Siamo grati per il sostegno del NIH (numeri di aggiudicazione R00 NS072192 a MKL, HD029178 a AS.L., e 2 RO1 NS032457 a CAW). MKL è il destinatario l&#39;Ospedale dei Bambini di Boston Career Development Fellowship / Harvard Fellowship Shore Medical School e membro della Alfred P. Sloan Foundation. CAW è un ricercatore del Howard Hughes Medical Institute.

1. Embryo Isolamento / Preparazione Questa tecnica può essere utilizzata per topo o ratto. In questo protocollo si dimostra la tecnica di raccolta QCS e cerebrale dissezione espianto corticale con cervello di topo embrionale. Ci osservazioni su eventuali differenze importanti rispetto a ratti topi che esistono all&#39;interno delle tecniche generali. Per il sistema embrionale stadiazione età, E1 è classificato come il giorno della spina di ratti, e E0.5 è classificato come il giorno della spina di topi. <ol><li> Preparare un micro-dissezione piatto con elastomero Sylgard silicone. Sylgard 184 elastomero di silicone viene fornito come parte liquida a due componenti, parte A e parte B. Parte sono mescolati A e B parte in un rapporto di 10:1 in peso o volume. Dopo che i componenti liquidi vengono miscelati, versa l&#39;elastomero Sylgard in una piastra di Petri a coprire l&#39;intera superficie del piatto. Alcune bolle d&#39;aria possono essere presenti che dissipare durante il processo di polimerizzazione. Mettere il coperchio sulla piastra di Petri e lasciare che il elastomer per curare. L&#39;elastomero può essere indurita a temperatura ambiente per 24 ore, oppure a temperature più elevate (per esempio 37 ° C) per una più rapida polimerizzazione. Una volta che i componenti liquidi solidificano, il piatto dissezione è pronto all&#39;uso. Il piatto può essere usato ripetutamente per esperimenti multipli, a condizione che sia ben pulita dopo la procedura. </li><li> Preparazione del micro-pipetta capillare (ago). Micro-pipette capillari vengono preparati mediante l&#39;applicazione di calore e tirare con un PC-10 verticale estrattore micropipetta Narishige con le seguenti impostazioni: Un tiro passo; Heater # 2 impostato a 58, 100 g di peso tiro. La punta fine della micropipetta è attentamente spense con pregiati N ° 55 pinze. Il risultante diametro medio interno della cannula è 85 micron. </li><li> Preparare il gruppo aspiratore per l&#39;aspirazione CSF. Inserire micro-stantuffo provvista di micro-pipette capillari nell&#39;ago capillare. In alternativa, collegare un filtro di plastica monouso per la fine del gruppo del tubo aspiratore che è collegato to la micro-pipetta capillare. Spingere l&#39;ago attraverso la guarnizione in posizione sul lato opposto del gruppo aspiratore. </li><li> Trasferimento di embrioni isolati dalla cucciolata di un micro-dissezione piatto preparato con Sylgard. </li><li> Togliere le membrane extra-embrionali e tessuti in modo che l&#39;embrione è chiaramente esposta. Ogni strato di tessuto-prima la parete uterina e quindi la decidua, può essere sezionato con le forbici iridectomia fini (ad esempio strumenti per le scienze Belle # 15000-02). Ad ogni sito di impianto, la prima parete uterina, quindi la decidua può essere incisi parallelamente all&#39;asse lungo dell&#39;utero, e l&#39;incisione può essere aperto ulteriormente utilizzando una pinza sottile. La decidua può essere rimosso dopo un&#39;incisione simile, esponendo le membrane fetali. Si deve essere esercitato in modo che le membrane fetali non sono incise o perforato. </li><li> Lavare con soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) e rimuovere il liquido in eccesso dal embrione circostante utilizzando una pipetta e un Kimwipe o filtrocarta tagliata in triangoli. </li></ol> 2. Collezione ventricolare CSF <ol><li> Visualizzare embrione al microscopio dissezione: per mouse, l&#39;embrione deve essere che sul suo lato, in modo tale che si ha una vista sagittale dell&#39;embrione. Con embrioni di ratto E16 o più, posizionare l&#39;embrione sulla sua colonna vertebrale dorsale, lungo il suo dimensione planare, da un cranio in direzione caudale, come se l&#39;embrione è sdraiato sulla schiena. In questo modo il CSF può essere raccolto sia da destra e sinistra ventricolo laterale. </li><li> Costantemente inserire la micro-pipetta capillare nel ventricolo laterale, ventricolo mesencefalico o cisterna magna, tentando di non contattare le cellule neuroepiteliali volta la pipetta è stata inserita. Per E14.5 embrioni di topo o più, il CSF può essere aspirato dal ventricolo destro e quindi l&#39;ago rimosso e inserito nel ventricolo sinistro. A causa della pervietà dei ventricoli e il tubo neurale in embrioni più giovane di E14.5, ilintero volume del CSF può spesso essere aspirato dai ventricoli laterali con l&#39;inserimento di un ago singolo. Tuttavia, questo non è sempre il caso come tempi di sviluppo e la pervietà dei ventricoli collegamento può variare leggermente, e quindi, il micro-pipetta capillare può anche essere inserita nella cisterna magna per raccogliere il massimo volume CSF. </li><li> Una volta che il micro-pipetta capillare viene inserita nel ventricolo laterale, ventricolo mesencefalico o cisterna magna, attenzione e delicatezza iniziare l&#39;aspirazione del CSF nella pipetta, utilizzando il micro-stantuffo per creare pressione negativa e aspirare il CSF, o fornendo una leggera pressione negativa creata per via orale in modo tale che CSF inizia a fluire dolcemente nel micro-pipetta capillare in modo lento e controllato. Si raccomanda che lo spettatore controlla con propri funzionari locali in materia di politiche istituzionali di questi approcci. </li><li> Continuare ad applicare pressione negativa e raccogliere il liquor nella micro-capillare pipetta.In entrambi embrioni di topo e ratto di E16.5/E17 o più giovane, è possibile osservare il collasso ventricolo leggermente dalla comparsa di un divot formando sul lato della testa che il micro-pipetta capillare è dentro In anziane embrioni, a causa della maggiore dimensione del cervello, potrebbe non essere possibile osservare la testa collasso. </li><li> Interrompere l&#39;applicazione di pressione e rimuovere delicatamente la micro-capillare pipetta dal ventricolo laterale. </li><li> Delicatamente espellere il campione CSF in una provetta Eppendorf che è stata raffreddata su ghiaccio. </li><li> Continua la raccolta del QCS da una intera cucciolata di animali e in comune i campioni nel tubo