Questo lavoro è stato supportato da un EMBO lungo termine fellowship (ABW), un National Science Foundation Internazionale Postdoctoral Research Fellowship (ABW), la Max Planck Gesellschaft (ABW, DS, JS, ACO), una borsa di studio scava-BB (AO), e il Consiglio europeo della ricerca nell&#39;ambito delle Comunità europee del Settimo programma quadro STG-207634 (DS, ACO). Ringraziamo Ravi Desai per gli utili commenti sul manoscritto. Vorremmo anche ringraziare la funzione di espressione della proteina MPI-CBG per la produzione del frammento zebrafish Fibronectin1, il personale della struttura pesce MPI-CBG per la cura e la manutenzione delle nostre linee di pesce e la funzione di microscopia ottica MPI-CBG per il supporto di immagini.

1. Prima di dissezione <ol><li> Il giorno prima della dissezione, di ottenere embrioni da un incross di coppie di zebrafish eterozigoti per l&#39;allele transgenico. <ol><li> Sollevare embrioni in E3 mezzo senza il blu di metilene a 28 ° C fino stadio scudo (6 ore dopo la fecondazione). </li><li> Trasferimento degli embrioni in E3 mezzo senza il blu di metilene a 20 o CO / N. A 20 ° C, gli embrioni si formeranno 1 somite per ora una volta raggiunta fase tailbud. Dopo 17-20 hr O / N a 20 o C, embrioni dovrebbero essere 5 a 8 somite scena la mattina seguente all&#39;inizio del protocollo dissezione. </li></ol></li><li> Montare strumenti e reagenti necessari per la dissezione. <ol><li> Pipetta di vetro del fuoco lucido per il trasferimento di embrioni e tessuti </li><li> Coppia di pinza sottile per la rimozione di chorions da embrioni </li><li> Sylgard rivestite piatto da 35 mm per dissezione - Versare Sylgard polimero in un piatto a 35 mm e curare O / N a 37 ° C. Effettuare la dissezione bene usandouna punta dell&#39;ago per rimuovere una piccola quantità di polimero polimerizzato. Il piatto può essere pulito e successivamente riutilizzato. </li><li> Appuntite, appiattite strumenti filo di tungsteno per la manipolazione dei tessuti PSM </li><li> Micro-bisturi per tagliare pezzi desiderati di PSM alla cultura </li><li> 35-mm piatto di plastica per tripsina incubazione </li><li> L15 terreno contenente siero bovino fetale al 10% </li><li> 0,25% di soluzione di tripsina / EDTA </li><li> Sigmacoted punte gel-carico per la dispersione </li><li> Capsule di Petri in plastica contenenti E3 mezzo senza il blu di metilene. </li></ol></li><li> Coprire piatto di imaging con fondo di vetro con Fibronectin1 substrato (10 mg / ml in PBS). Lascia piatto sul banco a cappotto durante la dissezione. </li><li> Utilizzare stereoscopio con opportuni filtri di fluorescenza per identificare ed embrioni transgenici liste positive (fase 5-8 somite). <ol><li> Identificare gli embrioni transgenici esaminando il mesoderma presomitic (PSM) per l&#39;espressione YFP nell&#39;ambito del canale di fluorescenza (Figura 1A). Fluorescenza shoULD essere visibile nella regione dall&#39;ultimo somite formata per il tailbud. Selezionare embrioni con brillanti del segnale; Il 25% della prole dovrebbe essere embrioni omozigoti che trasportano 2 copie del transgene. Il numero di embrioni necessari individuati varia in base dell&#39;esperimento. Un pezzo tailbud sezionato produrrà cellule 1.000, in media. Tipicamente, alcuni embrioni supplementari positivi sono utili nel caso si commettono errori durante la dissezione. </li><li> Utilizzare luce trasmessa come riferimento posizionale di distinguere un autofluorescenza, soprattutto nella cella tuorlo, dal segnale. </li><li> Trasferire gli embrioni positive per un piatto di plastica Petri separato contenente E3 mezzo senza il blu di metilene. </li></ol></li></ol> 2. PSM Dissection e Dispersione <ol><li> Preparare gli embrioni per la dissezione. <ol><li> Sotto un microscopio dissezione, utilizzando una pinza sottile, rimuovere con cautela il corion da ogni embrione nel mezzo E3. Fare attenzione a non danneggiare l&#39;embrione o interrompere la cella tuorlo. </li&gt; <li> Riempire Sylgard rivestite dissezione piatto con L15 media con siero. Utilizzando pinze o altro strumento piatta, eliminare eventuali bolle d&#39;aria dalla superficie del Sylgard. </li><li> Trasferire gli embrioni dechorionated utilizzando il vetro pipetta incendio lucidato al piatto dissezione. </li><li> Utilizzando gli strumenti di filo, spostare tutti gli embrioni ad un lato del piatto dissezione. </li></ol></li><li> Sezionare PSM da un singolo embrione. <ol><li> Orient un singolo embrione su un fianco laterale nel piccolo ben fatta nello strato Sylgard nel piatto dissezione (Figura 1B). </li><li> Utilizzando il micro-bisturi, fetta attraverso l&#39;embrione e cellule tuorlo solo anteriore al hindbrain e attraverso il polo ventrale dell&#39;embrione (Figura 1B, linea tratteggiata rossa). </li><li> Rimuovere il pezzo anteriore dell&#39;embrione dal pozzo, allontanandola al lato del piatto, e quindi utilizzare gli strumenti di filo per raschiare rimanenti granuli delle tuorlo dalla sezione posteriore compresa la PSM. </li><li>Una volta che il tuorlo è stata raschiata via, appiattire e orientare il PSM con l&#39;estremità anteriore che punta lontano dalla sperimentatore e la parte posteriore rivolta verso la sperimentatore (Figura 1C). </li><li> Se il sottile strato di ectoderma non ha tirato fuori da questo punto, utilizzare gli strumenti di filo per sbucciare lontano dalla parte superiore del tessuto PSM. </li><li> Utilizzando il micro-bisturi tagliare il tailbud, la punta più posteriore del PSM oltre la fine della notocorda, lontano dal resto del tessuto (Figura 1C, linea tratteggiata rossa). NOTA: Altri pezzi di tessuto dal PSM, per esempio anterior PSM più