Ringraziamo Sacha Reichman e Dominique Santiard-Baron per il loro aiuto nel modificare il protocollo di purificazione dell&#39;RNA.

1. Giornale: procedimento di recupero degli esemplari del blocco chirurgico Nel laboratorio <ol><li> Ottenere un contratto di importazione dalla società di trasporto espresso. </li><li> Riempire 10 (o 25) le forme di trasporto, con l&#39;indirizzo postale del laboratorio che indica la persona da contattare in laboratorio (numero di telefono e indirizzo email). </li><li> Preparare 10 (o 25) le forme esemplari numerati da 1 a 10 (o 25). Queste forme includono spazi dedicati ad informare su: a) l&#39;identificazione anonima del paziente, b) la data della chirurgia e c) le eventuali osservazioni aggiuntive che il chirurgo vorrebbe aggiungere. Preparare 10 (o 25) buste imbottite (150 x 210 mm). </li><li> Preparata con RNase-free reagenti 25 (o 65) ml di 6 M di cloruro di guanidina in dietilpirocarbonato (DEPC) trattato con H 2 O (GHCL). </li><li> Riempire 10 o 25 numerati da 5 ml sterili tubi in polietilene con fondo arrotondato con 2,4 ml di soluzione GHCL. </li><li> Utilizzati gas argon per riempire la parte superiore di questi tubi, che ti premereghtly sul tappo per evitare l&#39;ossidazione della soluzione GHCL in diversi anni di stoccaggio nell&#39;armadio chirurgica. </li><li> Introdurre ogni provette da 5 ml in un ml polipropilene sterile conica tubo 50 fondo con tappo a vite. Usare un pezzo di tessuto di carta pulito per tenere il tubo 5 ml in tubo da 50 ml, chiudere il tubo. </li><li> Collocare le provette da 50 ml su un rack di polistirolo e il rack in una scatola di cartone con le buste imbottite, le forme di trasporto, le forme di campioni. </li><li> Incollare le istruzioni (vedi: 1,12-1,19) all&#39;interno del coperchio della scatola di cartone per facilitare la loro lettura. </li><li> Invia la scatola di cartone per posta alla persona di contatto in ospedale. </li></ol> In ospedale <ol start="11"><li> Portare la scatola di cartone dal cabinet chirurgica in sala operatoria. Attenzione Nota: Se la procedura comporta un paziente compromesso immunitario, il cartone non deve essere portato in sala operatoria. </li><li> Durante l&#39;intervento chirurgico, collocare il SPECIM retinait in numerata 5 ml in polipropilene sterile riempito con soluzione GHCL. Chiudere ermeticamente il tubo. </li><li> Tornare brevemente il tubo. </li><li> Posizionare il tubo sul rocker tubo di sangue per 10 min. </li><li> Compila il modulo numerato campione di accompagnamento. </li><li> Riporta il numero di identificazione sul corrispondente numerato tubo da 50 ml. </li><li> Introdurre il tubo 5 ml con il campione chirurgico nel tubo da 50 ml, sostituire il tessuto carta e avvitare il tubo. </li><li> Introdurre il tubo e il modulo di esempio compilato in esso in una delle buste imbottite accompagnamento. Chiuderlo. </li><li> Chiamare la società di trasporto espresso per il ritiro. </li></ol> 2. RNA Purification Nel laboratorio <ol><li> Omogeneizzare il campione nella sua polipropilene tubo 5 ml con soluzione GHCL con un omogeneizzatore per 1 min, mentre spostando il tubo su e giù. </li><li> Aggiungere 270 ml di 2 M potassio acetato pH 5.0. Agitare vigorosamente per 10 minuti ponendo la provetta in un agitatore a suaposizione orizzontale (420 min -1). </li><li> Centrifugare 10 min a 5000 rpm (6500 xg) a 20 ° C. </li><li> Aspirare senza problemi la frazione solubile senza disturbare il pellet. </li><li> Trasferire in una provetta sterile 14. </li><li> Aggiungere 5,3 ml di 100 mM Tris pH 8,0, N-Lauroylsarcosine 1%. </li><li> Aggiungere 3,2 g di cloruro di cesio (CsCl) e mescolare il tubo nel vortex. </li><li> Aggiungere 1,8 ml di acido CsCl / etilendiamminotetraacetico (EDTA) in una sterile 11 ml polyallomer provetta da centrifuga. </li><li> Con una pipetta Pasteur sterile ml 10, trasferire la soluzione di RNA su 1,8 ml CsCl / EDTA facendo scorrere lentamente sul bordo del tubo per non disturbare il cuscino densità. </li><li> Porre i tubi (un secondo tubo contenente i buffer senza retina se necessario) nel rotore. </li><li> Centrifugare 24 ore a 32.000 giri al minuto (225.000 xg) a 20 ° C. </li><li> Rimuovere la parte superiore della soluzione con una pipetta Pasteur sterile, e buttarlo. </li><li> Rimuovere gradualmente durante il controllo dellamomento in cui il DNA (viscoso) viene aspirato con una seconda pipetta Pasteur sterile, e buttarlo. </li><li> Rimuovere la soluzione rimanente facendo attenzione a non rilasciare il pellet di RNA con una terza pipetta Pasteur sterile. </li><li> La sezione inferiore del tubo con un bisturi fiamma sterilizzato, poi mettere la parte rimanente del tubo capovolto su un sguardo sterile. </li><li> Invertire la provetta e lavare delicatamente con 160 ml di GHCL. </li><li> Lasciate