Ringraziamo Christine Kerschbamer, Thomas Letschka, Sabine Oettl, Margot Raffeiner, e Florian Senoner dal Centro Ricerche Laimburg e Mirelle Borges Dias Schnetzer da Dualsystems Biotech AG per il supporto tecnico e Julia Strobl per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è stato svolto come parte del progetto APPL2.0 ed è stato parzialmente finanziato dalla Provincia Autonoma di Bolzano / Bolzano, l&#39;Italia e il Consorzio Mela Alto Adige.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Nella schermata Y2H, il potenziale di proteine ​​effettrici è co-espresso con diverse proteine ​​che interagiscono ipotetici (passo 7). Ogni crescita del lievito clone contiene l&#39;esca, ma una (potenzialmente) Interactiano diverso. Le proteine ​​che interagiscono sono codificati in una libreria di cDNA che viene clonato in plasmidi preda. L&#39;esca e la preda plasmidi ciascun codice co-cistronically per una parte di un fattore di trascrizione di lievito. In caso di interazione fisica tra l&#39;esca (effettori) e un interattore plasmidica preda, le due parti del fattore di trascrizione (il dominio di legame al DNA e il dominio di attivazione) sono uniti, e l&#39;espressione del gene reporter è indotta. Il lievito è in grado di crescere su piastre di selezione SD histidine- e adenina-impoverito. Il tipo di libreria di cDNA preda dipende dalla effettore schermati e deve essere scelta di conseguenza. La preda ed esca vettore, così come il ceppo di lievito, devono essere compatibili. In questa schermata, un DNA LexA dominio di legame e l&#39;attivazione di GAL4 Domain sono stati utilizzati come unità di fattore di trascrizione del lievito compatibili. La libreria di cDNA può essere costruito individualmente, su misura, o commercialmente ottenuti. La preparazione della libreria cDNA preda non è parte di questo protocollo. In questo protocollo, un auto-costruito, libreria di cDNA normalizzata dalla RNA di Malus x domestica foglie è stato utilizzato e clonato in PGAD-HA 41. Il effettrici (esca) esprimente il ceppo di lievito è stato trasformato con la libreria preda, e cloni sono stati selezionati su piastre di selezione SD histidine- e adenina-impoverito. Per estrarre DNA plasmidico dalle colonie di lievito, un mini kit plasmide DNA basata su colonne per i batteri è raccomandato in combinazione con un passo rottura meccanica con perline di vetro per migliorare lievito lisi (fase 8). In questa purificazione plasmide, l&#39;esca e il vettore preda saranno purificati simultaneamente in concentrazioni relativamente basse. Tuttavia, la quantità di DNA plasmide è sufficiente per identificare il partner di interazione attraverso il sequenziamento ingegnoHout propagazione plasmide prima (fase 8.4). In alternativa, il DNA purificato nel passaggio 8.4 può essere trasformato in competente E. coli e selezionato con la preda resistenza agli antibiotici vettore-mediata (ad esempio, ampicillina l&#39;in caso di PGAD-HA). Il E. coli selezionato colonie portano solo la libreria plasmide PGAD-HA, e ad alto rendimento purificazione plasmide può essere eseguita con questi cloni. La trasformazione di successo di PLEXA-N e PGAD-HA costrutti completa il triptofano e leucina auxotrofia di NMY51. Un&#39;interazione tra l&#39;effettore e una proteina (codificati sulla PGAD-HA) porta all&#39;attivazione del sistema reporter in NMY51 ceppi. Nel caso di auto-attivazione, NMY51 trasformato con l&#39;effettore esprimere Plexa-N in combinazione con il vettore libreria vuota PGAD-HA cresce su piastre selettive privi trp-leu-his-ade, causa l&#39;attivazione indesiderata del sistema reporter NMY51 40. L&#39;auto-attivazione può essere weak e può verificarsi in assenza di trp-leu-la, o l&#39;attivazione può essere forte e caratterizzato da una crescita su piastre trp-Leu-la-ade 41. Auto-attivazione può causare uno sfondo massiccia di cloni falsi positivi nella schermata Y2H vero e proprio. Per evitare questo, deve essere condotto un test di auto-attivazione con l&#39;esca, in cui il vettore effettore esprimente è co-trasformato con il vettore libreria vuota. In questa impostazione sperimentale, l&#39;espressione genica giornalista non deve essere indotta. Se auto-attivazione (cioè, la crescita su piastre selettive) è visibile nella prova, il mezzo può essere integrata con differenti concentrazioni di 3-ammino-1,2,4-triazolo 45 (3-AT). 