vicino al ultimo somite formata, possono anche essere presi in coltura, a seconda della domanda sperimentale. </li><li> Spostare il pezzo tailbud ad un angolo del piatto lontano dalla zona dissezione. Utilizzare gli strumenti di filo per eliminare eventuali residui e del tessuto embrionale indesiderato dal campo dissezione. </li><li> Ripetere con la prossima embrione. </li></ol></li><li> Pezzi Pool tailbud da aerei embryos, a seconda di quanti cellule saranno necessari per l&#39;esperimento. In media, un unico pezzo di tessuto tailbud produce cellule 1.000. </li><li> Riempire vuoto piatto di plastica da 35 mm con un piccolo volume di tripsina-EDTA. </li><li> Utilizzando la pipetta di vetro fuoco lucido, trasferire brani tailbud da dissezione piatto in piatto contenente tripsina / EDTA. Incubare pezzi tailbud in tripsina / EDTA per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Mentre il tessuto viene incubata in tripsina, rimuovere la soluzione Fibronectin1 dal piatto di imaging fondo trasparente. <ol><li> Lavare la soluzione di vetro 3 volte con acqua MilliQ. Utilizzare aspirazione per rimuovere ogni lavaggio e garantire il piatto è completamente asciutto. </li></ol></li><li> Disperdere pezzi tailbud in mezzo per l&#39;imaging. <ol><li> Aggiungere 100 ml di L15 mezzo con siero nel piatto imaging. </li><li> Utilizzando una punta gel rivestito, rimuovere i pezzi tailbud dalla tripsina / EDTA in piccolo volume possibile. </li><li> Pipettare i pezzi tailbud nel terreno nellapiatto di imaging. Pipettare i pezzi su e giù più volte per rompere loro parte e sospendere le cellule nel mezzo. Fare attenzione a non introdurre bolle d&#39;aria. Verificare la presenza di grumi di cellule sotto il microscopio e disperdere più come necessario. </li><li> Consentono alle cellule disperse in sospensione di depositarsi sul vetro Fibronectin1 rivestite per 20 minuti a RT. </li></ol></li><li> Aggiungere una piccola quantità di ulteriore mezzo L15 con siero alle cellule prima di iniziare imaging. Fare attenzione a non distruggere le cellule stanziali. </li><li> Data la domanda sperimentale, aggiungere qualsiasi supplementare o trattamenti farmacologici per la cultura. </li></ol> 3. Imaging di cellule disperso PSM <ol><li> Istituito piatto di imaging in camera a temperatura sul microscopio time-lapse imaging. Impostare Warner camera alla temperatura desiderata per l&#39;esperimento. Lasciare piatto per stabilizzare almeno 30 min prima di iniziare l&#39;acquisizione delle immagini. Temperatura crosscheck con sonda di temperatura esterna posta nel piatto, se necessario. NOTA: a causail rapporto tra temperatura e tasso somitogenesis 21 Controllo temperatura stabile è essenziale per misure accurate di periodo in singole cellule PSM. </li><li> Acquisire immagini test del canale di fluorescenza per verificare che il tempo di esposizione e guadagno forniscono una vasta gamma dinamica di intensità senza saturazione per assicurare un buon segnale a livelli di rumore. Una tipica immagine di fluorescenza acquisita da cellule disperse generate dalle nostre linee di usare questo protocollo richiede 400 msec e 40 msec per un&#39;immagine luce trasmessa con una macchina fotografica EMCCD opera a un guadagno EM di 85 anni. Inoltre, l&#39;aumento di pre-amp e la velocità di lettura dal fotocamera sono anche essenziali per massimizzare il segnale su rumore. </li><li> Utilizzando il canale di luce trasmessa, scegliere i campi di cellule per l&#39;acquisizione time-lapse. </li><li> Eseguire protocollo di acquisizione time-lapse per la lunghezza di tempo desiderato. <ol><li> Acquisire una sola immagine di fluorescenza per campo luce trasmessa e. NOTA: Impostare un intervallo tra ro di acquisizioneONDI che catturerà dinamiche temporali senza fotometabolismo over di imaging avanzata o tossicità indurre nelle cellule. Questo protocollo utilizza un intervallo di 2 min. </li></ol></li><li> Controllare time-lapse set-up di tanto in tanto durante la registrazione per garantire che le cellule rimangano a fuoco, nessun software o hardware errori, ecc </li></ol> 4. Elaborazione delle immagini acquisite di Time-lapse Movies <ol><li> Apri file film per un campo acquisita in un software di elaborazione delle immagini. NOTA: Fiji è stato utilizzato per tutte le elaborazioni in questo protocollo. <ol><li> Split luce trasmessa e fluorescenza fotogrammi da un campo per creare 2 pile di immagini. </li></ol></li><li> Traccia una singola cella nel canale luce trasmessa. <ol><li> Posizionare un ROI circolare (regione di interesse) intorno alla cella selezionata nel primo fotogramma nel canale luce trasmessa. NOTE:.. Solo le cellule che 1 sono sane alla fine della registrazione, 2 non si muovono al di fuori del campo, e 3 non entrano in contatto con altri ce.LLS sono monitorati. </li><li> Salvare un ROI ogni pochi fotogrammi al gestore ROI. Traccia cella fino all&#39;ultimo fotogramma. </li></ol></li><li> Misurare l&#39;intensità utilizzando i ROI salvate sul canale di fluorescenza. <ol><li> Selezionare la pila fluorescenza e con il ROI salvato, utilizzare il cerchio personalizzato interpolatore plug-in e macro per misurare l&#39;intensità della cella monitorati nel tempo. </li><li> Controllare la traccia uscita dalla macro. Se la traccia cattura qualitativamente le caratteristiche di fluorescenza time-lapse, esportare i valori da un foglio di lavoro di Excel. </li><li> Salvare la lista ROI per la cella. </li></ol></li><li> Ripetere inseguimento in canale trasmesso e misurare in canale di fluorescenza di altre cellule del settore. </li><li> Ripetere tutti i passaggi per ulteriori campi dall&#39;esperimento. </li></ol>