che il pellet asciutto per 10 min. </li><li> Risospendere il pellet in 150 ml di (10 mM Tris pH 7,5-1 mM EDTA - 0,1% SDS). </li><li> Trasferire la soluzione in una provetta sterile ml 2, poi raccogliere il pellet residuo con 30 ml di (10 mM Tris pH 7,5-1 mM EDTA - 0,1% SDS). </li><li> Aggiungere 150 ml di (10 mM Tris pH 7,5-1 mM EDTA). </li><li> Aggiungere 30 ml di sodio acetato 3 M pH 5.0, vortex la provetta. </li><li> Aggiungere 900 ml di etanolo al 100% (-20 ° C), il tubo vortex. </li><li> Posizionare il tubo di 30 min in ghiaccio fondente. </li><li> Centrifuge il tubo 30 min a 15.000 rpm a 4 ° C. </li><li> Aspirare delicatamente la frazione solubile, e buttarlo. </li><li> Aggiungere 500 ml di etanolo al 70% (RT), vortex la provetta. </li><li> Centrifugare la provetta 20 min a 15.000 rpm (18.000 xg) a 4 ° C. </li><li> Ripetere la fase di risciacquo (70% di etanolo). </li><li> Centrifugare brevemente ed eliminare l&#39;etanolo residuo con una pipetta P200. </li><li> Lasciare il pellet aria secca per 10 min. </li><li> Risospendere il pellet in 50 microlitri DEPC trattati con H 2 O. </li><li> Mescolare vigorosamente nel vortex. </li><li> Incubare 15 min a 45 ° C in un bagno d&#39;acqua. </li></ol> 3. RNA Analisi per elettroforesi su gel <ol><li> Versare un gel di agarosio all&#39;interno di una cappa chimica. </li><li> In una sterile 1,5 ml provetta, aggiungere 2 ml di RNA da analizzare e 6,4 ml di tampone campione prep. </li><li> In un secondo tubo 1,5 ml, aggiungere 3 ml di RNA standard e 9,6 ml di tampone campione prep. </li><li> Riscaldare il tubo 15 min a 65 ° C, Metterli su ghiaccio. </li><li> Aggiungere 1 ml di bromuro di etidio (EB) loading buffer senza colorante nel tubo campione di RNA e 1 ml EB loading buffer con colorante nel tubo standard di RNA. </li><li> Eseguire il gel sotto 80 - 100 V all&#39;interno di una cappa chimica in tampone di corsa, fino a quando uno dei coloranti (blu di bromofenolo) raggiunge 2/3 del fondo del gel. </li><li> Sciacquare il gel due volte 15 min con 250 ml di DEPC trattati 2x SSC. </li><li> Prendete una immagine digitalizzata sotto illuminazione UV. </li><li> Calcolare il rapporto tra la banda superiore (23S rRNA) e la banda inferiore (16S rRNA). </li></ol> 4. La purificazione finale del RNA <ol><li> Regolare il volume del campione di RNA di 100 microlitri con DEPC trattati con H 2 O (se necessario). </li><li> Aggiungere 100 ml di acido fenolo (1 ml di fenolo saturato in DEPC trattati con H 2 O + 130 pl di 50 mM di acetato di sodio, pH 5,2), vortice vigorosamente. </li><li> Centrifugare la 10 min a 13.000 rpm (15.000 xg) a temperatura ambiente. </li><li> Recover attenzione e Trasferire la fase acquosa (fase superiore) in un romanzo una sterile 1,5 ml provetta. </li><li> Aggiungere 10 ml di acetato di sodio 3 M, pH 5,2 e 250 ml di etanolo al 100% (-20 ° C). </li><li> Incubare la provetta 30 min in ghiaccio fondente. </li><li> Centrifugare la provetta 30 min a 14.000 rpm (18.000 xg) a 4 ° C. </li><li> Aspirare accuratamente la frazione solubile, e buttarlo. </li><li> Aggiungere 500 ml di etanolo al 70% (temperatura ambiente), e il tubo vortex. </li><li> Centrifugare la provetta 20 min a 14.000 rpm (18.000 xg) a 4 ° C. </li><li> Ripetere la fase di risciacquo (70% di etanolo). </li><li> Centrifugare brevemente ed eliminare l&#39;etanolo residuo con una pipetta P200. </li><li> Lasciare asciugare il pellet per 10 min. </li><li> Risospendere il pellet in 50 ml di DEPC trattati con H 2 O. </li><li> Incubare quindi tubo 15 min a 45 ° C. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza (Abs) a 260 nm e 280 nm in 2 ml di campione di RNA. Calcolato il rapporto Abs260/Abs280. </li> &lt;li&gt; Conservare il campione di RNA a -80 ° C (stabile per diversi anni). </li></ol> 5. Soluzioni e procedure di pulizia <ol><li> Potassio acetato 2 M, pH 5.0: Sciogliere 19.6 g di acetato di potassio in 70 ml di DEPC trattati H 2 O. Pulire la sonda pH-metro da ammollo in con NaOH 1M per 15 minuti, seguita da 5 risciacqui con DEPC trattati con H 2 O. Regolare il pH a 5,0 con acido acetico quindi regolare il volume a 100 ml con DEPC trattati H 2 O. </li><li> Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, N-Lauroylsarcosine 1%: Sciogliere 2 g di N-Lauroylsarcosine (sotto una cappa) in 40 ml di 0,5 M Tris-base pH 8,0. Regolare il volume a 200 ml con DEPC trattati H 2 O.) CsCl / EDTA: 96 g di CsCl in 50 ml di 10 mM EDTA pH 7,5 preparato con DEPC trattati H 2 O. Autoclave e regolare il volume a 100 ml con DEPC trattati con H 2 O. Verificare la presenza di pH &lt;7,5. </li><li> Gel di agarosio 1%: Mettere 1 g di agarosio in 62 ml DEPC trattati H 2 O. Fate bollire in un forno a microonde. Aggiungere 18 ml di 12,3 Mformaldeide, 20 ml di MOPS 5x. Versare all&#39;interno di una cappa