo che il gel si è solidificato, posizionare il gel set nel serbatoio elettroforesi. Aggiungere abbastanza tampone TAE a coprire il gel fino pozzetti sono sommersi. Verificare che il livello del buffer TAE è di circa 1 mm sopra il livello del gel. Rimuovere il pettine gel. NOTA: La rimozione del pettine dopo pozzi sono sommersi impedisce sacche d&#39;aria di essere intrappolati nei pozzi. </li><li> Preparare i campioni di RNA. Combina 1 ml di ciascuna aliquota campione purificato con 1 ml Gel Loading Buffer (o con 1 ml 10x tampone di caricamento e diluted al 10 microlitri di acqua priva di nucleasi) e mescolare accuratamente pipettando su e giù con una micropipetta. NOTA: 10x tampone di caricamento contiene il 20% Ficoll 400, 0,1 M Na 2 EDTA, pH 8,0, 1,0% SDS, 0,25% blu di bromofenolo. 0,25% Xilene cianolo può anche essere aggiunto al tampone di caricamento, in quanto corre ~ 50% più velocemente blu di bromofenolo e può essere utile per monitorare tirature molto lunghe. 42 </li><li> Caricare il gel con ciascun campione pipettando accuratamente la soluzione nel fondo di ciascun pozzetto. Fare attenzione a non lasciare bolle d&#39;aria o mescolare campioni tra i pozzetti. NOTA: Una scala RNA può anche essere utilizzata per determinare la dimensione del trascritto. </li><li> Fissare i cavi in ​​modo che il DNA migrerà nel gel verso il cavo positivo. Impostare la tensione al livello desiderato, tipicamente da 1 a 10 V / cm di gel. Eseguire il gel per tutto il tempo è sufficiente per significativa separazione tra i frammenti di RNA, usando la migrazione di coloranti per monitorare l&#39;andamento della separazione. NOTE: A 23 centimetri x 25 cm gel a 250 V richiede circa 1 ora, mentre 8 cm x 8 cm gel a 150 V si terrà a circa 20 min. Frammenti di RNA più piccoli hanno una risoluzione migliore quando viene eseguito a tensioni superiori. </li><li> Spegnere l&#39;alimentazione quando il colorante dal buffer di caricamento è migrata una distanza giudicato sufficiente per la separazione tra i frammenti di RNA. </li><li> Immagine del RNA sotto luce UV come bromuro di etidio sarà fluorescenza. </li><li> Scatta una foto dell&#39;immagine e confrontare intensità di fluorescenza di RNA purificato da ogni condizione. </li></ol> 4. Quantificazione RNA tramite spettroscopia UV-Vis <ol><li> Mettere 2 ml H 2 O su un NanoDrop 2000 o macchina simile, e misurare il vuoto. </li><li> Quindi, posizionare 2 ml di ogni campione di RNA, seguenti purificazione, sulla spettrofotometro e misurare UV-Vis da una lunghezza d&#39;onda di 200 nm a 800 nm. NOTA: Un A 260 lettura di 1.0 è equivalente a circa 40 ug / ml di RNA,e RNA pura ha un A 260 / A 280 Rapporto di 2.1. 45 </li><li> Nel caso che l&#39;assorbanza è superiore a 1 OD, diluire i campioni in acqua priva di nucleasi per ottenere un OD inferiore 1. </li><li> Utilizzare software grafici per tracciare i vari campioni e confrontare OD a 260 nm. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Questo test dimostra che l&#39;aggiunta di Ga (tpfc) inibisce la trascrizione dell&#39;RNA paragonabile alle note che legano il DNA complessi antitumorali Actinomicina D e Triptolide. Il comportamento citotossica di Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1-154,7 micron) possono grazie alle sue proprietà anticorrosione. Poiché nessuna inibizione della trascrizione è stata osservata nel tpfc, la citotossicità di tpfc non è dovuta alla trascrizione dell&#39;RNA inibizione ma è causata da altri mezzi non ancora studiati. </...

