We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience - DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.

Tutti gli animali sono stati trattati nel pieno rispetto delle normative danesi ed europei. numero di permessi: 2012-15-2934. 1. Preparazione della siringa per idraulica estrusione del midollo spinale <ol><li> Per un ratto adulto, usare una siringa da 10 ml. Per un topo adulto, usare una siringa da 5 ml. Per i cuccioli, usare una siringa da ml 2.5. </li><li> Regolare la punta della pipetta non-filtro universale adatto per 2-200 pipette microlitri tagliando l&#39;estremità più grande della punta della pipetta fino a quando non si inserisce saldamente alla siringa. Posizionare la punta della pipetta rettificato sulla siringa. Per i cuccioli, utilizzare un 23 G o un ago simile invece di un puntale rettificato. </li><li> Aspirare ghiacciata PBS sterile e lasciare la siringa sul ghiaccio fino a nuovo uso. </li></ol> 2. L&#39;eutanasia <ol><li> Non eseguire dislocazione cervicale, in modo da disturbare la vertebre spinali rendendo impossibile l&#39;estrusione. </li><li> Per ratto adulto / mouse, eutanasia usando il gas come CO 2 o isofluRane. Queste sostanze sono dannose. Eseguire l&#39;eutanasia in una cappa aspirante e gestire le sostanze secondo le linee guida dell&#39;istituzione. (ATTENZIONE: CO 2: H280, P410, P403, isoflurano: H361d, P260, P281, P280) <ol><li> Per garantire che il roditore è morto, garantire l&#39;assenza di riflesso pizzicando una zampa con una pinzetta. Decapitare il roditore con grandi forbici. Per i cuccioli, eutanasia per decapitazione. </li></ol></li></ol> 3. Isolamento della colonna vertebrale <ol><li> Spruzzare acqua sul pelo per controllare i capelli. </li><li> Utilizzando un paio di forbici, tagliare aperto il pelo lungo la colonna vertebrale in direzione distale e isolare la colonna vertebrale tagliando su entrambi i lati lungo la colonna vertebrale oltre l&#39;osso pelvico. Tagliare il midollo spinale distalmente all&#39;osso pelvico con un paio di forbici. NOTA: L&#39;asse rostrale-caudale è indicato come l&#39;asse prossimale-distale durante il protocollo. <ol><li> Tagliare la colonna vertebrale con un paio di forbici per evitare il proximal-più distale e la maggior parte delle aree, come questi possono rendere la colonna vertebrale anche S-forma per il successo di estrusione del midollo spinale. Assicurarsi che il midollo spinale è visibile a entrambe le estremità. Se il midollo spinale non è visibile, tagliare la colonna vertebrale con le forbici fino al midollo spinale diventa visibile. </li></ol></li></ol> 4. estrusione idraulica del midollo spinale <ol><li> Collocare un piatto Petri (100 mm di diametro) riempita con PBS sterile su ghiaccio. </li><li> Raddrizzare la colonna vertebrale applicando un indice sulla parte piegata (prossimale porzione più) della colonna vertebrale, raddrizzando così la colonna vertebrale per quanto possibile. <ol><li> Per i cuccioli, evitare di piegare la colonna vertebrale, come le vertebre verrà interrotto il rendering del midollo spinale estrusione impossibile. </li></ol></li><li> Inserire la punta della pipetta (23 G ago per cuccioli, in alternativa, 18 ago G per topi adulti) al distale-più fine della colonna vertebrale. Se inserita correttamente, la punta è stabilizzato nella cavità spinale. </li><li> Assicurarsi che la colonna vertebrale è raddrizzato per quanto possibile. Applicare una pressione costante, ed estrudere il midollo spinale nella capsula di Petri sul ghiaccio. Assicurarsi che il midollo spinale è tenuto umido in ghiaccio con l&#39;in PBS fino a nuovo trattamento. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" /> Figura 1: midolli spinali rappresentativi. Idraulico estruso midollo spinale. Da sinistra a destra: ratto adulto, topo adulto, mouse cucciolo. ingrandimenti lombare segnati dalla scatola. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 5. Identificazione dei gangli dorsali (DRG) <ol><li> Dividere la colonna vertebrale in due parti longitudinali uguali con le forbici e posizionare la colonna vertebrale spaccatura sotto il microscopio. </li><li> Identificare il segmento T13 vertebra dopo<html> localizzare il sito di attacco del distale-più costae sulla colonna vertebrale facendo attenzione a non confondere il costae con le vicine nervi intercostali. I distali-più costae sono attaccati alla parte prossimale del segmento vertebra T13 e T13 DRG si trova distalmente alla vertebra T13 e prossimalmente alla vertebra L1. </li><li> Identificare DRG concomitanti in direzione distale. Per un ratto adulto, DRG concomitanti appaiono bianche con dorsali chiaramente visibili e radici ventrali. Per un topo adulto, DRG concomitanti appaiono bianche con dorsali chiaramente visibili e radici ventrali. Per i cuccioli, DRG concomitanti appaiono come sfere trasparenti. </li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" /> Figura 2: Identificazione DRG nella colonna vertebrale dopo l&#39;estrusione del midollo spinale. La colonna vertebrale è stato suddiviso consentendo la visualizzazione di DRG come indicato dalle frecce. Esemplificato da ratto adulto e pup del mouse.<html> ref = target &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 6. L&#39;isolamento di DRG <ol><li> Piatti Numero di Petri (30 mm di diametro) in funzione delle DRG specifici da isolati, ad esempio L3, L4, L5. Riempire le capsule di Petri con ghiacciata PBS sterile e disporli sul ghiaccio. </li><li> Utilizzando le forbici micro, tagliare dorsali e ventrali radici più vicino possibile ai DRG come possibile rilasciare loro, evitando di danneggiare i DRG. </li><li> Con la punta delle pinzette chiusi, delicatamente scoop DRG e trasferirli ai corrispondenti piatti numerati Petri. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" /> Figura 3: Rappresentante isolato DRG. Da sinistra a destra: ratto adulto, topo adulto, mouse cucciolo.&quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 7. lavorazione di tessuti per ulteriori analisi <ol><li> Western blotting <ol><li> Isolare l&#39;area tessuto di interesse, ad esempio il midollo spinale lombare allargamento. Se necessario, separare il midollo spinale in lati ipsilaterale e controlaterale e ulteriormente in dorsali e ventrali corna. </li><li> Posizionare il tessuto in tampone di lisi come tampone di lisi TNE (10 mM Tris-base, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 in bidistillata H 2 O) contenente opportuni inibitori su ghiaccio. </li><li> Omogeneizzare il tessuto per circa 30 s su ghiaccio con un pestello macinazione meccanica. </li><li> Centrifugare per 15 min a 16.000 xga 4 ° C e utilizzare il supernatante per un&#39;ulteriore elaborazione secondo protocolli standard 5, 6 o mantenere il supernatante a -20 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol></li><li> RNA-analisi <ol><li> Isolare il tessuto di interesse. </li><li> Porre immediatamente il tessuto in soluzione stabilizzazione RNA per stabilizzare l&#39;RNA per la conservazione. </li><li> Isolare RNA secondo protocolli standard 7. </li><li> Convertire RNA a cDNA ed eseguire qPCR secondo protocolli standard 7. </li></ol></li><li> immunoistochimica <ol><li> Per