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S., Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+acts+directly+on+organs+and+cells+in+culture+to+set+the+vertebrate+circadian+clock.">Light acts directly on organs and cells in culture to set the vertebrate circadian clock.</a> Nature. 404, 87-91 (2000).</li><li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation.">A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, 222-225 (1126).</li></ol>

Contributi Autore: ABW sviluppato e affinato la dispersione, la cultura, l&#39;imaging, e protocolli di monitoraggio delle cellule. DS ha generato le linee transgeniche e ha curato la progettazione del microscopio a fluorescenza time-lapse utilizzato in questo protocollo. AO pioniere esperimenti iniziali proof-of-principio di dissociarsi e le cellule immagine PSM in coltura. JS ha scritto lo strumento plug-in cerchio interpolatore in Fiji utilizzato per misurare l&#39;intensità di fluorescenza da filmati time-lapse. ABW e ACO ha scritto il manoscritto.

Per studiare un processo cellulare che avviene nel corso dello sviluppo embrionale, biologi utilizzano tipicamente un approccio nel contesto dell&#39;intero embrione. Tuttavia, per comprendere appieno come una singola cellula si comporta in un lasso di tempo di sviluppo, un metodo per esaminare e perturbare le singole celle di isolamento è anche estremamente utile. Generando colture cellulari PSM dispersi utilizzando embrioni transgenici zebrafish ora abbiamo uno strumento per studiare direttamente la natura autonoma delle cellule di oscillazioni genetiche orologio segmentazione in modo quantitativo. E &#39;possibile misurare dinamica delle oscillazioni nel nostro reporter fluorescente in centinaia di cellule in una varietà di condizioni. Il periodo osservato di singole cellule in coltura è più lungo del periodo somitogenesis nell&#39;embrione intatta. Osserviamo che un espianto PSM intatta nella cultura espone anche oscillazioni più lenti della embrione intatto (dati non mostrati), suggerendo that il periodo più lungo osservato in cellule isolate non è semplicemente a causa di danni da dispersione. Un periodo ed ampiezza variabili sono osservati in più di una serie temporale della singola cellula. La fonte di questa variabilità non è nota, ma dovrebbe rivelare importanti dettagli su circuiti ritmo, rendendo il dell&#39;orologio segmentazione. Con questo metodo possiamo studiare le componenti genetiche di segmentazione a livello cellulare, e le domande di indirizzo che sono difficili da esaminare l&#39;intero embrione. Ad esempio, per aggiunta controllata di molecole conosciute segnalazione trovati negli embrioni alle nostre culture, possiamo esaminare i loro effetti sul singolo oscillatore cellulare PSM in un saggio robusto e riproducibile. Il nostro sistema di coltura PSM apre le porte ad una rigorosa valutazione di quali fattori, da soli o in combinazione promuovere oscillazioni in queste cellule, quali fattori inibiscono queste oscillazioni, e per testare l&#39;interazione tra tali molecole. Con questi strumenti in mano, ci proponiamo divalutare i modelli esistenti di somitogenesis che si basano su dati a livello di tessuto pubblicati, così come l&#39;uso sono risultati in singole cellule di generare previsioni che possono essere testati in tutto embrione. A nostra conoscenza, questo è il primo protocollo di coltura cellulare primaria zebrafish per acuti registrazione time-lapse della fluorescenza in singole cellule; ulteriore sviluppo e perfezionamento di questo protocollo è senza dubbio possibile. Altri protocolli spesso utilizzano embrioni di zebrafish per generare linee cellulari stabili che possono essere trasfettate con i reporter ed utilizzate per l&#39;imaging a lungo termine 27-29. Mentre le linee stabili sono utili per l&#39;imaging di un processo che non è legata a tempi di sviluppo, come l&#39;orologio circadiano, la questione della segmentazione embrionale richiede dell&#39;immagine immediata mentre le cellule sono ancora nella loro oscillatorio, stato progenitore. Una volta che le cellule smettono di oscillare, assumono un destino cellula differenziata, e quando nel tessuto, dovrebbe essere incorporata in un somite. E &#39;possible che con il fattore di destra o fattori presenti in vitro da poter generare PSM-come le linee di zebrafish coltura cellulare che rimarrebbero oscillatorio, consentendo significativamente osservazioni a lungo termine, più perturbazioni sequenziali, o screening ad alto rendimento. Ci aspettiamo che questo metodo di preparazione di colture primarie di cellule disperse per l&#39;imaging time-lapse è particolarmente adatto per lo studio di ogni processo cellulare che si verifica entro un lasso di tempo di sviluppo che non è accessibile utilizzando linee cellulari di zebrafish stabili. L&#39;isolamento di diversi tipi di cellule a stadi di sviluppo distinti da adeguate linee giornalista transgeniche, sia attraverso la dissezione o tramite FACS dopo dissociazione embrionale, potrebbe fornire le cellule di partenza. Alcuni ottimizzazione delle condizioni di coltura, guidati dalla origine embrionale delle cellule, può essere richiesto. Combinando questo protocollo flessibile e sensibile con la rapida crescita collezione di zebrafish transgenicolinee, speriamo di facilitare un approccio evolutivo vitro in biologia che è complementare ai metodi genetici e embriologici classici.