La chemioterapia comporta spesso ad ampio spettro agenti citotossici con effetti collaterali indesiderati e il targeting limitata, ma con una maggiore comprensione della biologia del cancro, vi è una sempre crescente domanda di farmaci antitumorali con efficacia il cancro-targeting superiore e minori effetti collaterali. 1 le cellule tumorali umane spesso diventano dipendenti da un singolo oncogene attivato o overexpressed per la sopravvivenza 2 Così., molti farmaci antitumorali vengono valutati per la loro capacità di inibire la trascrizione dell&#39;RNA. Trattamenti che bloccano l&#39;espressione di questi geni che trasformano sono efficaci per eliminare le cellule tumorali e portano alla morte cellulare. 3 Le cellule trasformate sono più sensibili alle interruzioni di RNA di trascrizione di quelle corrispondenti cellule normali. 4 farmaci antitumorali che inibiscono la trascrizione dovrebbero inibire selettivamente la espressione degli oncogeni che sono necessari per la cellula tumorale di sopravvivere. 5 Di conseguenza, i trascrizione dell&#39;RNAnhibition è un modo utile per identificare i potenziali candidati farmaco antitumorale e saperne di più sul loro meccanismo d&#39;azione. Questo protocollo dimostra che Ga (tpfc) inibisce la trascrizione dell&#39;RNA sullo stesso ordine delle droghe di chemioterapia Actinomicina D e triptolide; paragoni simili possono essere effettuate utilizzando questo protocollo con altri farmaci candidati antitumorale. Actinomicina D è un inibitore della trascrizione di RNA comunemente usato per trattare il cancro gestazionale trofoblastica, cancro ai testicoli, tumore di Wilms, rhabdomyosacoma, e Ewing sarcoma di 6. Actinomicina D è stato utilizzato nella terapia del cancro per quasi 50 anni da quando è stata approvata dalla FDA nel 1964.Triptolide è un inibitore selettivo della trascrizione che è stata valutata in vitro e in vari modelli animali di tumore per 30 anni. 7 La natura amfifilico macrociclico di corroles conferisce vantaggi significativi rispetto ad altri classi di farmaci, quali piccole molecole o biologicas. 8-14 Il carattere macrociclico permette permeabilità cellulare che è maggiore del previsto per tali grandi molecole, e sono abbastanza grandi per interagire con superfici macromolecolari, come quelle delle proteine. 8 Corroles sono noti per formare complessi covalenti stretti con biomolecole e droghe. 10 Oltre alla citotossicità intrinseca del quadro corrole, abbiamo dimostrato che un solfonati agisce corrole come una molecola carrier per agenti chemioterapici, in particolare il antracicline doxorubicina farmaco-DNA intercalanti. Quando il corrole solfonata è stato somministrato con doxorubicina, un aumento di 3 volte nella IC 50 di doxorubicina è stata osservata per DU-145 cellule. 9 Il quadro corrole è stabile e ha assorbanza e fluorescenza intrinseche proprietà che, quando funzionalizzato, sottoposti a turni di assorbanza unici che possono essere utilizzati per la caratterizzazione. 10 Funzionalizzazione del ponteggio no intrinsecamente affetto,t le proprietà fotofisiche del corrole, 9-15 ma, come si è visto con un corrole solfonato, modificando selettivamente quadro del corrole può cambiare in modo sostanziale le sue proprietà biologiche. 16 Abbiamo già valutato sei metallocorroles contro sette linee cellulari tumorali umane. I risultati indicano che la tossicità verso cellule tumorali umane dipende lo ione metallico specifica, così come la sostituzione del gruppo funzionale. Ad esempio, corroles gallio solfonati sperimentato elevato assorbimento cellulare e penetrarono selettivamente nel nucleo delle cellule tumorali della prostata metastatico cervello (DU-145); cellule stesso corrole, anche se non penetra nel nucleo di altre linee cellulari, presenta una maggiore citotossicità per il seno (MDA-MB-231), il melanoma (SK-MEL-28), e delle ovaie (OVCAR-3) che per il cancro il cancro alla prostata. 9 Saggi cellulari iniziali indicano che questi composti promettenti come anti-cancro agenti terapeutici, quali meriti Fürthindagini er nel meccanismo di azione. L&#39;inibizione della trascrizione è osservato con alcuni complessi organometallici 17-27 e abbiamo cercato di esaminare questo processo come un possibile meccanismo per il comportamento citotossica della famiglia corrole. Questo test trascrizione fornisce un metodo semplice, poco costoso, e facile per valutare l&#39;inibizione di trascrizione, che porterà a informazioni più dettagliate sugli effetti di queste molecole in cellule vive. Qui, l&#39;inibizione della trascrizione di gallio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)), e il suo analogo freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figura 1) sono testati. A differenza di alcuni complessi di metalli di transizione, di gallio (III) è redox inattivo e, pertanto, non è direttamente coinvolto nel processo redox delle vie metaboliche a base redox-. 28 Indipendentemente, gallio (III) non presentano proprietà citotossiche ed è stato indagato per scopi terapeutici. Gallio è il secondo metallo più promettente per terapie antitumorali dopo platino e ha subito molti studi e ricerche; sali nitrati e cloruro di gallio sono stati valutati in studi clinici contro epatocarcinoma, linfoma, tumori della vescica, e di altre malattie. 29-34 gallio (III) è quindi l&#39;ideale per antitumorali studi corrole. I dati iniziali mostrano Ga (tpfc) e tpfc hanno un basso GI 50, la concentrazione necessaria farmaco per inibire il 50% della proliferazione cellulare massima, con varie linee cellulari tumorali (vedi figura 2); questo afferma la validità di ulteriori esperimenti su questi due composti per determinare le loro proprietà anticorrosione. Confrontiamo questi composti con i farmaci antitumorali comuni Actinomicina D e Triptolide. Actinomicina D intercala DNA, inibisce la RNA di allungamento, e induce apoptosi in alcune linee cellulari a concentrazioni picomolari 6,35-37 Triptolide ha dimostrato di inibire la crescita tumorale.; si lega a XPB umana / ERCC3, una subunità ofattore di trascrizione f TFIIH, porta alla inibizione della RNA polimerasi II attività. 6-7,38-40 Mentre è risaputo che corroles presentano proprietà citotossiche, esiste poca informazione sui diversi meccanismi derivanti dalla funzionalizzazione. L&#39;inibizione Corrole di RNA trascrizione offrirebbe una maggiore comprensione delle loro interazioni con biomacromolecole. Altri complessi noti per legarsi a DNA, come dirhodium (II, II), complessi di cromo (III), rutenio (II) polypyridyl, rodio (III), e vari altri, sono stati sottoposti a test RNA trascrizione, 18- 27 con conseguente maggiore comprensione delle loro interazioni con biomacromolecole. Questo esperimento facile e ampiamente disponibile è anche un buon test iniziale per valutare le proprietà di citotossicità di una data molecola e determinare se merita ulteriori test biologici. Il dosaggio RNA trascrizione permette anche per molte modifiche, come varying la quantità di composto o enzimi utilizzati; variando il periodo di incubazione, tempo di reazione e momenti di campionamento; e variando la lunghezza del DNA modello e sequenza, tra le altre variabili di interesse, quindi potenzialmente fornendo una grande quantità di dati. Questo test trascrizione è anche facilmente disponibili come kit a prezzi accessibili con tutti i componenti della reazione necessari previsti, anche se i componenti possono essere acquistati e preparati singolarmente. In questi esperimenti, usiamo un kit disponibile in commercio noti per avere alto rendimento. 41 Per valutare l&#39;inibizione della trascrizione, utilizziamo due metodi: elettroforesi gel e spettroscopia UV-Vis. Elettroforesi su gel di agarosio è un metodo semplice ed efficace per la separazione, l&#39;identificazione e purificazione da 0,5 a DNA e RNA frammenti di 25 kb. 42 spettroscopia UV-Vis può essere utilizzato per determinare la concentrazione e la purezza di RNA. 43