stesso. </li><li> Centrifugare a 10.000 xg a 4 ° C per 10 minuti per eliminare cellule contaminanti. </li><li> Analizzare i campioni per eventuali segni di contaminazione cellule neuroepiteliali o globuli rossi. I segni di contaminazione sono di solito indicati dal fluido che appare torbida o rosso / rosa, o la presenza di un pellet con una macchia di sangue tinta. Dopo centrifugazione, il CSF possono essere esaminate al microscopio per le prove di cellule o detriti cellulari. Se ci sono segni di contaminazione del fluido deve essere eliminato. Come controllo aggiuntivo, il contenuto di pellet possono essere colorati per cellule. Un campione pulito CSF ​​può essere usato per la coltura cellulare, cultura corticale, spettrometria, western blot, ELISA, saggi e altri. Il QCS chiara dovrebbe essere trasferito in una nuova provetta sterile Eppendorf. Il campione può essere utilizzato per l&#39;analisi, in pool con altri campioni o SNAP congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C. Il congelamento e lo scongelamento di piccoli campioni di fluido può provocare una diminuzione piccolo volume e cambiamenti nella concentrazione di proteina. Ciò può essere evitato liofilizzazione dei campioni. </li></ol> 3. Espianto Dissection corticale <ol><li> Trasferire la E14.5 embrione isolato dalla cucciolata su un micro-dissezione piatto preparato con Sylgard. </li><li> Rimuovere embrione da membrane extra-embrionali e tessuti, come descritto al punto 1.5. </li> &lt;li&gt; lavaggio con soluzione sterile salina bilanciata di Hanks (HBSS) e rimuovere il liquido in eccesso dal embrione circostante utilizzando una pipetta. </li><li> Sezionare attraverso la regione cervicale separa la testa dal resto dell&#39;embrione (Figura 1A). </li><li> Usando un bel bisturi (bisturi oftalmico), tagliare lungo la linea mediana del cuoio capelluto. Afferrare entrambi i lati di questa incisione con una pinza sottile e togliere la pelle. Successivamente, usare le forbici iridectomia per fare un&#39;incisione che corre la lunghezza della linea mediana del cranio in via di sviluppo. Successivamente, fare due incisioni aggiuntivi, circa 1/3 della distanza fra le estremità anteriore e posteriore del cranio sviluppo. Utilizzare una pinza sottile di cogliere i &quot;lembi&quot; del cranio che derivano da questa parte della dissezione, e rimuovere il tessuto in via di sviluppo cranio, esponendo la corteccia (Figura 1B). </li><li> Utilizzo del bisect bisturi il cervello lungo la linea mediana a metà piano sagittale, che separa gli emisferi destro e sinistro corticali (figure1B, C). La pia e aracnoide sono lasciati aderenti alla corteccia, e la dura madre viene rimosso insieme con il cranio in via di sviluppo. </li><li> Preparare ogni emisfero corticale separatamente. Posizionare il lato mediale dell&#39;emisfero in modo che si può vedere l&#39;eminenza gangliare e la corteccia in via di sviluppo (figure 1 C, D). </li><li> Utilizzando il bisturi, fare una incisione coronale attraverso il neuroepitelio corticale caudale al bulbo olfattivo in via di sviluppo. Questa incisione dovrebbe iniziare al confine anteriore delle eminenze ganglionari mediale e laterale, e si estendono attraverso la regione cingolata anteriore del rudimento di sviluppo corticale (Figura 1E). </li><li> Fai un&#39;altra incisione coronale appena caudalmente al confine posteriore dell&#39;eminenza gangliare laterale (Figura 1F). Questa incisione dovrebbe estendersi anche dal limite laterale della eminenza gangliare alla parete mediale del rudimento di sviluppo corticale. </li><li> Ritrarre la corticale crea &quot;flap&quot;ta dalle due incisioni fatte a passi 3,7 e 3,8, con una leggera pressione bisturi o da un flusso di HBSS consegnati con una pipetta 200 pl per evitare danni meccanici alla corteccia. Poi fare una incisione trasversale lungo il confine che separa l&#39;eminenza laterale gangliare dalla corteccia di sviluppo (Figure 1G, H). Poi, sezionare via di sviluppo e l&#39;ippocampo orlo corticale del telencefalo mediale, all&#39;apice della neocorteccia dove la superficie laterale e parete corticale interemisferica. </li><li> Fare una incisione trasversale lungo il confine che separa l&#39;eminenza laterale gangliare dalla corteccia di sviluppo (Figura 1H). </li><li> Rimuovere qualsiasi tessuto sezionato supplementare che è sul piatto Sylgard dal espianto sezionato corticale. Si può usare pipettaggio gentile con tampone HBSS fresco per pipettare via qualsiasi tessuto sezionato in più. La corteccia è sezionato con il lato rivolto verso il basso meningea (Figura 1I). </li></ol><ol><li> Preparare un anello di filo di platino collegato ad una pipetta di vetro. Riscaldare la pipetta di vetro con un filo di platino ripiegato inserito nell&#39;estremità della pipetta di vetro. Ruotando la fine del ciclo filo di platino, la dimensione del ciclo può essere aumentato o diminuito, e il ciclo può essere sagomato per adattarsi alle dimensioni del espianto desiderato. (Questo può essere preparato in anticipo e riutilizzati.) </li><li> Riscaldare l&#39;estremità del filo di platino per sterilizzare il loop. </li><li> Isolare l&#39;espianto sezionato corticale e rimuovere il supporto HBSS supplementari pipettando dolce, lasciando una piccola quantità da utilizzare con il gancio di metallo. </li><li> Inserire un centimetro 1 membrana in policarbonato in un piatto di 4 cm di diametro di imaging. </li><li> Utilizzando il lato del cappio di filo di platino, capovolgere delicatamente la corteccia in modo che il lato rivolto verso l&#39;alto meningea. </li><li> Sollevare l&#39;espianto corticale fuori del piatto dissezione, ponendo l&#39;espianto a metà del ciclo e con le forze idrostatiche intrinsecisollevare l&#39;espianto su una superficie piana. </li><li> Delicatamente il espianto sulla membrana di policarbonato, e sollevare l&#39;anello del filo di platino distanza tale che l&#39;espianto rimane sulla membrana in piano con la superficie ventricolare fare contatto con la membrana. </li><li> Sollevare delicatamente la membrana e pipettare 50 pl di CSF o altri mezzi di comunicazione sotto la membrana. </li><li> Coprire il piatto di imaging, collocarlo in un contenitore umidificato secondaria, e incubare a 37 ° C in 5% CO 2 per 24 ore a sostenere continua proliferazione cellulare e la crescita espianto. Figura 2 rappresenta uno schema della preparazione finale corticale piatto espianto. </li></ol>

