Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NINDS (NS066071) e il NIAAA. (P50AA017823) a ECO. Gli autori ringraziano il Dr. Robert Quinn e il personale del Dipartimento delle Risorse Animali di laboratorio per la cura degli animali. Ringraziamo Judson Belmont per il supporto tecnico, Nicole Belletier di assistenza, come Fellow Undergraduate Research Estate (SURF). Ringraziamo anche il dottor David Cameron per i commenti e le modifiche in una versione precedente del manoscritto.

1. Elettroporazioni utero Ex con Expression Proteina Fluorescente Verde Plasmid <ol><li> Soluzioni di iniezione di DNA plasmidici sono preparati con CAG-eGFP DNA 27 diluito alla concentrazione finale di lavoro di 0,33 mg / ml in DDH 2 O. Qiagen Endo-Free Maxi-Preps sono utilizzati per purificare il plasmide da batteri trasformati. Veloce colorante verde a ~ 0,02% (w / v finale) viene aggiunto alla soluzione di DNA come tracciante iniezione. </li><li> Per preparare l&#39;area chirurgica, spruzzare banco e la fase microscopio da dissezione con una soluzione di etanolo al 70% e asciugare. Spruzzare forbici chirurgiche e pinze con il 70% di etanolo prima della dissezione e asciugare. </li><li> Timed incinte svizzeri / Webster dighe sono sacrificati su E13 da trasferire in una camera riempita con CO 2 da una bombola sotto pressione e la diga è monitorato fino a quando tutto il movimento si è fermato per almeno 1 min. Dopo il sacrificio da CO 2 inalazione gli embrioni vengono rimossi dall&#39;utero e collocati inuna capsula di Petri contenente 10 centimetri ghiacciata Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS). </li><li> Attenzione sezionare ogni embrione dalle membrane che circondano extraembrionali e tenere in ghiaccio-freddo HBSS. </li><li> Trasferire ogni embrione singolarmente per un piatto secondo cm 10 Petri contenente HBSS freddo. Utilizzare una siringa Hamilton da iniettare 2-3 microlitri della miscela DNA veloce verde nel ventricolo dell&#39;emisfero cerebrale sinistro, avendo cura di iniettare in una zona corticale spazialmente separata dalla zona corticale per analisi future. </li><li> Per electroporate, tenere l&#39;embrione delicatamente con una pinza e leggermente posizionare la paletta positiva dell&#39;elettrodo pinzetta sulla linea mediana dorsale della testa e leggermente posizionare la pala negativo sotto il mento embrione. Elettroporazioni sono conseguiti con un elettroporatore BTX830 programmato per fornire cinque impulsi 30 V della durata di 50 msec, separati da 950 msec. Queste impostazioni sono per il modello BTX830. Altri sistemi possono essere utilizzati secondo INSTRUCTIO produttorens. </li></ol> 2. Tutta la Emisfero Preparazione Espianto <ol><li> Dopo elettroporazione gli embrioni sono posti di nuovo in gelide HBSS. Il cervello viene rimosso con due N ° 5 pinze gioielliere per rimuovere la pelle e il cranio cartilagineo dalla testa dell&#39;embrione. Una pinza viene quindi fatto scivolare sotto il cervello per rimuovere il cervello intatto dal cranio. L&#39;emisfero elettroporata (sinistra) viene sezionato dal cervello e allegata mesencefalo tessuto viene rimosso. In tutta la procedura di dissezione cura è presa per non danneggiare le meningi sovrastanti l&#39;emisfero sinistro corticale. </li><li> Una volta sezionato ogni embrione viene trasferito in HBSS utilizzando una pipetta con un taglio 1 punta ml pipetta. L&#39;emisfero viene espulsa cautamente su un inserto rivestito cultura collagene. Fino a sei espianti emisfero sono disposti lato mediale verso il basso ogni inserto mm 24. Una volta disposti, HBSS eccesso viene rimosso dalla inserto e l&#39;inserto viene quindi posto in uno ben 35 millimetri di un piatto 6 pozzetti. Il pozzo contiene exactly 2,7 ​​ml di media: DMEM-F12 supporti contenenti Glutamax e integrato con il 2% B-27, 1% e l&#39;1% G5 Penicillina-Strep. Alcune gocce di supporti dal pozzo può essere pipettati sopra l&#39;espianto, ma non aggiungere supporti in eccesso rispetto all&#39;originale 2,7 ml per pozzetto. </li><li> Una volta che gli espianti sono stati collocati su filtri di collagene il piatto ben 6 contenente gli espianti è collocato in una Rothenberg Billups (BR) camera (che contiene anche un piatto umidificazione di acqua). A 95% / 5% di ossigeno / CO 2 miscela di gas viene infusa nella camera per almeno 1 minuto prima di sigillare la camera di valvola e scollegamento del 95% / 5% di ossigeno / CO 2 tubo di alimentazione del gas. La camera di BR viene quindi posto in