3-AT è un inibitore della dehydratase imidazoleglycerol-fosfato (HIS3), un enzima importante durante istidina biosintesi 46. La supplementazione con 3-AT può ridurre gli effetti deboli di auto-attivazione durante schermi Y2H 47,48. Differenti concentrazioni di 3-AT devono essere testati. In questo protocollo, 1 - 40 mm 3-AT sono stati utilizzati. La concentrazione più bassa che porta alla repressione di auto-attivazione dovrebbe successivamente essere utilizzato nella schermata Y2H. Le piastre selettive del saggio autoattivazione possono essere valutati solo se le piastre SD-trp-leu del co-trasformazione contengono un numero sufficiente di cloni. Come ≥ un&#39;indicazione 500 colonie per 90 mm (diametro) Petri sono sufficienti. Per determinare l&#39;esatto efficienza di trasfezione, si consiglia di preparare diluizioni seriali del lievito co-trasformato e di diffonderli su piastre SD-TRP-Leu. Per ridurre autoattivazione, l&#39;effettore può essere clonato in PLEXA-C, un vettore di espressione esca che fonde il tag LexA al C-terminale della proteina. L&#39;orientamento della Lex-Un tag può attenuare auto-attivazione 24. Tuttavia, non è possibile in ogni caso per ridurre o abolire autoattivazione. La formazione dicolonie rosse o rossastre indica una interazione debole o falso-positivo. Il gene reporter ADE2 di NMY51 viene attivato solo quando si tratta di un&#39;interazione proteina-proteina, che a sua volta blocca l&#39;accumulo di un colorante rosso in questo ceppo di lievito 40. In assenza di una interazione, NMY51 sono rossastra, mentre le colonie trasportano interactors forti sono bianchi. L&#39;osservazione del colore delle colonie sulle piastre di selezione prevede quindi un ulteriore importante suggerimento per giudicare se le rispettive colonie sono interattori TrueType o falsi-positivi. È eventualmente necessario adattare o modificare alcune impostazioni del test rispetto alla natura dell&#39;esca e le caratteristiche di interazione. Ormai, sono stati stabiliti una serie di miglioramenti e di tecniche derivate del Y2H comuni per consentire l&#39;analisi di piuttosto difficili interazioni proteina in diversi sistemi host. Una revisione da Stynen et al. 49 indirizzi di unND descrive i diversi aspetti della Y2H, i suoi miglioramenti e adattamenti, e, quindi, fornisce informazioni utili su come scegliere il saggio di interazione appropriata. schermi Y2H e tecniche derivate si sono ampiamente utilizzati in diversi campi di ricerca, laddove è richiesta l&#39;identificazione di interazioni proteina binari. Anche se i controlli vengono eseguiti critici, come ad esempio i test di auto-attivazione della esca e one-to-one ri-trasformazione delle proteine che interagiscono identificate, il Y2H è incline a produrre falsi risultati 26, 50, 51. Il lievito come modello non è adatto per tutti gli studi di interazione. Lievito non costituisce necessariamente un ambiente cellulare che supporta la modificazione post-traslazionale appropriato e pieghevole per ogni proteina 24. Inoltre, nel contesto Y2H, le proteine ​​sono sovra-espressi, e la loro espressione non è il controlloguidati dal loro promotore naturale. Il Y2H costringe i partner di interazione proteici al nucleo, che non è necessariamente la loro destinazione naturale subcellulare. Le circostanze nativi cellulari di interazione, quindi, non possono essere riflesse dal lievito e possono portare a risultati falsi negativi o falsi positivi. La maggior parte Y2H si basano sui lieviti auxotrofia complementazione come principio selettivo. Questa selezione nutrizionale è caratterizzato da un&#39;elevata sensibilità, ma a costo di una ridotta selettività rispetto ad altri (ad esempio, cromogenico giornalista) Saggi 49. Se unreducible auto-attivazione (vedi sopra) o altre limitazioni si verificano per un certo effettori, il Y2H non è un test adeguato 25. In Tabella 1 e Figura 1, i risultati attesi del test di auto-attivazione sono dati. L&#39;assenza di interazioni reali (vale a dire, i falsi negativi) può essere causato dalla tossicità della proteina, la proteina traslazionale erratoelaborazione, impedimento sterico dell&#39;interazione, partner di interazione sottorappresentati nella libreria preda, localizzazione di membrana dell&#39;esca, o mancanti componenti necessari per l&#39;interazione 24. Si raccomanda di de novo amplificare il gene intera lunghezza della proteina interagente identificato