La formazione periodica dei segmenti lungo l&#39;asse del corpo vertebrati, o somitogenesis, è la prova di un oscillatore spaziale e temporale negli embrioni. Il meccanismo favorito controllo somitogenesis è concettualmente descritto da un modello &quot;orologio e fronte d&#39;onda&quot; 1, in cui il &quot;clock&quot; costituito da oscillatori cellulari, ora pensato per essere guidato intracellulare dall&#39;espressione ritmica di una serie di geni ciclici 2, scandisce la formazione dei somiti dal mesoderma presomitic (PSM). Come l&#39;embrione si sviluppa, una maturazione &quot;fronte d&#39;onda&quot; nel PSM muove di concerto con il tessuto regressione verso la parte posteriore, rallentando e arrestando oscillatori cellulari che passa 3. Insieme, questo sistema spatiotemporally dinamico è definito l&#39;orologio segmentazione. Gli attuali approcci per studiare l&#39;arco dell&#39;orologio segmentazione tre livelli crescenti di organizzazione del oscillatore genetica in cellule singole a th accoppiamento localia verifica tra le cellule e, infine, alla regolamentazione globale delle informazioni di posizione nel collettivo tessuto PSM 4. Precedenti studi suggeriscono la segmentazione oscillatore cellula-autonoma in zebrafish consiste di geni e prodotti proteici dalla trascrizione suoi / hes factorfamily, che si pensa a formare un anello di retroazione negativa attraverso la repressione trascrizionale 5-7. La via di segnalazione Delta / Notch sincronizza le oscillazioni tra cellule vicine e regola il periodo collettiva della popolazione 8-10. FGF segnalazione molecole prodotte in tailbud sembrano costruire un gradiente di tutti i zebrafish PSM, e sono quindi ipotizzato di contribuire a rallentare e arrestare le cellule oscillanti nel anteriore 11. Fino ad ora, i ruoli funzionali di ciascuna di tali molecole in somitogenesis sono stati studiati da mutazione genetica, iniezione morfolino, heat-shock sovraespressione e antagonista farmaco Treatimento di componenti e di segnalazione tra le cellule 5,7,10,12 di clock. Utilizzando queste perturbazioni, funzione orologio segmentazione è stato dedotto dalle descrizioni a livello di tessuto di difetti somite e la perdita di oscillazioni uniformi nell&#39;espressione dei geni ciclici come HER1, her7, e delta C. Tuttavia, quasi tutti questi dati sono da embrioni fisse e non riescono a cogliere con precisione i cambiamenti che sono inerenti alla funzione dinamica del clock segmentazione. Più di recente, multiple-embrione time-lapse imaging ha rivelato i primi mutanti con periodo oscillatore alterato, ma queste osservazioni sono state anche fatta al 7,13 livello tissutale. Pertanto, non è stato osservato il comportamento dell&#39;oscillatore cellula-autonoma ipotizzato durante somitogenesis. Istantanee statiche di somitogenesis danno un quadro incompleto perché, intrinsecamente, il processo è guidato da un sistema oscillatorio. In precedenza il lavoro in cellule di topo e pulcino ha mostrato che i livelli di trascrizionee l&#39;aumento delle proteine ​​e la caduta, ma il campionamento un&#39;oscillazione di circa 2 ore ogni 30 o 45 min limita necessariamente i dati raccolti e quindi le conclusioni che si possono trarre 14,15. Studio di altri oscillatori biologici, in particolare, orologi circadiani, si è allontanato dalle misure messe in scena di espressione genica e proteica di monitoraggio in tempo reale utilizzando fluorescenti e reporter bioluminescenti 16,17. Questi strumenti sono essenziali per dimostrare le proprietà di clock di singole cellule 18. Un reporter bioluminescenti del gene ciclico Hes1 è stato sviluppato e brevemente caratterizzato singole cellule topo PSM 19. Il periodo e la varianza media sono stati calcolati per un piccolo numero di cellule, mostrando che le oscillazioni persistono per più cicli in vitro. Tuttavia, questi studi non hanno quantitativamente affrontare la stabilità e robustezza della frequenza dell&#39;oscillatore e ampiezza, se le cellule possono entrare spontaneamente o oscillazioni di uscita,e come le cellule mantengono le loro relazioni di fase. Inoltre, gli effetti di molecole di segnalazione presenti nell&#39;embrione sull&#39;orologio cellula-autonoma non sono stati testati direttamente. Di conseguenza, queste proprietà fondamentali dell&#39;oscillatore singola cellula rimangono completamente sconosciuta. Abbiamo recentemente sviluppato linee di pesci transgenici con BAC recombineering 20 a guidare Venere (YFP) reporter di fluorescenza di espressione HER1 30. Tali linee sfruttano gli spunti normativi del locus