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	<li>Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+in+cerebrospinal+fluid+and+plasma+of+fetal+rats+during+development.">Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development.</a> Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).</li><li>Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cerebro-spinal+fluid+protein+composition+in+early+developmental+stages+in+chick+embryos.">Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. 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A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryonic+brain+development+in+rats+requires+the+trophic+influence+of+cerebrospinal+fluid.">Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid.</a> International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).</li><li>Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF2+plays+a+key+role+in+embryonic+cerebrospinal+fluid+trophic+properties+over+chick+embryo+neuroepithelial+stem+cells.">FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells.</a> Developmental Biology. 297 (2), 402-416 (2006).</li><li>Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cerebrospinal+fluid:+regulator+of+neurogenesis,+behavior,+and+beyond.">The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Il metodo descritto per la raccolta ventricolare CSF ha prodotto campioni relativamente puri embrionale CSF con composizione proteica stabile e consistente attività in un certo numero di saggi cellulari 9. Con una tecnica buona raccolta e la prole di dieci E14.5 topi, ci si può aspettare di raccogliere 10-15 ml di CSF, e da una cucciolata di ratti E16, si può aspettare di raccogliere circa 50-90 ml di liquido cerebrospinale. Questa tecnica di raccolta minimizza la contaminazione da sangue e dei tessuti, at...