dal cDNA, subclone in PGAD-HA, ed eseguire un test interazione uno-a-uno, trasformando l&#39;generata PGAD-HA costrutto nel esca esprimono ceppo NMY51. Ciò è necessario in quanto l&#39;interagente osservata presente nella libreria preda potrebbe essere solo un frammento di una proteina più grande. Tuttavia, le informazioni per il rispettivo gene full-length è accessibile solo se considerevole di dati sequenza genomica e trascrittomica è disponibile. Il protocollo di trasformazione per il saggio autoattivazione qui descritto può essere applicato per un tale test uno-a-uno, e l&#39;interazione tra l&#39;esca e l&#39;interagente deve essere riproducibile. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Interazioni identificate in una schermata Y2H deve sempre essere confermata da un&#39;altra tecnica indipendente. Questa tecnica indipendente deve essere più vicino alla natura delle interazioni proteina-proteina reale. Nel caso del ATP_00189 phytoplasmal effettrici, l&#39;interazione con i fattori di trascrizione TCP di Malus x domestica è stata verificata in planta con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC) in Nicotiana benthamiana protoplasti 28 (non fa parte di questo protocollo). Il ATP_00189 proteine ​​effettrici è stato derivato dalla pianta patogeno P. mali. In planta BiFC è stato quindi deciso di verificare le interazioni ATP_00189 con i x domestica fattori di trascrizione Malus precedentemente identificati nel Y2H 28. BiFC è un saggio di interazione proteina-proteina che non richiede la traslocazione subcellulare delle proteine ​​interagenti al nucleo per attivare il sistema reporter &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 52. Inoltre, i in planta di espressione e macchinari modifica imita l&#39;ambiente di interazione naturale tra la effettori batterica impianto nella sua pianta ospite. Tuttavia, uno schermo globale utilizzando BiFC non è fattibile. Ci sono diversi passaggi del protocollo che deve essere affrontato con attenzione. Quando amplificando il gene di interesse (step 4), è importante escludere che i primer si legano al DNA vegetale. Pertanto, il DNA da piante non infette deve essere incluso come controllo negativo. La sequenza del gene di interesse non deve contenere i siti di restrizione EcoRI e SalI che vengono utilizzati per la clonazione direzionale dell&#39;inserto. Se la sequenza contiene questi siti, diversi enzimi di restrizione per la clonazione devono essere scelti. Lievito trasformazione è un metodo centrale durante questo protocollo. efficienza di trasfezione dipende dalla competenza delle cellule di lievito, la vitalità, lo stato di crescita, e la qualità del REAG trasfezioneent 53, 54. Per il protocollo proposto, si consiglia vivamente di utilizzare il lievito dai piatti freschi, non più di due settimane (conservate a 4 ° C) durante l&#39;esecuzione delle trasformazioni. Spesso, la crescita del lievito trasformato è in ritardo quando colture liquide selettivi vengono inoculate con le colonie da vecchie piastre di agar. E &#39;anche utile usare una coltura starter liquido come inoculo per gli esperimenti reali e non utilizzare il lievito direttamente dalla piastra. Bassa efficienza quando transfecting la preda nel lievito esca esprimono può portare alla sottorappresentazione di alcune proteine ​​preda (potenziali Interactiani) e può quindi inclinare l&#39;intero schermo. In questo protocollo, una efficienza di trasfezione di lievito di ~ 150.000 ufc / mg di DNA trasfettato in Y2H ha funzionato bene. Conoscere i difetti e gli svantaggi della tecnica Y2H e interpretare i risultati in modo critico e adeguato è indispensabile per disegnare la correct conclusioni. saggi Y2H ei derivati ​​sono stati utilizzati per molti anni e hanno subito molti miglioramenti e adattamenti in relazione alle differenti caratteristiche esca, la localizzazione subcellulare dell&#39;interazione, i partner di legame attesi, e altri fattori che possono essere richiesti per l&#39;interazione (vedi Y3H 55, 56, 57). Recentemente, sono stati sviluppati schermi Y2H basate su array che consentono l&#39;analisi automatizzata, ad alta produttività di numerose esche contro milioni di prede 58. Il futuro più probabile sta nella automazione e high throughput approcci per questo test per consentire la delucidazione delle vie di segnalazione complessi e interactomi in diversi campi di ricerca.