il tessuto fresco congelato (applicabile al midollo spinale): <ol><li> Preparare la polvere di ghiaccio secco polverizzando cubetti di ghiaccio secco per un importo corrispondente a due cucchiai di polvere. Coprire cubetti di ghiaccio secco in un panno e polverizzare i cubi con un martello. Posizionare lamina d&#39;argento (circa 5 cm x 5 cm) su uno strato di cubetti di ghiaccio secco e coprire la lamina d&#39;argento con polvere di ghiaccio secco. </li><li> Posizionare l&#39;area del midollo spinale selezionato per ulteriori analisi sulla polvere di ghiaccio secco con una pinzetta, lasciarlo snap-freeze, e trasferire il midollo spinale di un tubo di crio. Tenerlo in ghiaccio secco in ogni momento o conservarlo a -80 ° C fino a quando ci ulteriormentee. </li><li> Trasferire il midollo spinale per un criostato (-20 ° C). Se necessario, tagliare il midollo spinale all&#39;interno del criostato. Posizionare il midollo spinale in embedding materiale all&#39;interno del criostato, al fine di allegare al disco di preparato. </li><li> Tagliare il midollo spinale nello spessore desiderato, ad esempio 5 micron, e raccogliere su lastre di vetro. Riscaldare le lastre di vetro con un dito immediatamente precedenti la raccolta dei tessuti per una migliore attacco. Mantenere qualsiasi tessuto rimanente in tubi crioconservazione a -80 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Lasciare le sezioni su lastre di vetro all&#39;interno del criostato fino al momento per la post-fissaggio. </li><li> Post-fix sezioni di immersione nel 4% PFA per 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Eseguire la colorazione secondo protocolli standard 8. </li></ol></li><li> tessuto fisso per crio sezionamento (applicabile al midollo spinale e DRG) <ol><li> Fissare midollo spinale e DRG in al 4% PFA (2 h per il midollo spinale, 1.5 h per DRG del mouse e 4 ore per DRG di ratto)4 ° C (posto midollo spinale in posizione orizzontale per evitare che si fissa in una posizione piegata). </li><li> Trasferire il tessuto al 25% w / v di saccarosio notte a 4 ° C. Il tessuto può essere memorizzato nel 25% w / v di saccarosio addizionato con poche gocce di azide di sodio al 10% per prevenire la contaminazione microbica a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. Se necessario, tagliare il midollo spinale per compensare l&#39;allargamento lombare solo su una tavola di silicone o simile. </li><li> Utilizzando la punta di un tovagliolo di carta, aspirare soluzione di saccarosio in eccesso dal tessuto. </li><li> Riempire una metà dello stampo crio con materiale di incorporamento. Spingere le bolle ai lati dello stampo crio con strumenti come pinzette chiusi. </li><li> Posizionare il tessuto sul materiale embedding usando pinzette ed assicurare l&#39;orientamento del tessuto desiderato. </li><li> Riempire lo stampo crio completamente con materiale di incorporamento e spingere le bolle più lontano dal tessuto possibile (ad esempio utilizzando una pinzetta chiusi). </li><li> Riempire una piastra di Petri (100 mmdi diametro) con 2-metilbutano. Questa sostanza è nociva. Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante e gestire la sostanza secondo le linee guida dell&#39;istituto (ATTENZIONE: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310). </li><li> Porre la capsula di Petri su uno strato di ghiaccio secco e aggiungere due cubetti di ghiaccio secco al piatto Petri. Mettere lo stampo crio nella scatola di Petri e lasciare che il materiale embedding per congelare completamente. </li><li> Mantenere il tessuto incorporato in ghiaccio secco in ogni momento o a -80 ° C avvolto in Parafilm fino al procedimento. </li><li> Tagliare il tessuto su un criostato (-20 ° C) nello spessore desiderato, ad esempio 5 micron. </li><li> Eseguire la colorazione secondo protocolli standard 8. </li></ol></li><li> tessuto fissato per paraffina-embedding (applicabile al midollo spinale e DRG) <ol><li> Fix midollo spinale e DRG in 4% PFA (2 h per il midollo spinale, 1.5 h per DRG topo e 4 h per DRG di ratto) a 4 ° C (posto midollo spinalein posizione orizzontale per evitare che si fissa in una posizione piegata). </li><li> Trasferire il tessuto al 25% w / v di saccarosio notte a 4 ° C. Il tessuto può essere memorizzato nel 25% w / v di saccarosio addizionato con poche gocce di azide di sodio al 10% per prevenire la contaminazione microbica a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Isolare l&#39;area tessuto di interesse, ad esempio il midollo spinale lombare allargamento. </li><li> Riempire una metà stampo embedding con paraffina. </li><li> Raffreddare brevemente stampo embedding posizionandolo sulla zona di raffreddamento della macchina embedding per indurire un po &#39;la paraffina. Ciò consente un migliore posizionamento dei tessuti. </li><li> Posizionare il tessuto nell&#39;orientamento desiderato nello stampo embedding. Riempire lo stampo embedding con paraffina e raffreddare immediatamente. </li><li> Posizionare lo stampo incorporamento paraffina contenente a 4 ° C durante la notte per far indurire completamente e rimuovere il blocco di paraffina contenente il tessuto dallo stampo incorporamento. </li><li> sezioni tagliate ona microtomo nello spessore desiderato, ad esempio 5 micron. </li><li> Eseguire la colorazione secondo protocolli standard 8. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice.">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li><li>Meikle, A. D., Martin, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+removal+of+the+spinal+cord.">A rapid method for removal of the spinal cord.</a> Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+using+the+thermo+scientific+Solaris+qPCR+assay.">Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections">https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections</a> (2014)</li><li>Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Nervous System. , 424-426 (2012).</li><li>Rigaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+and+strain+differences+in+rodent+sciatic+nerve+anatomy:+implications+for+studies+of+neuropathic+pain.">Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain.</a> Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).</li><li>Green, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+non-genetic+factors+which+influence+the+type+of+the+skeleton+in+an+inbred+strain+of+mice.">Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice.</a> Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).</li><li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+electrophysiology.">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+in+vitro+morphofunctional+analysis+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia.</a> Ann Anat. , 62-67 (2016).</li><li>Peeraer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+evaluation+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+as+an+in+vitro+model+for+diabetic+neuropathy.">Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy.</a> J Pain Res. 4, 55-65 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Se la colonna vertebrale è disturbato, ad esempio mediante dislocazione cervicale, il midollo spinale dividerà durante l&#39;estrusione. Se il midollo spinale non può essere estruso, la colonna spinale può essere leggermente tagliati a entrambe le estremità e il tentativo di estrusione può essere ripetuto. Nel caso sia necessario l&#39;intero midollo spinale per ulteriori analisi, cioè costituito dell&#39;allargamento cervicale e l&#39;allargamento lombare della colonna vertebrale deve essere tagliato solo leggermente. Se è necessario solo il rigonfiamento lombare per ulteriori analisi, il midollo spinale deve essere tagliato secondo la presente protocollo. La colonna vertebrale deve essere raddrizzata con la punta delle dita per facilitare l&#39;estrusione. Il protocollo è applicabile ai roditori di ogni età ed è qui esemplificato da un topo adulto (8 settimane), un cucciolo mouse (5 giorni) e un ratto adulto (10 settimane). A seconda del tipo di animale e la tensione, il numero di sezioni toracica e lombare può variare 9, </sup&gt; 10, 11. A seconda delle proteine ​​da analizzare, roditori adulti possono essere perfusi con soluzioni di enzimi inibizione prima dell&#39;eutanasia. Se si esegue un esperimento che coinvolge lesioni nervose unilaterale, il midollo spinale può essere suddiviso in parti ipsilaterale e controlaterale utilizzando pinzette ultrafini subito dopo l&#39;estrusione. Inoltre, ogni lato può essere suddiviso in dorsale e ventrale lati. Il tessuto può quindi essere elaborato per ulteriori analisi, ad esempio Western blotting. Transcardial perfusione-fissazione con PFA prima dell&#39;estrusione del midollo spinale dovrebbe essere evitata, in quanto rende il midollo spinale non flessibile e impedisce midollo spinale estrusione idraulica. Idraulico estrusione del midollo spinale si strappa le radici dorsali. Per gli esperimenti in cui sono necessari allegati radici dorsali, si consiglia di laminectomia. Inoltre, meningi spinali vengono persi per estrusione idraulico, che può essere evitato laminectomia serie estrusione idraulica del midollo spinale e isolamento DRG potrebbe anche essere eseguita utilizzando ossigenato liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) invece di PBS ghiacciato. L&#39;uso di ACSF permette conservazione del tessuto isolato in un ambiente migliore fisiologica, che è particolarmente importante nel caso di successive registrazioni elettrofisiologiche 12, 13. Un&#39;alternativa al ACSF potrebbe essere PBS contenente 1 g / L di glucosio per la generazione di colture DRG primaria 14. estrusione idraulica del midollo spinale è un metodo molto più veloce rispetto al modo tradizionale di isolamento del midollo spinale per laminectomia, riducendo i tempi di tessuto-movimentazione e quindi diminuendo il rischio di danni proteine. Perfusione con un fissatore prima di isolare il midollo spinale laminectomia può ridurre il rischio di danni ai tessuti durante la dissezione e durante la rimozione finale delmidollo spinale dalla colonna vertebrale. Tuttavia, la fissazione dei tessuti preclude l&#39;applicabilità di analisi come la Western blotting. I rendimenti di estrusione idraulici tessuto strutturalmente integro 3 adatto per una gamma più ampia di analisi. individuazione coerente di DRG può essere difficile. Tuttavia, questo è essenziale per l&#39;analisi dei tessuti, ad esempio in seguito lesione del nervo sciatico. Numerando i DRG in base alla loro localizzazione rispetto al costae, DRG possono essere identificati in modo coerente. La colorazione di tessuto del midollo spinale e della DRG può essere ottimizzata eseguendo le variazioni di trattamento del tessuto illustrate descritte nel passaggio 7 di protocollo.