Il QCS è un fluido complesso che bagna la neuroepitelio sviluppo 1-6 e offre 7 essenziali pressione e promuovere la crescita spunti per lo sviluppo del cervello 8-12. Per studiare il QCS nel corso dello sviluppo del cervello, abbiamo sviluppato tecniche per isolare liquor ventricolare di sviluppare embrioni di ratto o il mouse durante le varie fasi di sviluppo 6,9. Metodi precedenti di isolamento incluso con una lente di micro-ago e isolamento del QCS con un micro-iniettore 1,2. Il nostro metodo utilizza un micro-capillare pipetta di vetro la cui punta è stato tirato per creare un punto ultrafine per la penetrazione nel tessuto migliore. Il micro-capillare pipetta di vetro è collegato ad un aspiratore modo che la raccolta liquor ventricolare può essere controllato con cambiamenti nella pressione dolci. Per studiare l&#39;influenza delle cellule staminali di segnali CSF, si sezionare cerebrali corticali espianti, disporle su membrane in policarbonato, e galleggiare li cu appropriatemedia lture integrato con campioni di CSF 9. Con questa tecnica, ridotti volumi di supporti sono sufficienti per la coltura tissutale, consentendo un uso efficiente di CSF 9.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Wiretrop II aghi capillari </td><td> Drummond scientifico </td><td> # 5-000-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Adesivi Ellsworth </td><td> N ° 184 SIL ELAST kit </td><td></td></tr><tr><td> Aspiratore gruppo del tubo </td><td> Sigma </td><td> # A5177-5EA </td><td></td></tr><tr><td> Filtro usa e getta </td><td> Venturi o farmacia locale </td><td> non disponibile </td><td> Sigaretta filtro standard </td></tr><tr><td> Roundstock coltello oftalmico (15 coltello stab grado) </td><td> Mondo Strumenti di precisione, Inc. </td><td> # 500250 </td><td></td></tr><tr><td> 35 millimetri di vetro a fondo piatto di cultura </td><td> MatTek Corp. </td><td> # P35G-1.5-14-C </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Platino-iridio filo </td><td> Tritech ricerca </td><td> # PT-9010-010-3FT </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch membrana </td><td> Whatman </td><td> # 09-300-57 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks soluzione salina bilanciata </td><td> Fisher Scientific </td><td> # SH30031.FS </td><td></td></tr><tr><td> Iridectomia Forbici </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> # 15000-02 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of cerebrospinal fluid from rodent embryos for use with dissected cerebral cortical explants