cromosomico integro in cui sono incorporati e ricapitolano le dinamiche temporali e modello spaziale di HER1. Questa innovazione consente il monitoraggio in tempo reale di espressione genica nell&#39;embrione zebrafish sviluppo in vivo. Per studiare le proprietà fondamentali delle oscillazioni cellule autonome e come tale espressione è regolata nel corso del tempo, abbiamo recentemente sviluppato un metodo affidabile per isolare e registrare da cellule PSM in vitro. Questo protocol descrive come abbiamo utilizzato le nostre linee giornalista transgeniche per produrre colture di cellule disperse, da cui possiamo caratterizzare le oscillazioni del clock segmentazione zebrafish in celle singole. Possiamo quindi affrontare domande in sospeso nel campo non accessibili con analisi statica o livello tissutale, nonché manipolare direttamente l&#39;orologio segmentazione a livello di singola cellula con molecole di segnalazione e inibitori.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescence microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>Model: SZX16</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Epifluorescence microscope</td>
 <td>X-cite Illumination</td>
 <td>Series: 120Q</td>
 <td ></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>Model: SZX12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps no. 55</td>
 <td>Fine Science Tools</td>
 <td>11295-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass transfer pipettes</td>
 <td>Assistent</td>
 <td>567/2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>35 mm plastic petri dishes</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>627102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>60 mm plastic petri dishes</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>628102</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard polymer</td>
 <td>SASCO</td>
 <td>266727</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manipulation tools</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td></td>
 <td>For description of manipulation tools Ref. 22</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsurgical knife</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>500249</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L15 medium</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>57322</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Penicillin/streptomyocin</td>
 <td>PAA</td>
 <td>P11-010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fetal bovine serum</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>257322</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.05% trypsin / 0.02% EDTA</td>
 <td>PAA </td>
 <td>L11-004</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gel loading tips</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>253188</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sigmacote</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>254589</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micropipette set</td>
 <td>Gilson International</td>
 <td>F167300</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Zebrafish Fibronectin1 70 kD fragment</td>
 <td>MPI-CBG protein facility</td>
 <td></td>
 <td>Generated in-house from construct based on previously published work Ref. 23-25</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom imaging dishes</td>
 <td>Mattek (single well)</td>
 <td>P35G-1.5-14-C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass bottom imaging dishes</td>
 <td>Greiner (CellView -multi-well)</td>
 <td>262502</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E3 medium without methylene blue</td>
 <td>Made in-house</td>
 <td></td>
 <td>From The Zebrafish Book, 5th Ed. Ref. 26 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic transfer pipettes</td>
 <td>Ratiolab</td>
 <td>260011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Warner heating/cooling chamber</td>
 <td>Warner Instruments</td>
 <td>TC-324B/344B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EM-CCD camera</td>
 <td>Andor</td>
 <td>Model: iXOn 888</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Model: Axiovert 200M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td></td>
 <td>NeoFluor 40x, NA 0.75</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>Lumencor Light Engine</td>
 <td>Model: Spectra X</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Wide-field fluorescence microscope with Venus filter set</td>
 <td>BrightLine HC 575/15</td>
 <td>F39-575</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