L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di isolare il midollo spinale e per identificare e isolare DRG 1, 2. Estrusione idraulica del midollo spinale è un metodo molto più veloce rispetto al modo tradizionale di isolamento del midollo spinale per laminectomia, cioè rompendo vertebre spinali uno alla volta, e questo metodo riduce il rischio di danni ai tessuti causati dal processo di dissezione 3, 4 . DRG può essere difficile da individuare. La corretta identificazione è molto importante per l&#39;analisi dei tessuti, ad esempio in seguito lesione del nervo sciatico. Numerando i DRG in base alla loro localizzazione rispetto al costae, DRG possono essere identificati in modo coerente. Tissue isolato mediante tecniche dimostrate qui può essere applicato ad un&#39;ampia gamma di analisi inclusi occidentale blotting 5,6, 7 e qPCR colorazione immunoistochimica 8. Nell&#39;individuazione DRG, è importante prendere in considerazione che il numero dei segmenti spinali si caratterizza per variare con il tipo di animale e ceppo 9, 10, 11. I vantaggi di eseguire questo metodo nei topi sono l&#39;elevato numero di varianti geneticamente modificati disponibili e le spese relativamente basse abitazioni. I vantaggi nell&#39;utilizzo di ratti sono la resa dei tessuti relativamente alta e se coinvolge lesioni nervose, la procedura sarà facilitato con dimensioni.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 14084-08</td>
			<td>For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td># 5427 R</td>
			<td>For centrifugation of homogenized tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># CM 3050 S</td>
			<td>For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont, # 3</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 11231-30</td>
			<td>For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont, # 5</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 11252-20</td>
			<td>For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 %</td>
			<td>Abbott</td>
			<td># 002185</td>
			<td>For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane GPR rectapur</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td># 24872.298</td>
			<td>For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># RM 2155</td>
			<td>For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 76243</td>
			<td>For paraffin embedding; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin tissue embedding station</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># EG1160</td>
			<td>For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestel, motor cordless</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># Z359971-1EA</td>
			<td>For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td># 121V</td>
			<td>For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># P7741</td>
			<td>For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor, Phosstop</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 04906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, 1-200 &#956;l, no filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td># 70.1189.105</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Complete</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 05892791001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># R0901</td>
			<td>For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Protect Mini KiT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 74124</td>
			<td>For RNA isolation; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td># REF0203</td>
			<td>For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge</td>
			<td>Bochem</td>
			<td># 4070</td>
			<td>For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, 130 mm cutting edge</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td># 1902.0130</td>
			<td>For isolation of spinal cord (adult rat)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 15009-08</td>
			<td>For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Terumo</td>
			<td># SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x</td>
			<td>Leica</td>
			<td># 10446370</td>
			<td>Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td># 10010-015</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 23 G x 1&#34;, 0.6 x 25 mm</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td># NN-2325R</td>
			<td>For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td># NN-1838S</td>
			<td>Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura</td>
			<td># 4583</td>
			<td>Tssue embedding material for later cryosectionning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNE-lysis buffer</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td># 10128-582</td>
			<td>For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Midollo spinale idraulico estruso mostrano una superficie liscia intatta mostrato in Figura 1. L&#39;allargamento lombare può essere facilmente identificato come area ispessita del midollo spinale, inscatolato in Figura 1. Le dorsali e ventrali lati del midollo spinale possono essere identificati da occhio secondo la morfologia. Nella figura 1, il lato ventrale è rivolto verso lo spettatore, identificabili da una linea mediana chiaro, lungo l&#39;intero midollo spinale. Due linee più ampie lungo il midollo spinale consentono l&#39;identificazione del lato dorsale. Al distale-più fine, la cauda equina a volte può rimanere attaccato in ratti adulti e topi adulti. DRG individuali possono essere identificati solo mentre si trova nella colonna vertebrale, Figura 2. Dopo aver isolato, figura 3, i singoli DRG non possono essere identificati in base all&#39;aspetto. Se necessario, è quindiimportante per tenerli separati chiaramente su di isolamento. Dopo l&#39;isolamento, il midollo spinale e DRG possono essere elaborati e colorati come indicato al punto 7.3 e rappresentata nella figura 4. La figura 4a mostra una colorazione immunoistochimica di una sezione DRG cui i neuroni e le cellule gliali satelliti circostante sono chiaramente visibili. Con corretta identificazione del DRG è possibile analizzare l&#39;effetto di lesioni del nervo sciatico sul soma del neurone lesa nonché sulle loro cellule gliali satellitare circostanti. La figura 4b mostra una colorazione Nissl di un midollo spinale estruso idraulicamente dove il tessuto è intatto come risulta dai bordi lisci della sezione. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" /> Figura 4: sezioni di tessuto rappresentativi. A. La colorazione immunoistochimica della sezione DRG. B. Nissl macchiato section del midollo spinale estruso idraulicamente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

Estrusione idraulica del midollo spinale e isolamento dei gangli dorsali nei roditori

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

47.7K Views.  Aarhus University. Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage. 

Video: Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Immunoprecipitazione della cromatina dal tessuto dei gangli dorsali seguenti danno assonale

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

Misurare spinale Presinaptiche inibizione nei topi radice dorsale Recording potenziale<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In Vitro Modellazione di cancerose Neural Invasion: La dorsale della radice Ganglio Modello

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Isolamento dei gangli di radice dorsale e colture primarie per lo studio del rilascio di neurotrasmettitore

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Isolamento rapido dei macrofagi di Ganglion dorsale

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Estrusione idraulica del midollo spinale e isolamento dei gangli dorsali nei roditori

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