Una cultura di espianto della coda 3D per studiare la segmentazione dei vertebrati nel pesce zebra

Le esti piante di coda di zebrafish 3D sfruttano la trasparenza degli embrioni di zebrafish nella sua piena misura durante lo sviluppo di somite e la segmentazione dei vertebrati. Riempire un serbatoio di accoppiamento vuoto con acqua del sistema di pesci. Pulire il filtro con acqua di sistema.

Innalza le barriere tra le coppie di accoppiamento. Spostare selettivamente la coppia di pesci nel serbatoio dell'acqua dolce. Raccogliere embrioni nel colino attraverso trasferimenti d'acqua con un serbatoio vuoto.

Risciacquare gli embrioni raccolti con acqua del sistema ittico e capovolgere una piastra di Petri. Strumenti di dissezione etanolo-smalto. Creare due livelli di nastri sulle diapositive.

Tagliare i lati orizzontali delle camere profonde. Tagli completi della camera con lati verticali. Rimuovere il nastro dalla superficie della camera.

Versare i mezzi di coltura cellulare in un tubo. Mescolare cloruro di calcio 2,8 millimolare concentrazione finale. Aggiungere una soluzione antibiotica.

Mezzi di dissezione aliquota in un tubo separato. Completare il siero bovino fetale per rendere il mezzo di coltura tissutale. De-corrinare embrioni con aghi.

Risciacquare gli embrioni in un piatto d'acqua dolce e raccoglierli per l'espianto. Stabilizzare l'embrione con l'ago e iniziare a snodiare. Taglia i tessuti rimanenti.

Trasferire gli espianto sul coverslip. Appiattire il tessuto e succhiare i mezzi in eccesso con pipetta. Mettere il coverslip sul mezzo di crescita contenente la camera scorrevole.

Metti il tessuto explant su una salvietta tissutale. Applicare l'olio ad immersione all'obiettivo. Montare la camera scorrevole al microscopio.

Regolare i canali laser per l'acquisizione delle immagini. Controllare i limiti del livello Z del campione. Impostare i livelli di time-imaging e z-

Il sistema di espianto della coda 3D mantiene intatta l'integrazione cellulare al bocciolo di coda e l'allungamento in eccesso come interi embrioni. È anche possibile fermare l'allungamento in eccesso attivando chimicamente la superficie con collagene di tipo uno. Il sistema di espianto della coda di zebrafish 3D ci consente di sfruttare la trasparenza degli embrioni di zebrafish permettendoci di scattare immagini di microscopia ad alta risoluzione e quasi oggettive.

Oltre a ciò, ci consente di disaccoppiare l'eccesso di allungamento dalla segnalazione del morfogeno e anche di controllare le sorgenti di segnalazione del morfogeno con semplici metodi di dissezione.