chimica. </li><li> Esempio di preparazione del buffer: Per essere estemporanea preparata. Mescolare in una cappa chimica 8 pl di MOPS 5x, 16 ml di 12,3 M formaldeide e 40 ml di formammide. </li><li> EB caricamento del buffer (senza colorante): Per essere estemporanea preparata. Aggiungere 4 microlitri 10 mg / ml di bromuro di etidio in 20 ml di glicerolo 80% preparato con DEPC trattati con H 2 O. </li><li> EB caricamento del buffer (con colorante): Per essere estemporanea preparata. Aggiungere 2 microlitri 10 mg / ml di bromuro di etidio in 10 ml di 80% glicerolo contenente 0,25% xilema cyanol, 0.25% blu di bromofenolo con DEPC trattati H 2 O. </li><li> Il tampone di corsa: a 60 ml MOPS 5x, aggiungere 54 ml di 12,3 M formaldeide e 186 ml di DEPC trattati con H 2 O. </li><li> DEPC trattati H 2 O: acqua distillata Incubare con 0,1% v / v dietilpirocarbonato per 2 ore a 37 ° C con agitazione. Sterilizzare in autoclave. </li><li> Pulizia del omogeneizzatore: Aggiungere 25 ml di soluzione di pulizia (RBS) a 1 L di DEPCtrattata H 2 O, e immergere l&#39;asse 1 min con agitazione. Incubare 2 ore a 60 ° C. Sciacquare abbondantemente con DEPC trattati con H 2 O avvolgere lo strumento in alluminio e mettere nella scatola strumento. Avvolgere la scatola. Sterilizzare in autoclave. </li><li> Pulizia del dispositivo per elettroforesi: Lavare l&#39;apparato, il vassoio e il pettine da 15 pozzetti. Incubare 15 min a 3% di acqua ossigenata. Risciacquare una volta con il 100% di etanolo. Aria secca. </li><li> Pulizia dei piatti di vetro: pulire i piatti di vetro RBS 2% per tutta la notte, poi sciacquare con acqua distillata prima di sterilizzazione a 200 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Mitry, D., Charteris, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+rhegmatogenous+retinal+detachment:+geographical+variation+and+clinical+associations.">The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations.</a> The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678 (2010).</li><li>Green, R. E., Krause, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+draft+sequence+of+the+Neandertal+genome.">A draft sequence of the Neandertal genome.</a> Science. 328 (5979), 710 (2010).</li><li>Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleic+acid+isolated+by+cesium+chloride+centrifugation.">Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation.</a> Biochemistry. 13 (12), 2633 (1974).</li><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA.">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663 (1990).</li><li>Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=coli+tRNAs+as+inhibitors+of+viral+reverse+transcription+in+vitro.">coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro.</a> Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315 (1975).</li><li>Sawadogo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+inhibition+of+yeast+RNA+polymerases+A+and+B+by+tRNA+and+alpha-amanitin.">On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin.</a> Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261 (1981).</li><li>Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+detachment+reveals+both+inflammatory+response+and+photoreceptor+death.">Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death.</a> PloS ONE. 6 (12), e28791 (2011).</li><li>Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RETINOBASE:+a+web+database,+data+mining+and+analysis+platform+for+gene+expression+data+on+retina.">RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina.</a> BMC Genomics. 9, 208 (2008).</li><li>Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+chemoattractant+protein+1+mediates+retinal+detachment-induced+photoreceptor+apoptosis.">Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425 (2007).</li><li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases:+from+clinic+to+redox+signaling.">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16 (2010).</li><li>Chalmel, F., Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+Cone+Viability+Factor-2+is+a+novel+bifunctional-thioredoxin-like+protein+with+therapeutic+potential.">Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential.</a> BMC Molecular Biology. 8, 74 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo sviluppo di una procedura di recupero tessuto dal blocco chirurgico è stato essenziale per l&#39;analisi del trascrittoma di distacco di retina. Si dovrebbe notare che questo tipo di intervento viene praticato in emergenza e che il oculisti operativo hanno poco tempo per partecipare a un programma di ricerca biologica in cui esse operano. Questo retinectomy viene anche eseguito stocasticamente in ogni servizio, in modo che il modo più facile raggiungere numeri statistici è di lavorare con una rete. In tale rete, l...