un 37 ° C di coltura tissutale incubatore per il resto del periodo di coltura, 1-2 DIV. </li></ol> 3. Fissazione del tessuto Espianto di Istologia <ol><li> In una cappa aspirante preparare la soluzione di fissazione Pagano dal primo solubilizzante 8 g di paraformaldeide in 100 ml di preriscaldato (~ 80 &amp; deg; C) DDH 2 O. Aggiungere 1-3 gocce di NaOH concentrati per promuovere la solubilizzazione e mescolare delicatamente. Una volta solubilizzato miscelare la soluzione di paraformaldeide 8% 1:1 con una soluzione 500 mM di saccarosio, 100 mM Hepes, pH 7,4, 50 mM MgCl 2, 5 mM KCl per una concentrazione finale di 4% paraformaldeide in saccarosio 250 mM Hepes 50 mM , 25 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, pH 7,4. </li><li> Per fissare gli espianti riscaldare la soluzione correzione Pagano a 37 ° C. Rimuovere rapidamente la maggior parte dei mezzi di comunicazione DMEM/F12 da ogni cultura bene e aggiungere 5 ml di Fix Pagano in ciascun pozzetto di espianti. Assicurarsi di coprire ogni espianto completamente in correzione. Fix per 1 ora a temperatura ambiente. Non rimuovere espianti dal filtro prima di 1 ora di fissazione. </li><li> Dopo fissazione rimuovere la soluzione di fix Pagano e sostituirlo con soluzione Pagano senza correzione (250 mM saccarosio, 50 mM Hepes 25 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, pH 7,4). Aggiungere poche gocce di azide di sodio al 10% e conservare a 4 ° C fino incorporamento. </li></ol> 4. Embedding e Sectioning per Istologia <ol><li> Preparare una soluzione al 10% di gelatina pelle di vitello solubilizzando 10 g di gelatina pelle di vitello in 100 ml di acqua calda (55-60 ° C). Posizionare soluzione di gelatina su una piastra calda regolata a 60 ° C e agitare periodicamente fino solubilizzato. </li><li> Versare circa 10 ml di soluzione al 10% di gelatina sul fondo di una capsula Petri da 10 cm e lasciare 30 min a solidificare. Questo formerà un &quot;pad&quot; per l&#39;incorporamento degli espianti. Queste pastiglie possono essere giorni preparati in anticipo e conservati a 4 ° C. Usare un righello per disegnare una griglia sul fondo della scatola di Petri e trasferire espianti individuali in ogni casella della griglia. Rimuovere residui di soluzione di Pagano e l&#39;utilizzo di una pipetta, coprire ogni espianto con caldo soluzione al 10% di gelatina e lasciare solidificare. Riprendere lenta aggiunta di soluzione di gelatina finché ogni espianto è completamente circondato da gelatina, facendo attenzione a non fondere il pad con l&#39;aggiunta di troppo caldo gelatina in una volta. Consentire la gelatina indurire per ~ 1 ora. Una volta indurito il indivigoli espianti possono essere tagliati in piccoli blocchi di gelatina. I blocchi vengono poi post-fissati in Pagano fissare per 24-48 ore prima del sezionamento con un vibratomo. </li><li> Espianti in blocchi gelatina sono posizionati bulbo olfattivo e sezionata nel piano coronale a 100 micron di spessore. Le sezioni vengono raccolti e conservati in PBS + sodio azide 0,1% a 4 ° C fino al procedimento immunoistochimica. </li><li> Rilevamento immunoistochimico viene eseguita trasferendo sezioni in una piastra a 24 pozzetti (2-3 sezioni per pozzetto). Primo blocco anticorpo non specifico legame aggiungendo 0,5 ml + B PBST (PBS + 0,5% Triton X 100 e 2% BSA) in ogni pozzetto, incubare 1 ora agitando delicatamente. L&#39;anticorpo primario viene quindi diluito in PBST + B e 0,4 ml per pozzetto viene aggiunto incubazione per tutta la notte a RT. Il primario è lavato con PBS 3X lava per almeno 10 minuti ciascuna. L&#39;anticorpo secondario e 2 ug / ml Hoechst 33342 nucleare macchia vengono quindi diluite in PBST + B ed i campioni vengono incubati per 2 ore a RTagitando delicatamente. Tre lavaggi con PBS (10 minuti ciascuna) vengono eseguite e quindi le sezioni sono montati su vetrini con un 90% di glicerolo 50 mM Tris, pH 7,4, mezzi di montaggio. </li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Abbiamo migliorato e valutato un modello sperimentale - espianti tutto l&#39;emisfero - per lo studio delle prime fasi dello sviluppo corticale (E13-E15). Il modello si è dimostrato utile per l&#39;analisi della migrazione e differenziazione del lignaggio neurone eccitatorio che costituisce lo strato 6 della corteccia cerebrale 25,37. I principali vantaggi del sistema sono 1) la crescita organotipica per 2 DIV, 2) la semplicità di preparazione, e 3) accesso sperimentale alle neuroni per elettroporazione, ma...