<html> Lievito schermi a due ibridi (Y2H) sono stati sviluppati circa 27 anni fa 1 e da allora sono stati ampiamente utilizzati in vari campi di determinare specifiche interazioni proteina-proteina 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 . L&#39;interazione fisica di un effettore batterica con una proteina bersaglio host è spesso il presupposto per la manipolazione funzionale di questo proteina bersaglio. Analizzando queste interazioni si è spostato al centro di molti diversi settori della biologia delle infezioni 12, 13, 14, 15,&quot;&gt; 16, 17, 18. Il principio della schermata Y2H è che l&#39;interazione di due proteine porta alla ricostituzione di un fattore di trascrizione funzionale che guida l&#39;espressione di geni reporter. L&#39;effettore noto (la&quot; esca &quot;) è traduzionali fuso al dominio di legame al DNA (DBD) del fattore di trascrizione, e le potenziali partner di interazione (il &quot;preda&quot;) vengono fuse al dominio di attivazione (aD) del rispettivo fattore di trascrizione. Poiché il partner interagenti è noto, una libreria di potenziale interattori è clonati nel cosiddetto &quot;preda-library.&quot; Normalmente, questa libreria è fatta da clonazione cDNA in un apposito preda vettore di espressione plasmidico codificante l&#39;AD che è compatibile con l&#39;esca vettore codificato DBD. Nel caso di una interazione, la fattori di trascrizione ricostituiti inducono l&#39;espressione di geni reporter, che generalmente consentono la selezione crescita del lievito. ilidentificazione di interattori si ottiene sequenziamento del plasmide preda con primer specifici plasmide. I batteri hanno sviluppato diverse strategie per manipolare e sfruttare il metabolismo del loro ospite o di eludere i meccanismi di difesa e secernere molecole effettrici tramite diversi sistemi di secrezione batterici 19, 20, 21. Determinare i partner di legame di questi effettori batterici è dunque il primo passo per identificare il percorso manipolato nell&#39;ospite. Questo porta ad una migliore comprensione dei meccanismi specifici di patogenicità. Schermi Y2H vengono eseguiti per identificare interazioni effettori batterica durante fitoplasmosi, e spesso, Y2H è un primo esperimento cruciale per l&#39;ulteriore caratterizzazione dei meccanismi molecolari di patogenicità nella ricerca fitoplasmi 22, 23. Tuttavia, il riunitoDescrizione hod nella maggior parte delle pubblicazioni è piuttosto scarsa, e queste tecniche sono spesso in outsourcing alle aziende biotech. Per attirare l&#39;attenzione sulla fattibilità di questo metodo, questo protocollo fornisce informazioni passo-passo per identificare i partner di interazione di una molecola effettore batterica nel suo ospite naturale. Nonostante l&#39;ampio uso e l&#39;approccio avanzamento veloce di schermi Y2H, non si deve dimenticare che alcune interazioni non potrebbero verificarsi nel sistema lievito. Ciò è dovuto al fatto che la cellula di lievito viene utilizzato come una sorta di &quot;recipiente di reazione in vivo&quot; con alcune limitazioni biologiche. Diversi autori hanno affrontato i vantaggi e gli svantaggi di Y2H e suoi derivati 11, 24, 25, 26, 27. Considerazioni generali sono, per esempio, che la cellula di lievito potrebbe non fornire la appropriatal&#39;espressione genica, (post) traslazionale, o le condizioni translocational per le rispettive proteine ​​in fase di studio. Questo può portare a risultati falsi negativi nella schermata. Interazioni positive possono a loro volta essere artefatti e potrebbero non verificarsi nella situazione fisica (cioè, nel caso di effettori nell&#39;ospite appropriato). È quindi indispensabile confermare le interazioni del sistema di espressione di lievito eterologa con una prova di interazione indipendente in un sistema biologico più strettamente correlati. In questo studio, sono stati individuati i partner vincolanti del ATP_00189 effettori del patogeno per le piante non coltivabili Candidatus Phytoplasma mali (P. mali). I risultati forniscono importanti informazioni sui meccanismi molecolari alla base dello sviluppo dei sintomi della proliferazione mela 28, una malattia che provoca elevate perdite economiche nelle regioni melicoltura colpite in Europa 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1514">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:565px;">Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td>
			<td style="width:211px;">Applichem</td>
			<td style="width:324px;">A6284</td>
			<td style="width:415px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trishydroxymethylaminomethane (Tris)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2264</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2942</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2937</td>
			<td>for media and buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">N-Lauroylsarcosin sodium salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A7402</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ammonium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>9688</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1108</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol (2-Propanol)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3928</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>51976</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RNAse</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2760</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Chloroform:Isoamyl 24:1</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1935</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Proofreading Polymerase (e.g. iProof)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>203433</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EcoRI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0271</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SalI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ER0641</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1493</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8056</td>
			<td>for self-activation assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Arginine Monohydrochloride&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3680</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Isoleucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3642</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-lysine Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3448</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Methionine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3897</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Phenylalanine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3464</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Threonine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3946</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tyrosine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3401</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Uracile</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0667</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Valine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3406</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Adenine Hemisulfate Salt&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1596</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.22 &#181;m Pore Filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16541</td>