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:219px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Actinomycin D</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1410</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triptolide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3652</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">nuclease-free H2O&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td>CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tris Acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mini Quick Spin RNA Columns</td>
			<td style="width:219px;">Roche Life Science</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11814427001</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , do not freeze</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:219px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N3232S</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro enzymatic assay to measure transcription inhibition by gallium(iii) and h3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

La chemioterapia comporta spesso ad ampio spettro agenti citotossici con molti effetti collaterali e il targeting limitato. Corroles sono una classe di macrocicli tetrapirrolici che presentano differenziali proprietà citostatici e citotossici in linee cellulari specifici, a seconda delle identità del metallo chelato e gruppi funzionali. Il comportamento unico di corroles funzionalizzati verso linee cellulari specifiche introduce la possibilità di chemioterapia mirata. Molti farmaci antitumorali vengono valutati per la loro capacità di inibire la trascrizione dell&#39;RNA. Presentiamo qui un protocollo passo-passo per RNA trascrizione in presenza di inibitori noti e potenziali. La valutazione dei prodotti RNA della reazione di trascrizione mediante elettroforesi su gel e-Vis UV spettroscopia fornisce informazioni sulle proprietà inibitive di potenziali farmaci candidati antitumorali e, con modifiche al dosaggio, più circa il loro meccanismo d&#39;azione. Piccolosi conosce il meccanismo molecolare di azione di citotossicità corrole. In questo esperimento, consideriamo due composti corrole: gallio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) e analogici freebase 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Un saggio di trascrizione dell&#39;RNA è stata utilizzata per esaminare le proprietà anticorrosione dei corroles. Cinque reazioni di trascrizione sono stati preparati: DNA trattato con Actinomicina D, triptolide, Ga (tpfc), tpfc a [complesso]: [modello base DNA] rapporto 0,01, rispettivamente, e un testimone non trattato. Le reazioni di trascrizione sono stati analizzati dopo 4 ore mediante elettroforesi su gel di agarosio e spettroscopia UV-Vis. C&#39;è l&#39;inibizione chiaro Ga (tpfc), Actinomicina D, e triptolide. Questo test RNA trascrizione può essere modificato per fornire dettagli più meccanicistica variando le concentrazioni del complesso antitumorale, DNA, o enzima polimerasi, o incubando il DNA polimerasi o con il complexes prima RNA di trascrizione; queste modifiche sarebbero distinguere tra un meccanismo di inibizione coinvolge il DNA o l&#39;enzima. Aggiunta del complesso dopo la trascrizione dell&#39;RNA può essere utilizzato per verificare se i complessi degradano o idrolizzare l&#39;RNA. Questo test può anche essere usato per studiare ulteriori candidati antitumorali.