Le forme di mammifero attraverso la corteccia cerebrale concertata proliferazione, migrazione e differenziazione dei neuroni successivamente generati. Ogni neurone è nato nella zona ventricolare (VZ) e migra dal VZ nella zona intermedia (IZ), formando la piastra corticale (CP) 1. Come passano attraverso diversi domini corticali, i neuroni migrano visualizzare molteplici modalità di migrazione 2,3 che dipendono dall&#39;ambiente extracellulare e altri elementi cellulari (es glia radiale) all&#39;interno del tessuto di sviluppo. Neuroni corticali quindi arrestare migrazione in alto della piastra di formatura corticale nei processi coincidenti arresto migrazione neuronale e 4 dendritogenesis. Sviluppo corticale è iniziata tra i giorni embrionali 11-13 (E11-13) 5 tramite la costituzione dello strato primordiale plessiforme 6 o preplate (PP), uno strato di neuroni pionieri che sovrasta il VZ. Potenzialestrato 6 neuroni corticali (cioè i neuroni corticali prima nati nel VZ) poi orientare la loro somata in un modello stereotipato e fondersi in uno strato distinto all&#39;interno del PP 7. Questi eventi dividere il preplate in un superficiale marginale (futuro strato corticale 1) e una zona profonda, quest&#39;ultimo composto da cellule a piastra (strato corticale transitoria 7). Questo processo, chiamato scissione preplate, è un evento fondamentale per la crescita futura della corteccia cerebrale 8. Molte mutazioni genetiche sono state identificate che inficiano vari aspetti dello sviluppo corticale 9. Sviluppo corticale possono essere influenzate negativamente da esposizione a sostanze tossiche ingerite come la cocaina 10 e alcool 11. Perché malformazioni corticali che si presentano durante lo sviluppo sono tra i probabili disturbi neurologici (autismo es. schizofrenia), indagini empiriche delle perturbazioni allo sviluppo corticale sono inerentily importante. E &#39;quindi di notevole importanza per stabilire approcci per studiare lo sviluppo corticale che consentono analisi rapide di effetti genetici o tossina, ma che conserva anche le possibili interazioni tra i neuroni di differenziazione, altri tipi di cellule e la matrice extracellulare (ECM) durante questo primo periodo di sviluppo del cervello 12 . Espianti fetta 13 hanno fornito un tale sistema e sono stati ampiamente utilizzati per saggiare sviluppo corticale neuroni 14-16. Tuttavia, i saggi fetta possono soffrire l&#39;inconveniente che la migrazione neuronale e laminazione può essere anormale 17 forse a causa di danni alle cellule meningee che circondano il cervello in via di sviluppo e ancorare il radiali gliali patibolo. Come le fibre radiali gliali sono un importante substrato per la migrazione dei neuroni corticali 18 interruzione della lamina basale mediante tranciatura può interrompere localmente radiale architettura gliali e portare a alterata migrazione corticale. Inoltre la slisuperfici ced di espianti fornisce una regione di cellule morte che possono alterare la normale composizione della ECM in queste aree. Approcci più recenti hanno concentrato la loro analisi su cellule trova nel cuore della slice che sono circondati da adeguati tipi di cellule sane e ECM. Tuttavia, in alcuni casi, questi nuovi approcci possono richiedere che l&#39;originale fetta spessa colta essere crio-sezionato o paraffina sezionata dopo fissazione in modo che l&#39;interno relativamente normale della fetta è reso disponibile per l&#39;analisi 19-21. Sia il vibratomo originale sezionamento per preparare le fette diretta cultura nonché la successiva criosezionamento fette fissi per analisi richiede cura e sforzo per questi saggi lavorare. Per fornire un semplice, approccio complementare allo studio dei primi stadi dello sviluppo corticale, abbiamo modificato una fetta approcci esistenti da 13 a facilitare gli studi di primo sviluppo corticale. Abbiamo sviluppato un whole espianto emisfero modello simile a un modello esistente E14 emisfero che ha coinvolto le culture si stringono a 65 rotazioni al minuto e consentito la crescita organotipica per 16-18 ore 22,23. Nel nostro approccio, espianti emisfero interi sono posti sulla membrana semipermeabile 13 con in un&#39;atmosfera di cultura ossigeno 21,24 estendere organotipica crescita corticale per 48 ore. Questo approccio consente inoltre di elettroporazione coerente di sviluppo neuroni corticali. Gli embrioni vengono rimossi dall&#39;utero e elettroporate introdurre DNA plasmidico e telencefalo viene sezionato. Ogni emisfero è isolato e posizionato lato mediale su un collagene rivestita filtro. L&#39;espianto viene poi coltivata per un periodo di 48 ore, un periodo che comprende splitting preplate 8. Durante il periodo di coltura, L6 neuroni sviluppano da precursore differenziato neurone 25, correttamente posizionata all&#39;interno della piastra corticale. Durante questo periodo in via di svilupponeurone è circondato dalla ECM appropriata e tipi cellulari che confrontano la cella corrispondente in vivo. Questo sistema si è già dimostrato utile nel decifrare gli eventi cellulari che stanno alla base tossicità dell&#39;etanolo 26 strato 6 formazione e preplate scissione 7,25.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name </td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>10565</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G5 Supplement 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17503-012</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1504-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen / Strep Liquid 100X</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS 500 ml</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14025</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture insert collagen coated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3492</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine skin gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H1399</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7906</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12362</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX 830 Electroporator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes 10mm</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>450166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Billups Rothenberg</td>
			<td>MIC-101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe (5 uL)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-04</td>
			<td>Specify 1" and style 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td>
			<td>FST</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development