			<td>for sterile filtration</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Histidine Monohydrochloride</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3719</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Leucine&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3496</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Tryptophane&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3410</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Nitrogen Base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>51483</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-Glucose Monohydrate&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1349</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-1</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Peptone</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2208</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polyethylene Glycol 4000 (PEG)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1249</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3478</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Salmon Sperm DNA&#160;</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2159</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-719</td>
			<td>for Western blot</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PLN350</td>
			<td>for plasmid purification from yeast and bacteria</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Washed Glass Beads</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8772</td>
			<td>for plasmid purification from yeast</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ampicillin Sodium Salt</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0839</td>
			<td>for microbiological selection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Yeast Extract</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1552</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z368245 (Sigma)</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bait vector (e.g. pLexA-N)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Prey vector (e.g. pGAD-HA)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control prey vector (e.g. pLexA-p53)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Control bait vector (e.g. pACT-largeT)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C640003</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3&#916;200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)</td>
			<td>Dualsystems</td>
			<td>P01004</td>
			<td>for Y2H</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>676 051</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>for PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td>for quantitative PCR</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804 R</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2500010</td>
			<td>for PCR and DNA works</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpell</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0301</td>
			<td>for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile filter (0.22 &#181;m; Polyethersulfone))</td>
			<td>VWR-International</td>
			<td>514-0073 (European Catalogue number)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 90 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>633180</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Petri dishes &#216; 150 mm&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>639161</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer (e.g. BioPhotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>550507804</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Photometer Cuvettes</td>
			<td>Brand</td>
			<td>759015</td>
			<td>for yeast culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB7</td>
			<td>for yeast transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Western Blot Equipment</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>diverse</td>
			<td>for protein detection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">dNTPs</td>
			<td>5Prime</td>
			<td>2201210</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z232793, Z232858, Z232866</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3031</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td>KB 53 (E3.1)</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)</td>
			<td>Omniwash</td>
			<td>IF 825</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 &#181;l)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>diverse</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spreader</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SPR-L-S01</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3617000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T4-Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0011</td>
			<td>for cloning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fridge (4&#176;C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>81.767.580.4</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Freezer (-20&#176;C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)</td>
			<td>Liebherr</td>
			<td>G5216</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Graduated Cylinder (e.g. Brand)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z327352; Z327417; Z327441&#160;&#160;</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>S55701</td>
			<td>for yeast and bacteria culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)</td>
			<td>Integra-Biosciences</td>
			<td>155000</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cuvettes for Electroporation (1 mm)</td>
			<td>Molecular Bio Products</td>
			<td>5510-11</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Electroporator (e.g. Eporator)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4309000019</td>
			<td>for bacteria transformation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)</td>
			<td>VWR-International&#160;</td>
			<td>525-0403 (European Catalogue number)</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352096</td>
			<td>general lab equipment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))</td>
			<td>Ambion&#160;</td>
			<td>AM8110G (distributed by Thermo Scientific)</td>
			<td>for ligation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y2021 Sigma&#160;</td>
			<td>for yeast culture (ready-made mix)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