Il principale obiettivo terapeutico nel distacco di retina (RD) è di trovare un modo per limitare i danni fotorecettori retinici e infiammazione risultante dalla separazione dei fotorecettori dalle cellule epiteliali pigmentate retiniche. Durante RD, vengono attivati ​​cellule RPE, migrare, dedifferentiate, e proliferano sulla superficie della retina distaccata, esercitando forze contrattili conducono a complicazioni. Analisi trascrittomica di RD è un modo per identificare i geni bersaglio con l&#39;espressione modificata a seguito di RD e quindi futuri molecole terapeutiche che potrebbero migliorare il risultato visivo finale in combinazione con la chirurgia. E &#39;ben noto l&#39;acido ribonucleico (RNA) non è stabile come è acido desossiribonucleico (DNA), quest&#39;ultimo essendo ampiamente utilizzato per studi genetici, la sua stabilità aveva permesso il sequenziamento del genoma Neanderthal da campioni paleontologici di più di 30.000 anni 2. Trascrizione del DNA dei geni dal genoma in RNA messaggero è l&#39;processo importante nell&#39;espressione genica, e l&#39;mRNA è labile per costituire un segnale. RNA sono molto rapidamente degradato dalla RNAsi enzimi che terminano il segnale. Quando i tessuti sono isolati da un organismo, gli RNA sono molto spesso degradate prima che l&#39;espressione è studiata in un laboratorio di ricerca. RNA degradato non è adatto per l&#39;analisi di espressione genica. Perché il personale di laboratorio non può partecipare in chirurgia, abbiamo sviluppato una procedura che è facile e richiede solo che il chirurgo di recuperare i tessuti in un&#39;appropriata soluzione RNase-free. L&#39;RNA dei tessuti è stabile e può essere analizzate senza segni di degradazione dopo 72 ore a temperatura ambiente in questa soluzione. Gli RNA da campioni vengono purificati mediante un metodo standardizzato che coinvolge un ultracentrifugazione su un gradiente di cloruro di cesio dopo essere stato trasferito al laboratorio 3. Poi, la qualità degli RNA sono valutati mediante elettroforesi su gel di agarosio e mediante RT-PCR. Il protocollo di purificazione dell&#39;RNA ha l&#39;vantaggio di separare le molecole secondo la loro densità che è diversa per DNA e RNA e assicura che l&#39;RNA non viene contaminato da una molecole di DNA che generano segnali artefatti in studi di espressione genica. Inoltre, gli RNA di trasferimento (tRNA), che sono quantitativamente le RNA più abbondanti all&#39;interno di una cellula, siano separate per la stessa proprietà fisico dal RNA ribosomiale (rRNA) e gli RNA messaggero (mRNA), quei due ultimo la prodotto finale del processo di depurazione. La rimozione del tRNA dalla preparazione è utile in quanto la maggior parte dei protocolli di analisi di microarray coinvolto l&#39;uso di trascrittasi inversa e la RNA polimerasi, che sono inibiti da tRNA 4-6. L&#39;RNA purificato da campioni chirurgici sono etichettati utilizzando il protocollo standard e ibridati un chip microarray ed i risultati vengono analizzati utilizzando due metodi complementari, il metodo tasso scoperta falsi, e utilizzando un nuovo metodo basato su informazioni reciproca e visualizzed sul server web-based Retinobase 7,8.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>Aventi J-E</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>JS-5.3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultracentrifuge</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>LE 80K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>SW41</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Power supply</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>Pac 3000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PolytronTM</td>
 <td>Kinematica</td>
 <td>PT 2100</td>
 <td>Supplied with PT-DA 2105:2</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose gel electrophoresis device</td>
 <td>Biorad</td>
 <td>MiniGel Cell GT</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Imaging System </td>
 <td>Biorad</td>
 <td>GelDoc-It Imager</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml sterile polyethylene tube</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>115261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sterile polyallomer centrifuge tube </td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>331372</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemical reagents</td>
 <td>Sigma</td>
 <td></td>
 <td>Molecular biology grade (RNase and DNase free products)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cleaning Solution </td>
 <td>VWR </td>
 <td>RBS</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microarray chip</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>Human U133 plus 2 array</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using journal