Sviluppo corticale comporta complesse interazioni tra neuroni e non neuronali elementi, comprese le cellule precursori, i vasi sanguigni, le meningi e relativi matrice extracellulare. Perché offrire un ambiente appropriato organotipica, espianti fetta corticali sono spesso usati per studiare le interazioni che controllano la differenziazione neuronale e lo sviluppo. Anche se utile, il modello di espianto fetta possono soffrire di inconvenienti tra cui aberrante laminazione cellulare e la migrazione. Qui riportiamo un intero sistema cerebrale espianto emisfero per gli studi di primo sviluppo corticale che è più facile da preparare rispetto fettine corticali e spettacoli coerenti migrazione organotipica e laminazione. In questo sistema modello, laminazione precoce e modelli di migrazione procedere normalmente per un periodo di due giorni in vitro, compreso il periodo della scissione preplate, durante il quale prospettiva strato corticale sei forme. Abbiamo poi sviluppato un ex elettroporazione in utero (EUEP)approccio che ottiene un successo ~ 80% in termini di orientamento espressione GFP ai neuroni in via di sviluppo nella corteccia dorsale mediale. L&#39;intero modello di espianto emisfero corticale rende sviluppo precoce accessibili per l&#39;elettroporazione, l&#39;intervento farmacologico e approcci di imaging dal vivo. Questo metodo evita l&#39;intervento chirurgico sopravvivenza richiesto in utero elettroporazione (IUEP) approcci, migliorando sia la trasfezione e areale coerenza targeting. Questo metodo faciliterà studi sperimentali neuronale proliferazione, migrazione e differenziazione.