unravelling the function of a bacterial effector from a non-cultivable plant pathogen using a yeast two-hybrid screen

Svelare i meccanismi molecolari di manifestazioni della malattia è importante per capire le patologie e lo sviluppo dei sintomi in scienza delle piante. I batteri si sono evoluti diverse strategie per manipolare il loro metabolismo ospite a proprio vantaggio. Questa manipolazione batterica è spesso accoppiato con sviluppo sintomo grave o la morte delle piante colpite. Determinare le molecole batteriche specifici responsabili della manipolazione ospite è diventato un settore importante nella ricerca microbiologica. Dopo l&#39;identificazione di tali molecole batteriche, chiamati &quot;effettori&quot;, è importante chiarire la loro funzione. Un approccio semplice per determinare la funzione di un effettore è individuare partner proteico obbligatorio in ogni suo ospite naturale tramite uno schermo di lievito doppio ibrido (Y2H). Normalmente l&#39;ospite ospita numerosi potenziali partner di legame che non possono essere previsti in misura sufficiente dagli qualsiasi algoritmo in silico. E &#39;quindi la scelta migliore per Perform a schermo con l&#39;ipotetico effettrici contro un&#39;intera biblioteca di proteine ​​ospite espresse. E &#39;particolarmente difficile se l&#39;agente eziologico è incoltivabile come fitoplasmi. Questo protocollo fornisce istruzioni passo-passo per la purificazione del DNA da un impianto di fitoplasma-infettati ospite legnoso, l&#39;amplificazione delle potenzialità effettori, e la successiva identificazione di partner di interazione molecolare della pianta con uno schermo Y2H. Anche se gli schermi Y2H sono comunemente usati, vi è una tendenza a esternalizzare questa tecnica per le aziende biotecnologiche che offrono il servizio Y2H ad un costo. Questo protocollo fornisce istruzioni su come eseguire un Y2H in qualsiasi laboratorio di biologia molecolare decentemente attrezzata con tecniche di laboratorio standard.