Distacco di retina (RD) descrive una separazione della retina neurosensoriale dalla epitelio pigmentato retinico (RPE). La RPE è essenziale per la normale funzione dei neuroni sensibili alla luce, i fotorecettori. Distacco della retina dal RPE crea un gap fisico che è pieno di fluido extracellulare. RD avvia eventi avversi cellulari e molecolari che influenzano sia la retina neurosensoriale e la RPE in quanto lo scambio fisiologico di ioni e metaboliti è gravemente perturbato. La conseguenza per la visione è legata alla durata del distacco poiché una rapida reapposition dei due tessuti determina il ripristino della visione 1. Il trattamento della RD è esclusivamente chirurgica. Rimozione del gel vitreale (vitrectomia) è seguita dalla rimozione non parte essenziale della retina intorno alla zona distaccata per favorire il distacco di retina. Gli esemplari della retina rimosse sono res nullius (nulla) e di conseguenza normalmente scartati.Per recuperare RNA da questi campioni chirurgici, abbiamo sviluppato la procedura ufficiale che permette di RNA conservazione durante il trasferimento dal blocco chirurgico al laboratorio. Abbiamo anche un protocollo standardizzato per purificare l&#39;RNA da cesio ultracentrifugazione cloruro di assicurare che gli RNA purificati sono adatti per l&#39;analisi globale dell&#39;espressione genica. La qualità del RNA è stato convalidato sia mediante RT-PCR e microarray. L&#39;analisi dei dati mostra un coinvolgimento simultaneo di infiammazione e la degenerazione dei fotorecettori durante RD.