Il QCS è un fluido complesso con una proteoma varia dinamicamente durante tutto lo sviluppo e in età adulta. Durante lo sviluppo embrionale, il QCS nascente differenzia dal liquido amniotico alla chiusura del tubo neurale anteriore. Volume di CSF aumenta poi nei giorni successivi, come le cellule progenitrici neuroepiteliale che rivestono i ventricoli e del plesso coroide generate CSF. I contatti embrionali CSF apicale, superficie ventricolare delle cellule staminali neurali del cervello in via di sviluppo e il midollo spinale. CSF fornisce la pressione del fluido cruciale per l&#39;espansione del cervello sviluppo e distribuisce crescita importante promuovere fattori di cellule progenitrici neurali temporalmente in un modo specifico. Per studiare la funzione del CSF, è importante isolare campioni puri di embrionale CSF senza contaminazione da sangue o tessuto telencephalic sviluppo. Qui, si descrive una tecnica per isolare campioni relativamente puri ventricolare embrionale CSF che possono essere utilizzati perun&#39;ampia gamma di saggi sperimentali compresi spettrometria di massa, elettroforesi proteica, e coltura di cellule e espianto primaria. Dimostriamo come sezionare e cultura espianti corticali su membrane porose in policarbonato per crescere sviluppo del tessuto corticale con ridotti volumi di supporto o nel liquido cerebrospinale. Con questo metodo, gli esperimenti possono essere eseguiti utilizzando CSF ​​da varie età o condizioni per studiare l&#39;attività biologica del proteoma CSF sulle cellule bersaglio.

La raccolta CSF dovrebbe produrre un chiaro, fluido trasparente. Non ci dovrebbero essere tracce di contaminazione da sangue, come dimostrato da un fluido tinta rosso o giallo nell&#39;aspirato e nel tubo Eppendorf. Ci dovrebbe anche essere alcuna prova di tessuto in aspirazione e il tubo Eppendorf. Quando il CSF viene centrifugata, si può anche valutare la CSF microscopicamente per garantire che non vi è alcuna contaminazione. Se ci sono segni di contaminazione, il QCS deve essere eliminata. Da una cucciolata E14.5 i...

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Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Il liquido ventricolare cerebrospinale (CSF) bagna le cellule progenitrici neuroepiteliale e cerebrali corticali durante lo sviluppo iniziale del cervello nell&#39;embrione. Qui si descrive il metodo messo a punto per isolare liquor ventricolare da embrioni di roditori di età diverse, al fine di indagare la sua funzione biologica. Inoltre, dimostriamo il nostro dissezione cerebrale espianto corticale e cultura tecnica che permette di crescita espianto con volumi minimi di terreno di coltura o nel liquido cerebrospinale.

Isolamento del liquido cerebrospinale da embrioni roditori per l&#39;uso con sezionato espianti cerebrali corticali

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

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22.8K Views.  VA Greater Los Angeles Healthcare System. Il liquido ventricolare cerebrospinale (CSF) bagna le cellule progenitrici neuroepiteliale e cerebrali corticali durante lo sviluppo iniziale del cervello nell'embrione. Qui si descrive il metodo messo a punto per isolare liquor ventricolare da embrioni di roditori di età diverse, al fine di indagare la sua funzione biologica. Inoltre, dimostriamo il nostro dissezione cerebrale espianto corticale e cultura tecnica che permette di crescita espianto con volumi minimi d...