Prima che lo schermo Y2H reale può essere eseguita l&#39;esca deve essere testato per l&#39;auto-attivazione. Questo risultato è ottenuto trasformando il vettore di espressione esca insieme con il vettore libreria preda vuoto e di controllo della crescita su piastre selettive. Per analizzare se la proteina ATP_00189 phytoplasmal è auto-attivazione, il test di auto-attivazione è stata eseguita come descritto nel paragrafo 5. Il plasmide esca è complementare il trp e la preda plasmide il auxotrofia leu di S. cerevisiae NMY51 40. Un successo di co-trasformazione è quindi caratterizzato da una crescita su piastre selettive prive trp e leu. L&#39;interazione dell&#39;esca e una proteina preda porta ad una complementazione del suo e ade auxotrofia di NMY51. Se appare autoattivazione dall&#39;esca in assenza di una interazione, il lievito cresce su piastre selettive prive sua e ade. Forte e debole autoattivazione può verificarsi. Strong autoattivazione dell&#39;esca è caratterizzata da una crescita del lievito co-trasformato on trp-leu-his-ade impoverito piastre di selezione. Debole auto-attivazione porta alla crescita su trp-Leu-la, ma non su TRP-Leu-la-Ade impoverito piastre di selezione. controlli adeguati positivi sono indispensabili per interpretare i risultati del test di auto-attivazione. Una sintesi dei risultati attesi del test di auto-attivazione e la loro interpretazione è fornito nella tabella 1 e visualizzati nella figura 1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55150/55150fig1.jpg" /> Figura 1: Esempio di Bait test auto-attivazione di un esca prima di eseguire una schermata Y2H. S. cerevisiae NMY51 è stato co-trasformato con l&#39;interazione esca (PLEX-p53) e prede (PACT-larget) come controllo positivo (pannello di sinistra: ac), una debole auto-attivazione più una preda vuoto library vettore (pannello centrale: df) e un esca non auto-attivazione più un vettore libreria preda vuoto (pannello di destra: gi). Il lievito co-trasformato sono state coltivate su piastre SD prive trp e leu (pannello superiore: a, d, g), trp, leu e il suo (pannello centrale: B, E, H) e trp, leu, la sua e la facciata (in basso pannello: C, F, I). Selezione sul mezzo privo di trp e leu è un controllo positivo per il successo di co-trasformazione, come il vettore esca completa il auxotrofia trp e il vettore preda leu auxotrofia di NMY51 (crescita su SD-TRP-leu). Nel caso di una interazione tra esca e la preda o di un auto-attivazione della esca, l&#39;espressione giornalista di NMY51 sia acceso e completa il suo e ade auxotrofia (crescita su SD-TRP-Leu-la-Ade). Un debole auto-attivazione è caratterizzato da una crescita su SD-TRP-Leu-suoi piatti (pannello centrale, df). Debole autoattivazione di un&#39;esca deve essere diminuito preventiva per analizzare l&#39;escain una schermata Y2H, ad esempio aggiungendo 3-AT ai mezzi selettivi. esaurimento aminoacidi sono indicate con &quot;-&quot; nel rispettivo nome del supporto. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> PLEXA-N-atp00189 </td><td> nessuna </td><td> colonie </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td></tr><tr><td> nessuna </td><td> PGAD-HA </td><td> nessuna crescita </td><td> colonie </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td></tr><tr><td> PLEXA-N </td><td> nessuna </td><td> colonie </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td></tr><tr><td> PLEXA-N </td><td> PGAD-HA </td><td> colonie </td><td> colonie </td><td&gt; colonie </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td></tr><tr><td> PLEXA-p53 </td><td> PACT-larget </td><td> colonie </td><td> colonie </td><td> colonie </td><td> colonie </td><td> colonie </td></tr><tr><td> PLEXA-N-atp00189 </td><td> PGAD-HA </td><td> colonie </td><td> colonie </td><td> colonie </td><td> nessuna crescita </td><td> nessuna crescita </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Risultati attesi in un saggio Self-attivazione esca. La trasformazione di S. cerevisiae NMY51 produce in crescita differenziale su terreni selettivi in base alle caratteristiche di esche co-trasformato e prede. La crescita su piastre selettive stata valutata misurando la trasformazione di diverse combinazioni vettoriali (af) dopo 72 ore di incubazione a 30 ° C. Debole auto-attivazione è caratterizzato da una crescita del lievito su SD-TRP-Leu-la e forte auto-attivazione crescita su SD-TRP-Leu-la-Ade selezione plates in assenza di un partner di interazione. Il PLEXA-N phytoplasmal codificato effettrici ATP_00189 non presenta auto-attivazione, che si caratterizza per l&#39;incapacità del vettore esca trasformato NMY51 di crescere in assenza del suo e ade. A seconda l&#39;esca, uno schermo Y2H può guadagnare numerosi cloni di lievito che cresce su piastre selettive. Tutti i cloni devono essere analizzati e controllati per eventuali esuberi. Anche se è stata utilizzata una libreria di cDNA normalizzata, è molto probabile che un interactor è rappresentata in molti cloni differenti. A seconda della tecnica di clonazione biblioteca, è anche possibile che solo frammenti del gene completo sono inseriti alcuni vettori preda. È pertanto consigliabile de novo amplificare (da cDNA) e subclone il gene lunghezza della interattore e testare l&#39;interazione in un&#39;analisi Y2H uno-a-uno (Figura 2). <img alt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55150 / 55150fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2: Esempio di una interazione tra Bait and Prey in un esperimento Y2H. Uno schermo lievito doppio ibrido (Y2H) è stata eseguita e plasmidi da cloni Interactiano positivi sono stati purificati. Il vettore preda è stato sequenziato e le Malus domestica x partner di interazione ospite MdTCP24 e MdTCP25 sono stati identificati. Come MdTCP34 controllo negativo (per i quali non è stato identificato interattore nella schermata della libreria Y2H) è stato subclonato in parallelo. I geni di lunghezza completa sono stati amplificati dal cDNA mela, subclonato nel vettore preda (che esprime co-cistronically l&#39;attivazione dominio AD) e de novo co-trasformato con il vettore esca che esprime la ATP_00189 effettori batterica accoppiato al dominio di legame al DNA (BD). Questa figura è presa da 28. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55150/55150fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un più grande</a>versione di questa figura.