La procedura ufficiale (figura 1) permette a recuperare esemplari di retina dal blocco chirurgico di RNA purificato, e di analizzare il trascrittoma di distacco di retina. Risultati distacco di retina in up-regulation del chemiotattica dei monociti MCP1 gene CCL2, e nella diminuzione della espressione del fotorecettore asta di trasduzione genica GNAT1, l&#39;onda corta cono opsina OPN1SW, e la homeogene CRX (Figura 2). L&#39;induzione di CCL2...

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Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Abbiamo utilizzato campioni di retina da retinectomy per un&#39;analisi trascrittomica di distacco di retina. Abbiamo sviluppato una procedura che consente la conservazione di RNA tra i blocchi chirurgici e il laboratorio. Abbiamo standardizzato un protocollo per purificare l&#39;RNA da cesio ultracentrifugazione cloruro di assicurare che gli RNA purificati sono adatti per l&#39;analisi di microarray.

Analisi trascrittomica di campioni chirurgici retiniche umane Utilizzo ufficiale

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

transcriptomic-analysis-human-retinal-surgical-specimens-using

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7.7K Views.  Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale. Abbiamo utilizzato campioni di retina da retinectomy per un'analisi trascrittomica di distacco di retina. Abbiamo sviluppato una procedura che consente la conservazione di RNA tra i blocchi chirurgici e il laboratorio. Abbiamo standardizzato un protocollo per purificare l'RNA da cesio ultracentrifugazione cloruro di assicurare che gli RNA purificati sono adatti per l'analisi di microarray.

Video: Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Metodo per Novel Anti-Cancer Drug Development utilizzando Espianti Tumore di campioni chirurgici


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

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Medicina

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocollo migliorato per microdissezione laser di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell culture systems arising from human endometrial samples are no exception. Applications range from normal cyclic physiological processes to endometrial pathologies such as gynecological cancers, infectious diseases, and reproductive deficiencies. Here, we provide two methods for establishing primary endometrial stromal cells from surgically resected endometrial hysterectomy specimens. The first method is referred to as &#8220;the scraping method&#8221; and incorporates mechanical scraping using surgical or razor blades whereas the second method is termed &#8220;the trypsin method.&#8221; This latter method uses the enzymatic activity of trypsin to promote the separation of cells and primary cell outgrowth. We illustrate step-by-step methodology through digital images and microscopy. We also provide examples for validating endometrial stromal cell lines via quantitative real time polymerase chain reactions (qPCR) and immunofluorescence (IF).