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Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

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Neuroscienze

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Isolamento e Cultura della dissociato neuroni sensoriali da embrioni di gallina

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed method based on molecular weight cut-off (MWCO) filtration and mass spectrometric analysis was combined with an offline high-pH reverse phase HPLC pre-fractionation step.
Secretion into CSF is the main pathway for removal of molecules shed by cells of the central nervous system. Thus, many processes in the central nervous system are reflected in the CSF, rendering it a valuable diagnostic fluid. CSF has a complex composition, containing proteins that span a concentration range of 8 - 9 orders of magnitude. Besides proteins, previous studies have also demonstrated the presence of a large number of endogenous peptides. While less extensively studied than proteins, these may also hold potential interest as biomarkers.
Endogenous peptides were separated from the CSF protein content through MWCO filtration. By removing a majority of the protein content from the sample, it is possible to increase the sample volume studied and thereby also the total amount of the endogenous peptides. The complexity of the filtrated peptide mixture was addressed by including a reverse phase (RP) HPLC pre-fractionation step at alkaline pH prior to LC-MS analysis. The fractionation was combined with a simple concatenation scheme where 60 fractions were pooled into 12, analysis time consumption could thereby be reduced while still largely avoiding co-elution.
Automated peptide identification was performed by using three different peptide/protein identification software programs and subsequently combining the results. The different programs were complementary rather than comparable with less than 15% of the identifications overlapped between the three.

A method for mass spectrometric analysis of endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF) is presented. By employing molecular weight cut-off filtration, chromatographic pre-fractionation, mass spectrometric analysis and a subsequent combination of peptide identification strategies, it was possible to expand the known CSF peptidome nearly ten-fold compared to previous studies.

Preparazione del campione per l'analisi di Endopeptidomic in liquido cerebrospinale umano

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central nervous system and thus, can be used to analyze the diseased state of the brain or spinal cord without directly accessing these tissues. However, in mice it is difficult to obtain from the cisterna magna due to its closeness to blood vessels, which often contaminate samples. The area for CSF collection in mice is also difficult to dissect to and often only small samples are obtained (maximum of 5-7 &#181;L or less). This protocol describes in detail a technique that improves on current methods of collection to minimize contamination from blood and allow for the abundant collection of CSF (on average 10-15 &#181;L can be collected). This technique can be used with other dissection methods for tissue collection from mice, as it does not impact any tissues during CSF extraction. Thus, the brain and spinal cord are not affected with this technique and remain intact. With greater CSF sample collection and purity, more analyses can be used with this fluid to further aid neuroscience research and better understand diseases affecting the brain and spinal cord.

This protocol describes an improved technique for the abundant collection of cerebrospinal fluid (CSF) with no contamination from blood. With greater sample collection and purity, more analyses can be performed using CSF to further our understanding of diseases that affect the brain and spinal cord.

Un metodo migliore per la raccolta di liquido cerebrospinale da topi anestetizzati

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Isolamento dei capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Rat Model of Widespread Cerebral Cortical Demyelination Induced by an Intracerebral Injection of Pro-Inflammatory Cytokines

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and death, caused by white matter lesions in the spinal cord and cerebellum, as well as by demyelination in grey matter. Whilst conventional models of experimental allergic encephalomyelitis are suitable for the investigation of the cell-mediated inflammation in the spinal and cerebellar white matter, they fail to address grey matter pathologies. Here, we present the experimental protocol for a novel rat model of cortical demyelination allowing the investigation of the pathological and molecular mechanisms leading to cortical lesions. The demyelination is induced by an immunization with low-dose myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) in an incomplete Freund&#39;s adjuvant followed by a catheter-mediated intracerebral delivery of pro-inflammatory cytokines. The catheter, moreover, enables multiple rounds of demyelination without causing injection-induced trauma, as well as the intracerebral delivery of potential therapeutic drugs undergoing a preclinical investigation. The method is also ethically favorable as animal pain and distress or disability are controlled and relatively minimal. The expected timeframe for the implementation of the entire protocol is around 8 - 10 weeks.

The protocol presented here allows the reproduction of a widespread grey matter demyelination of both cortical hemispheres in adult male Dark Agouti rats. The method comprises of intracerebral implantation of a catheter, subclinical immunization against myelin oligodendrocyte glycoprotein, and intracerebral injection of a pro-inflammatory cytokine mixture through the implanted catheter.

Modello di ratto di demielinizzazione corticale cerebrale diffusa indotta da un'iniezione intracerebrale di citochine pro-infiammatorie

Multiple sclerosis (MS) is the most common immune-mediated disease of the central nervous system (CNS) and progressively leads to physical disability and ...

Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral vascular effects. Impact (i.e., non-blast) traumatic brain injury (TBI) is known to decrease pressure autoregulation in the cerebral vasculature in both humans and experimental animals. The hypothesis that blast-induced traumatic brain injury (bTBI), like impact TBI, results in impaired cerebral vascular reactivity was tested by measuring myogenic dilatory responses to reduced intravascular pressure in rodent middle cerebral arterial (MCA) segments from rats subjected to mild bTBI using an Advanced Blast Simulator (ABS) shock tube. Adult, male Sprague-Dawley rats were anesthetized, intubated, ventilated and prepared for Sham bTBI (identical manipulation and anesthesia except for blast injury) or mild bTBI. Rats were randomly assigned to receive Sham bTBI or mild bTBI followed by sacrifice 30 or 60 min post-injury. Immediately after bTBI, righting reflex (RR) suppression times were assessed, euthanasia at the time points post-injury was completed, the brain was harvested and the individual MCA segments were collected, mounted and pressurized. As the intraluminal pressure perfused through the arterial segments was reduced in 20 mmHg increments from 100 to 20 mmHg, MCA diameters were measured and recorded. With decreasing intraluminal pressure, MCA diameters steadily increased significantly above baseline in the Sham bTBI groups while MCA dilator responses were significantly reduced (p &#60; 0.05) in both bTBI groups as evidenced by the impaired, smaller MCA diameters recorded for the bTBI groups. In addition, RR suppression in the bTBI groups was significantly (p &#60; 0.05) higher than in the Sham bTBI groups. MCA&#39;s collected from the Sham bTBI groups exhibited typical vasodilatory properties to decreases in intraluminal pressure while MCA&#39;s collected following bTBI exhibited significantly impaired myogenic vasodilatory responses to reduced pressure that persisted for at least 60 min after bTBI.

Here, we present a protocol to describe methods for ex vivo vascular reactivity determination following a primary blast traumatic brain injury (bTBI) using isolated, pressurized, rodent middle cerebral arterial (MCA) segments. bTBI induction is accomplished using a shock tube, also known as an Advanced Blast Simulator (ABS) device.

Effetti del Neurotrauma indotta da Blast il roditore pressurizzato Middle arterie cerebrali

Though there have been studies on the histopathological and behavioral effects of blast exposure, fewer have been dedicated to blast&#39;s cerebral ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

In vivo Imaging del trasporto del fluido cerebrospinale attraverso il teschio del topo intatto utilizzando la macroscopia di fluorescenza

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...

Tecniche di massaggio cinese: miglioramento della funzione motoria nei ratti con paralisi cerebrale

Abdominal Massage to Improve Motor Dysfunction in Rats with Cerebral Palsy

Cerebral palsy (CP) is a disease with a high disability rate and morbidity. The clinical symptoms of cerebral palsy are motor dysfunction and abnormal posture development, often accompanied by cognitive impairment. Massage, a traditional Chinese Medicine therapy, can coordinate Zang and Fu, regulate Qi and blood, make the viscera work more smoothly, and calm Yin and Yang. Furthermore, it has been an effective method for CP in clinical. This paper summarizes a set of simple and standardized manipulations of massage for young rats with CP, which is easy to follow. The procedure follows: first, massage of four limb acupoints, including Quchi (LI11) and Zusanli (ST36); second, massage of the abdomen acupoints Zhongwan (RN12), Tianshu (ST25), Guanyuan (CV4), and Qihai (CV6); and finally, massage of the abdomen of the rats. This set of massage methods considerably improved the motor function of young rats with CP and is simple, standardized, and easy to follow. We adapted this set of manipulation methods in animal models to promote the internationalization and standardization of massage.

Autore in primo piano: Esplorare il potenziale della massoterapia nella paralisi cerebrale infantile utilizzando modelli animali 

Here, we present a set of massage manipulations in the rat model of cerebral palsy that can considerably improve the motor function of cerebral palsy rats.

Massaggio addominale per migliorare la disfunzione motoria nei ratti con paralisi cerebrale infantile

Cerebral palsy (CP) is a disease with a high disability rate and morbidity. The clinical symptoms of cerebral palsy are motor dysfunction and abnormal ...