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Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

proteine ​​effettrici batteriche sono importanti per stabilire le infezioni di successo. Questo protocollo descrive l&#39;identificazione sperimentale di partner di legame proteici di una proteina batterica effettrici nel suo ospite vegetali naturali. Identificare queste interazioni effettrici via lievito schermi doppio ibrido è diventato uno strumento importante per svelare le strategie di patogenicità molecolari.

Svelare la funzione di un batterica Effector da un non-coltivabili fitopatogeni Utilizzando un lievito schermo doppio ibrido

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

unravelling-function-bacterial-effector-from-non-cultivable-plant

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.4K Views.  Laimburg Research Centre.  proteine ​​effettrici batteriche sono importanti per stabilire le infezioni di successo. Questo protocollo descrive l'identificazione sperimentale di partner di legame proteici di una proteina batterica effettrici nel suo ospite vegetali naturali. Identificare queste interazioni effettrici via lievito schermi doppio ibrido è diventato uno strumento importante per svelare le strategie di patogenicità molecolari. 

Video: Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

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Immunologia e infezioni

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

Invasione di cellule umane da un agente patogeno batterico

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

L&#39;uso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Induzione di Graft-versus-host disease e<em&gt; In Vivo</em&gt; T monitoraggio cellulare Utilizzando un MHC-abbinato modello murino

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks to human and animal health. Among cereal production, maize is arguably the most affected crop, due to pathogen-induced losses in grain integrity and mycotoxin seed contamination. The two most prevalent and problematic mycotoxins for maize growers and food and feed processors are aflatoxin and fumonisin, produced by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides, respectively.
Recent studies in molecular plant-pathogen interactions have demonstrated promise in understanding specific mechanisms associated with plant responses to fungal infection and mycotoxin contamination1,2,3,4,5,6. Because many labs are using kernel assays to study plant-pathogen interactions, there is a need for a standardized method for quantifying different biological parameters, so results from different laboratories can be cross-interpreted. For a robust and reproducible means for quantitative analyses on seeds, we have developed in-lab kernel assays and subsequent methods to quantify fungal growth, biomass, and mycotoxin contamination. Four sterilized maize kernels are inoculated in glass vials with a fungal suspension (106) and incubated for a predetermined period. Sample vials are then selected for enumeration of conidia by hemocytometer, ergosterol-based biomass analysis by high performance liquid chromatography (HPLC), aflatoxin quantification using an AflaTest fluorometer method, and fumonisin quantification by HPLC.

The devastation of cereal crops by seed-infecting fungi has prompted numerous research efforts to better understand plant-pathogen interactions. To study seed-fungal interactions in a laboratory setting, we developed a robust method for the quantification of fungal reproduction, biomass, and mycotoxin contamination using kernel bioassays.

Quantificazione di colonizzazione fungina, sporogenesi, e la produzione di micotossine Uso Bioassays Kernel

The rotting of grains by seed-infecting fungi poses one of the greatest economic challenges to cereal production worldwide, not to mention serious risks ...

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

This protocol outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and colitis, as well as the methods used to characterize Citrobacter rodentium infection in mice. C. rodentium is a gram negative, murine specific bacterial pathogen that is closely related to the clinically important human pathogens enteropathogenic E. coli and enterohemorrhagic E. coli. Upon infection with C. rodentium, immunocompetent mice suffer from modest and transient weight loss and diarrhea. Histologically, intestinal crypt elongation, immune cell infiltration, and goblet cell depletion are observed. Clearance of infection is achieved after 3 to 4 weeks. Measurement of intestinal epithelial barrier integrity, bacterial load, and histological damage at different time points after infection, allow the characterization of mouse strains susceptible to infection.
The virulence mechanisms by which bacterial pathogens colonize the intestinal tract of their hosts, as well as specific host responses that defend against such infections are poorly understood. Therefore the C. rodentium model of enteric bacterial infection serves as a valuable tool to aid in our understanding of these processes. Enteric bacteria have also been linked to Inflammatory Bowel Diseases (IBDs). It has been hypothesized that the maladaptive chronic inflammatory responses seen in IBD patients develop in genetically susceptible individuals following abnormal exposure of the intestinal mucosal immune system to enteric bacteria. Therefore, the study of models of infectious colitis offers significant potential for defining potentially pathogenic host responses to enteric bacteria. C. rodentium induced colitis is one such rare model that allows for the analysis of host responses to enteric bacteria, furthering our understanding of potential mechanisms of IBD pathogenesis; essential in the development of novel preventative and therapeutic treatments.

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter rodentium infection provides a valuable model to study enteric bacterial infections as well as host immune responses and colitis in mice. This protocol outlines the measurement of barrier integrity, pathogen load and histological damage allowing for the thorough characterization of pathogen and host contributions to murine infectious colitis.

Il<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Studiare Contributi degli agenti patogeni e Host alla colite infettiva

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Separazione automatica di<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabilmente Colonizzato da un batterio patogeno

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

Rilevamento Cortex Frammenti Durante la germinazione delle spore batteriche

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

La valutazione della retina microglia fagocitaria Funzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando un test citometria a flusso basato su

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...