Il roditore embrionale corteccia presenta un gradiente trasversale neurogenetica per tutto il periodo di sviluppo, in modo tale che neocorteccia laterale è di circa 1 giorno in più maturo di dorsale mediale neocorteccia 28. Il grosso strato 6 neuroni sono così generata (cioè esporre loro finale fase S) sulla E12 in corticale laterale (anche chiamato Campo 40 5) e alla E13 nella corteccia dorsale mediale (anche chiamato Campo 1 5). Splitting Preplate inizia circa 1 giorno dop...

Watch this Scientific Journal Video about Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development at JoVE.com

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Questo protocollo descrive un procedimento di espianto che coinvolge<em&gt; Ex utero</em&gt; Elettroporazione, la dissezione e la cultura di interi emisferi cerebrali dal mouse embrionale. La preparazione facilita studi farmacologici e analisi della funzione del gene durante le prime fasi dello sviluppo corticale.

Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

ex-utero-electroporation-whole-hemisphere-explants-simple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

12.8K Views.  SUNY Upstate Medical University. Questo protocollo descrive un procedimento di espianto che coinvolge Ex utero Elettroporazione, la dissezione e la cultura di interi emisferi cerebrali dal mouse embrionale. La preparazione facilita studi farmacologici e analisi della funzione del gene durante le prime fasi dello sviluppo corticale.

Video: Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Ricerca

Neuroscienze

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

Generazione di topi transgenici per uso topico<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione e<em&gt; In vivo</em&gt; Screening bioluminescenza

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF differentiates from the amniotic fluid upon closure of the anterior neural tube. CSF volume then increases over subsequent days as the neuroepithelial progenitor cells lining the ventricles and the choroid plexus generate CSF. The embryonic CSF contacts the apical, ventricular surface of the neural stem cells of the developing brain and spinal cord. CSF provides crucial fluid pressure for the expansion of the developing brain and distributes important growth promoting factors to neural progenitor cells in a temporally-specific manner. To investigate the function of the CSF, it is important to isolate pure samples of embryonic CSF without contamination from blood or the developing telencephalic tissue. Here, we describe a technique to isolate relatively pure samples of ventricular embryonic CSF that can be used for a wide range of experimental assays including mass spectrometry, protein electrophoresis, and cell and primary explant culture. We demonstrate how to dissect and culture cortical explants on porous polycarbonate membranes in order to grow developing cortical tissue with reduced volumes of media or CSF. With this method, experiments can be performed using CSF from varying ages or conditions to investigate the biological activity of the CSF proteome on target cells.

The ventricular cerebrospinal fluid (CSF) bathes the neuroepithelial and cerebral cortical progenitor cells during early brain development in the embryo. Here we describe the method developed to isolate ventricular CSF from rodent embryos of different ages in order to investigate its biological function. In addition, we demonstrate our cerebral cortical explant dissection and culture technique that allows for explant growth with minimal volumes of culture medium or CSF.

Isolamento del liquido cerebrospinale da embrioni roditori per l&#39;uso con sezionato espianti cerebrali corticali

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Sottotipo-selettivo elettroporazione della corticale interneuroni

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

Una nuova strategia che unisce Array-CGH, sequenziamento dell'intero-esoma e nell'Utero elettroporazione in roditori per identificare geni causativi per le malformazioni del cervello

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

Elettroporazione in utero approcci per studiare l&#39;eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. Transcytosis across the BBB regulates the delivery of hormones, metabolites, and therapeutic antibodies to the brain parenchyma. Here, we present a protocol that combines immunofluorescence of free-floating sections with laser scanning confocal microscopy and image analysis to visualize subcellular organelles within endothelial cells at the BBB. Combining this data-set with 3D image analysis software allows for the semi-automated segmentation and quantification of capillary volume and surface area, as well as the number and intensity of intracellular organelles at the BBB. The detection of mouse endogenous immunoglobulin (IgG) within intracellular vesicles and their quantification at the BBB is used to illustrate the method. This protocol can potentially be applied to the investigation of the mechanisms controlling BBB transcytosis of different molecules in vivo.

Here we present a microscopy-based protocol for high-resolution imaging and a three-dimensional reconstruction of the mouse neurovascular unit and blood-brain barrier using brain free-floating sections. This method allows for the visualization, analysis, and quantification of intracellular organelles at the BBB.

Imaging ad alta risoluzione confocale della barriera sangue - cervello: Imaging, ricostruzione 3D e quantificazione di transcitosi

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...