generation of dispersed presomitic mesoderm cell cultures for imaging of the zebrafish segmentation clock in single cells

La segmentazione è un processo morfogenetico periodica e sequenziale nei vertebrati. Questa formazione ritmica di blocchi di tessuto chiamato somiti lungo l&#39;asse del corpo è la prova di un oscillatore genetica patterning embrioni. In zebrafish, il intracellulare orologio segmentazione di guida è composto da membri del suo / Hes fattore di trascrizione della famiglia organizzata in cicli di feedback negativo. Abbiamo recentemente generata transgenici linee reporter fluorescente per la HER1 gene ciclico che ricapitolare il modello spazio-temporale delle oscillazioni nel mesoderma presomitic (PSM). Utilizzando queste linee, abbiamo sviluppato un sistema di coltura in vitro che permette l&#39;analisi in tempo reale di segmentazione oscillazioni orologio entro singolo, isolato cellule PSM. Rimuovendo il tessuto PSM da embrioni transgenici e quindi disperdere le cellule da oscillante regioni su piatti con fondo di vetro, abbiamo generato culture adatti per time-lapse imaging del segnale di fluorescenza dacelle di clock individuali. Questo approccio fornisce un quadro sperimentale e concettuale per la manipolazione diretta del clock di segmentazione con risoluzione unicellulare senza precedenti, consentendo sue proprietà cellule autonome ea livello di tessuto distinguere e sezionati.

