La digestione dipendente dal DNAzyme è un metodo utile per studiare le funzioni degli snoRNA. È un metodo rapido e semplice per analizzare la metilazione dell'RNA site-specific. Richiede un breve oligonucleotide di DNA e reagenti di base presenti in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare.
Iniziare progettando il DNAzyme per la sequenza di interesse. Trovare la sequenza di RNA o il sito di metilazione putativa utilizzando un database appropriato. Per gli obiettivi snoRNA S.cerevisiae, utilizzare il database di snoRNA del lievito.
Per trovare un sito di metilazione di interesse, ad esempio un sito dipendente da snR13, selezionare snR13 e prendere nota della posizione del nucleotide modificato. Trova la sequenza a monte e a valle del nucleotide modificato utilizzando un database appropriato, come saccharomyces Genome Database. Cerca il nome del gene di destinazione.
Se si utilizza un saggio da 10 a 23 DNAzyme, selezionare da 10 a 15 nucleotidi a monte e a valle del sito di metilazione. Se si utilizza il DNAzyme 8-17, selezionare 20 nucleotidi. Crea sequenze complementari dei bracci cinque primi e tre primi e usali per fiancheggiare la sequenza catalitica di DNAzyme alle estremità dei tre primi e dei cinque primi.
Ordinare il DNAzyme come un normale oligonucleotide di DNA. Coltivare ceppi di lievito di interesse in un mezzo e condizioni appropriati. Quando le cellule raggiungono la fase esponenziale media, pallinizzarle centrifugando a 1.000 volte g per tre minuti a quattro gradi Celsius e scartare il mezzo.
Procedere con l'isolamento dell'RNA secondo le indicazioni manoscritte. Quindi, rimescolare il pellet di RNA in 30 microlitri di RNasi e acqua priva di DNasi. Posizionare il tubo sul ghiaccio e misurare la concentrazione di RNA su un microspettrofotometro.
Per eseguire la digestione del DNAzyme utilizzando il DNAzyme da 10 a 23, preparare un mix di incubazione con cinque microgrammi di RNA, 200 picomoli da 10 a 23 DNAzyme e un tampone di incubazione da 10 a 23 in un volume totale di 10 microlitri. Quindi, incubare i tubi su un blocco di calore secco impostato a 95 gradi Celsius per tre minuti. Subito dopo, posizionare i tubi sul ghiaccio e lasciarli lì per cinque minuti.
Girare brevemente giù per i tubi e rimetterli sul ghiaccio. Aggiungere 20 unità di inibitore della RNasi e posizionare i tubi su un blocco di calore secco impostato su 25 gradi Celsius per 10 minuti. Nel frattempo, preparare una miscela di reazione combinando cinque microlitri di tampone di reazione da quattro X 10 a 23 con quattro microlitri di cloruro di magnesio 300 molare e un'acqua microliter.
Preriscaldare questa miscela di reazione su un blocco di calore secco impostato su 37 gradi Celsius. Posizionare il tubo con la miscela di incubazione sul blocco di calore secco Celsius di 37 gradi e aggiungere 10 microlitri della miscela di reazione prebellica. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per un'ora e quindi posizionare il tubo sul ghiaccio.
Per eseguire la digestione del DNAzyme utilizzando il DNAzyme 8-17, preparare un microtubo da 1,5 millilitri con cinque microgrammi di RNA in un volume totale di sei microlitri. Quindi, preparare un tubo separato con 400 picomoli dell'8-17 DNAzyme. Durante il lavoro, tenere entrambi i tubi sul ghiaccio.
Trasferire entrambi i tubi in un blocco di calore asciutto impostato su 95 gradi Celsius e incubarli per due minuti. Spostare il campione di RNA sul ghiaccio e girare lungo il tubo con il DNAzyme per cinque secondi. Incubare il DNAzyme a 25 gradi Celsius per 10 minuti.
Mentre il DNAzyme sta incubando, preparare 10 mircoliter di tampone di reazione due X 8-17 e prewarm a 25 gradi Celsius. Aggiungere il tampone prebellico al tubo con il DNAzyme e quindi trasferire 14 microlitri di questa miscela di reazione al tubo con l'RNA, insieme a 20 unità di inibitore della RNasi. Incubare la reazione a 25 gradi Celsius per due ore e quindi posizionare il tubo sul ghiaccio.
Per purificare l'RNA dopo la digestione del DNAzyme, aggiungere 350 microlitri di acqua e 400 microlitri di cloroformio al tubo di reazione. Vortice per 30 secondi e centrifuga a 20.000 volte g per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, trasferire la fase superiore in un nuovo tubo contenente un millilitro etanolo, 40 microlitri di acetato di ammonio 7,5 molare e un microlitro di glicogeno.
Capovolgere il tubo alcune volte per mescolare e incubare a -80 gradi Celsius per due ore o a -20 gradi Celsius durante la notte. Procedere con la purificazione dell'RNA secondo le indicazioni manoscritte e quindi sospendere di nuovo il pellet di RNA in 10 microlitri RNasi e acqua priva di DNasi. Posizionare il tubo dell'RNA sul ghiaccio immediatamente dopo la purificazione.
Per eseguire l'elettroforesi dell'RNA, iniziare sciogliendo 1,5 grammi di agarosio in 127,5 millilitri di acqua doppia distillata riscaldando la miscela nel microonde. Quindi, aggiungere 15 millilitri di MOPS 10X e 7,5 millilitri di formaldeide al 37% alla soluzione di agarosio. Aggiungere una quantità appropriata di macchia di gel alla soluzione di agarosio.
Versare l'agarosio nel vassoio e lasciarlo raffreddare per 45 minuti. Preparare i campioni di RNA combinando 10 microlitri dell'RNA digerito e purificato con cinque microlitri di tampone di denaturazione del campione e 0,5 microlitri di colorante a carico sei X. Incubare i campioni a 70 gradi Celsius per cinque minuti e poi, sul ghiaccio per cinque minuti.
Mettere il gel preparato nel serbatoio di elettroforesi e riempire il serbatoio con un tampone MOPS one-X. Caricare tutti i 15 microlitri del campione sul gel ed eseguire il gel a 80 volt fino a quando il blu di bromotimolo raggiunge i 2/3 della lunghezza del gel. Analizzare il gel con l'imager appropriato.
Il valore di questa tecnica può essere dimostrato su un sistema di trascrizione dello snoRNA induttibile. L'inserimento di un promotore GAL1 induttibile a monte dei geni snR13 o snR47 consente l'analisi della metilazione dipendente dallo snoRNA dell'RNA ribosomiale 25S. Quando le cellule vengono coltivate con galattosio, l'RNA ribosomiale 25S viene metilato in siti guidati da snoRNA e rimane intatto dopo il trattamento con DNAzyme.
Al contrario, quando l'espressione dello snoRNA viene spenta a causa della mancanza di galattosio, si verifica una scissione dipendente da DNAzyme. Inoltre, non si osserva alcuna digestione dell'RNA nei controlli di tipo selvaggio poiché l'espressione dello snoRNA è indipendente dal galattosio. L'attività della scissione dipendente dal DNAzyme nell'analisi delle nostre modifiche all'rRNA è stata mostrata di recente nel contesto della maturazione dello snoRNA.
Il saggio dipendente dal DNAzyme è stato usato per mostrare che la mancanza di elaborazione a cinque primi e pre-snoRNA influisce sui livelli di metilazione di 25S e 18S rRNA in Saccharomyces cerevisiae. Questo protocollo richiede l'uso di fenolo e cloroformio, che sono tossici e devono essere maneggiati sotto una cappa aspirante.