RNA Trascrizione Qualitativamente Valutazione effettuta da Gel di Agarosio Elettroforesi su gel di agarosio è utilizzato per l&#39;immagine RNA trascritto. Etidio bromuro reagisce dopo il legame (λ = 605 nm em, λ = 210 nm ex, 285 nm) 46 permette l&#39;imaging di RNA. Bande scure nel gel corrispondono a concentrazioni più elevate di RNA. Se Actinomicina D, triptolide, o sia complesso corrole inibisce la trascrizione dell&#39;RNA, la produz...

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An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole e il suo analogo freebase presentano bassa citotossicità cellulare micromolare. Questo manoscritto descrive una reazione di trascrizione di RNA, RNA di imaging con un gel bromuro di etidio macchiate e quantificare RNA con spettroscopia UV-Vis, al fine di valutare l&#39;inibizione della trascrizione da corroles e dimostra un metodo semplice di valutare le proprietà anticancro candidati.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzimatica Assay misurare Trascrizione inibizione da gallio (III) e H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

an-vitro-enzymatic-assay-to-measure-transcription-inhibition

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

11.5K Views.  California Institute of Technology.  Gallio (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole e il suo analogo freebase presentano bassa citotossicità cellulare micromolare. Questo manoscritto descrive una reazione di trascrizione di RNA, RNA di imaging con un gel bromuro di etidio macchiate e quantificare RNA con spettroscopia UV-Vis, al fine di valutare l'inibizione della trascrizione da corroles e dimostra un metodo semplice di valutare le proprietà anticancro candidati. 

Video: An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilizzando impedenza Cell-substrato e imaging cellulare dal vivo per misurare i cambiamenti in tempo reale in Cellular Adesione e De-adesione indotta da Matrix Modifica

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Ricerca

Bioingegneria

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Current in vitro models for evaluating contact lenses (CLs) and other eye-related applications are severely limited. The presented ocular platform simulates physiological tear flow, tear volume, air exposure and mechanical wear. This system is highly versatile and can be applied to various in vitro analyses with CLs.

Sviluppo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Oculare piattaforma per testare Lenti a contatto

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modello del disco intervertebrale Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Una nuova tecnica chirurgica come una Fondazione per In Vivo parziale ingegneria del fegato nel ratto

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Un metodo automatizzato per eseguire l'analisi in vitro micronucleoutilizzando la citometria del flusso di imaging multispettrale

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current in vitro screening models that have sufficient throughput only have limited physiological relevance, which hinders the translation of findings from in vitro to in vivo. On the other hand, microfluidic cell culture platforms have shown unparalleled physiological relevancy in vitro, but often lack the required throughput, scalability and standardization. We demonstrate a robust platform to study angiogenesis of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC-ECs) in a physiological relevant cellular microenvironment, including perfusion and gradients. The iPSC-ECs are cultured as 40 perfused 3D microvessels against a patterned collagen-1 scaffold. Upon the application of a gradient of angiogenic factors, important hallmarks of angiogenesis can be studied, including the differentiation into tip- and stalk cell and the formation of perfusable lumen. Perfusion with fluorescent tracer dyes enables the study of permeability during and after anastomosis of the angiogenic sprouts. In conclusion, this method shows the feasibility of iPSC-derived ECs in a standardized and scalable 3D angiogenic assay that combines physiological relevant culture conditions in a platform that has the required robustness and scalability to be integrated within the drug screening infrastructure.

This method describes the culture of iPSC-derived endothelial cells as 40 perfused 3D microvessels in a standardized microfluidic platform. This platform enables the study of gradient-driven angiogenic sprouting in 3D, including anastomosis and stabilization of the angiogenic sprouts in a scalable and high-throughput manner.

Analisi standardizzata e scalabile per studiare la germogliazione angiogenica 3D perfusa di cellule endoteliali derivate da iPSC in Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Modelli avanzati di fegato 3D per test di genotossicità in vitro a seguito dell'esposizione a lungo termine ai nanomateriali

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...