Questo protocollo produce culture, dispersi, singole cellule PSM vitali per time-lapse imaging del segnale di fluorescenza (Figura 2). Il nostro transgene genera un reporter la cui ciclo di produzione e degradazione avviene con dinamiche simili al gene endogeno e proteine ​​nell&#39;embrione, dell&#39;ordine di mezz&#39;ora. Grazie alla sua fatturato veloce, il segnale YFP in singole cellule dovrebbe essere rilevata rapidamente per minimizzare sbianca e con un&#39;alta risoluzione temporale per acquisire le caratteristiche di ogni ciclo oscillatorio. Inoltre, data la relativa oscurità del segnale, condizioni di coltura e di acquisizione sono stati messi a punto per garantire risultati sensibili e robusti. Abbiamo trovato i seguenti fattori per essere importanti nella generazione di colture cellulari PSM ottimali per l&#39;imaging:. 1 un substrato ECM utilizzato per rivestire i piatti della cultura fondo di vetro. 2. Aggiunta di siero per la dissezione e mezzo di imaging. 3. Dissezione del PSM da embrioni identificati adottate dopo l&#39;accoppiamento hetecoppie rozygous, la cui prole potenzialmente portare 2 copie del transgene. 4. Acquisizione dell&#39;immagine entro un intervallo ottimale di ingrandimento, con obiettivo NA superiore per garantire la cattura efficace del segnale di fluorescenza. 5. Illuminazione con una sorgente di luce a stato solido per ridurre al minimo le fluttuazioni di intensità che potrebbero contribuire al rumore di fondo. 6. Rilevamento del segnale con una telecamera EM-CCD altamente sensibile per massimizzare il segnale di lettura. Culture sub-ottimali conterranno cellule che non rimangono arrotondate e sano per tutta la registrazione. Abbiamo ipotizzato che il substrato ECM, un frammento di fibronectin1 zebrafish mantiene le cellule in uno stato PSM simile indifferenziata, in confronto ad altri substrati comunemente usati come poli-lisina o laminina. Altri substrati abbiamo testato causati cellule per appiattire sul vetro e la perdita del segnale fluorescente oscillante nel corso della registrazione. Abbiamo anche trovato che l&#39;aggiunta di siero al mezzo durante la dissezione, la dispersione,e la registrazione è stata importante non solo per placare la tripsina utilizzato per la dissociazione, ma anche aumentato l&#39;intensità di fluorescenza su sfondo, probabilmente a causa di una maggiore vitalità cellulare. Per garantire la cattura ottimale del segnale da singole cellule abbiamo usato un obiettivo 40x specificamente progettato per l&#39;imaging di fluorescenza (Zeiss Plan serie NeoFluor) con un elevato NA. Abbiamo anche trovato che una sorgente di luce a stato solido disponibile un&#39;illuminazione più stabile rispetto alle lampade al mercurio tradizionali, che è fondamentale per ridurre al minimo le fluttuazioni di fondo che contribuiscono alle immagini rumorose. Queste modifiche sono importanti per garantire risultati affidabili. Usando questo protocollo prevediamo culture in cui la maggior parte delle cellule in un dato campo sono fluorescenti ad un certo punto durante la registrazione. Troviamo che le cellule fluorescenti in genere rimangono arrotondate e si sono volte piuttosto mobili durante le registrazioni. Alcune cellule, comprese le cellule fluorescenti, possono diventare apoptotica durante la registrazione. Queste cellule sono esclusi da qualsiasi unaANALISI. Abbiamo anche escludere le cellule che entrano in contatto con altre cellule o spostare al di fuori del campo di vista. In media, si vede una riduzione del 12% del numero di cellule per campo dalla fine della registrazione 10 hr misurata contando il numero di cellule sane nel canale luce trasmessa. Tale perdita include sia la morte cellulare e le cellule che hanno spostato fuori dal campo. Alla luce di questi avvertimenti che possiamo, in media, pista 5 cellule fluorescenti per campo che rimangono vitale e visibile, e in genere registrare 6 campi per condizione. Ad esempio, un esperimento con 4 condizioni avrà 24 campi in totale acquisiti e in genere di circa 30 cellule monitorati per condizione. In condizioni di imaging standard con L15 terreno contenente siero fetale bovino al 10%, troviamo che le cellule PSM (n = 101 celle da 4 repliche sperimentali) in grado di produrre tra i 2 ei 7 vette, con la media e la deviazione standard di 3 ± 1 picchi (2 cicli -3). Il numero di picco mediano, così come il percentile 25%, è 2 picchi e il 75% percentile is 3 cime. Utilizzando il nostro monitoraggio e l&#39;analisi semi-automatico, siamo in grado di generare rapidamente intensità di fluorescenza su tracce di tempo per le singole celle PSM, con una traccia di cellule rappresentante mostrato in Figura 2C. Queste tracce prime possono poi essere utilizzati per effettuare misurazioni quantitative di proprietà delle cellule PSM oscillanti, come frequenza, ampiezza, numero di cicli, e la tempistica dei picchi. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50307/50307fig1.jpg" /> Figura 1. Identificazione di embrioni transgenici e gli schemi della loro dissezione. (A) Vista laterale di un embrione di zebrafish transgenico che esprime YFP fluorescenza a ~ fase 5-somite. L&#39;immagine è una sovrapposizione di luce trasmessa e il canale di fluorescenza. Le frecce indicano le aree di segnale Partendo dalla punta del tailbud, in tutto il PSM, verso l<html> ast somite formato. Inserto mostra uno schema del transgene reporter (per maggiori informazioni sul suo sviluppo e il comportamento in vivo riferimento a Soroldoni et al. 30. (B) Schema di vista laterale dell&#39;embrione prima di tagliare per primo durante la dissezione. Linea rossa tratteggiata indica il primo taglio realizzato attraverso il hindbrain, anche se la cella tuorlo appena dietro il tailbud. (C) Rappresentazione schematica di appiattita PSM dopo la rimozione di granuli di tuorlo e lo strato epidermico, orientato lungo l&#39;asse anteriore-posteriore. linea rossa tratteggiata indica il secondo taglio per rimuovere la punta del tailbud per la dispersione e la cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig1highres.jpg" target="_blank">cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 07fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Immagini rappresentative e le tracce di una singola cella in una cultura PSM disperso. (A) Montaggio di trasmettere immagini chiare di una singola cella PSM in un 6-ore di registrazione time-lapse. Si noti che la cella rimane arrotondate e vitalità nel corso della registrazione. (B) corrispondente montaggio di immagini di fluorescenza da una singola cellula PSM. Picchi di intensità della cella sono numerati nel corso della registrazione. (C) intensità media nel tempo misurato da un ROI posto su questa cella. I valori sono presi da ogni fotogramma da un filmato con un frame rate di uno per 2 min utilizzando il plug-in cerchio interpolatore e macro personalizzato scritto in Fiji. Picchi di intensità sono di nuovo numerate in tutta la traccia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50307/50307fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Somitogenesis è un processo di sviluppo ritmico che spazialmente modelli l&#39;asse del corpo di embrioni dei vertebrati. In precedenza, abbiamo sviluppato linee di zebrafish transgenico che usano i giornalisti fluorescenti ad osservare i geni ciclici che guidano questo processo. Qui, la cultura dispersi cellule da queste linee e l&#39;immagine dei loro oscillazioni nel corso del tempo in vitro.

Generazione di Dispersi Presomitic mesoderma colture cellulari, per Immagini del Zebrafish segmentazione Orologio in celle singole

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

generation-dispersed-presomitic-mesoderm-cell-cultures-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K Views.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics.  Somitogenesis è un processo di sviluppo ritmico che spazialmente modelli l'asse del corpo di embrioni dei vertebrati. In precedenza, abbiamo sviluppato linee di zebrafish transgenico che usano i giornalisti fluorescenti ad osservare i geni ciclici che guidano questo processo. Qui, la cultura dispersi cellule da queste linee e l'immagine dei loro oscillazioni nel corso del tempo in vitro. 

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Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Ricerca

Biologia

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

In elettroporazione in vivo di Morpholinos nella Adult Regenerating Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generazione di topi derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks (reviewed1,2). The circadian time-keeping system is a hierarchical multi-oscillator network, with the central clock located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) synchronizing and coordinating extra-SCN and peripheral clocks elsewhere1,2. Individual cells are the functional units for generation and maintenance of circadian rhythms3,4, and these oscillators of different tissue types in the organism share a remarkably similar biochemical negative feedback mechanism. However, due to interactions at the neuronal network level in the SCN and through rhythmic, systemic cues at the organismal level, circadian rhythms at the organismal level are not necessarily cell-autonomous5-7. Compared to traditional studies of locomotor activity in vivo and SCN explants ex vivo, cell-based in vitro assays allow for discovery of cell-autonomous circadian defects5,8. Strategically, cell-based models are more experimentally tractable for phenotypic characterization and rapid discovery of basic clock mechanisms5,8-13.
Because circadian rhythms are dynamic, longitudinal measurements with high temporal resolution are needed to assess clock function. In recent years, real-time bioluminescence recording using firefly luciferase as a reporter has become a common technique for studying circadian rhythms in mammals14,15, as it allows for examination of the persistence and dynamics of molecular rhythms. To monitor cell-autonomous circadian rhythms of gene expression, luciferase reporters can be introduced into cells via transient transfection13,16,17 or stable transduction5,10,18,19. Here we describe a stable transduction protocol using lentivirus-mediated gene delivery. The lentiviral vector system is superior to traditional methods such as transient transfection and germline transmission because of its efficiency and versatility: it permits efficient delivery and stable integration into the host genome of both dividing and non-dividing cells20. Once a reporter cell line is established, the dynamics of clock function can be examined through bioluminescence recording. We first describe the generation of P(Per2)-dLuc reporter lines, and then present data from this and other circadian reporters. In these assays, 3T3 mouse fibroblasts and U2OS human osteosarcoma cells are used as cellular models. We also discuss various ways of using these clock models in circadian studies. Methods described here can be applied to a great variety of cell types to study the cellular and molecular basis of circadian clocks, and may prove useful in tackling problems in other biological systems.

Circadian clocks function within individual cells, i.e., they are cell-autonomous. Here, we describe methods for generating cell-autonomous clock models using non-invasive, luciferase-based real-time bioluminescence technology. Reporter cells provide tractable, functional model systems for studying circadian biology.

Monitoraggio Cell-autonome Ritmi orologio circadiano di espressione genica mediante bioluminescenza Reporter luciferasi

In mammals, many aspects of behavior and physiology such as sleep-wake cycles and liver metabolism are regulated by endogenous circadian clocks ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nefrotossina microiniezione in Zebrafish per creare un modello danno renale acuto

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Analisi della funzione Beta-cellulare usando la formazione immagine del calcio cella singola risoluzione in Zebrafish isolotti

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Sondare la cinetica dell'mRNA nello spazio e nel tempo in Escherichia coli utilizzando la fluorescenza a singola molecola a due colori in ibridazione situ

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...