Establishing primary endometrial stromal cell culture systems from hysterectomy specimens is a valuable biological technique and a crucial step prior to pursuing a vast array of research aims. Here, we describe two methods used to establish stromal cultures from surgically resected endometrial tissues of human patients.&#160;

Due metodi per stabilire primarie cellule umane endometriale stromali da isterectomia campioni

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Un passo per passo protocollo per la chirurgia sottoretinico in Conigli

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Generazione di un umanizzato mouse Fegato Utilizzando epatici umani cellule staminali

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

Videomicroscopia microscopia del sistema vascolare del tumore-associati utilizzando avanzate dorsale dello Skinfold finestra Chambers su topi transgenici fluorescenti

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

Utilizzo In Vitro cellule vive di Imaging per esplorare chemioterapici consegnato da nanoparticelle di basata sui lipidi

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...

Surgical Training for the Implantation of Neocortical Microelectrode Arrays Using a Formaldehyde-fixed Human Cadaver Model

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. Recent technological progress has enabled the fabrication of microelectrode arrays that allow recording the activity of multiple individual neurons in the neocortex of the human brain. These arrays have the potential to bring unique insight onto the neuronal correlates of cerebral function in health and disease. Furthermore, the identification and decoding of volitional neuronal activity opens the possibility to establish brain-computer interfaces, and thus might help restore lost neurological functions. The implantation of neocortical microelectrode arrays is an invasive procedure requiring a supra-centimetric craniotomy and the exposure of the cortical surface; thus, the procedure must be performed by an adequately trained neurosurgeon. In order to provide an opportunity for surgical training, we designed a procedure based on a human cadaver model. The use of a formaldehyde-fixed human cadaver bypasses the practical, ethical and financial difficulties of surgical practice on animals (especially non-human primates) while preserving the macroscopic structure of the head, skull, meninges and cerebral surface and allowing realistic, operating room-like positioning and instrumentation. Furthermore, the use of a human cadaver is closer to clinical daily practice than any non-human model. The major drawbacks of the cadaveric simulation are the absence of cerebral pulsation and of blood and cerebrospinal fluid circulation. We suggest that a formaldehyde-fixed human cadaver model is an adequate, practical and cost-effective approach to ensure proper surgical training before implanting microelectrode arrays in the living human neocortex.

We designed a procedure in which a formaldehyde-fixed human cadaver is used to assist neurosurgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain.

Training chirurgico per l'impianto di microelettrodi Neocortical utilizzando un modello di cadavere umano formaldeide-fisso

This protocol describes a procedure to assist surgeons in training for the implantation of microelectrode arrays into the neocortex of the human brain. ...

Diagnosis and Surgical Treatment of Human Brucellar Spondylodiscitis

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in pastoral communities. It is difficult to differentially diagnose and usually leads to irreversible neurologic deficits and spinal deformities. The initial diagnosis of BS is based on clinical findings and radiographic assessments, and the confirmed diagnosis should be established by the isolation of Brucella species from the blood and/or the standard tube agglutination test. Differential diagnosis of multifocal BS from either degenerative disc diseases or tuberculosis is especially highlighted. The surgical approach, either endoscopic or open, is demonstrated in detail, accompanied by radiographic evidence of structural compression or severe instability. Further, the crucial surgical steps, including single-stage transforaminal decompression, debridement, interbody fusion, and internal fixation, are explained. Moreover, perioperative care and postoperative rehabilitation are also addressed. Taken together, this clinical algorithm presents a practical guide that has yielded substantially satisfactory outcomes in the past decades, which can also be introduced for large-scale application to manage human BS, especially in endemic regions.

We describe a clinical algorithm, based on decades of front-line experience of diagnosis and surgical treatment of human Brucellar spondylodiscitis in the largest medical center of the China's Xinjiang Pastoral Area.

Diagnosi e trattamento chirurgico della spondilodiscite brucellare umana

Brucellar spondylodiscitis (BS) is the most prevalent and significant osteoarticular presentation of human Brucellosis, which is commonly manifested in ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

Induzione e analisi dello stress ossidativo nelle cellule epiteliali del pigmento retinico umano trasforato dalla bella addormentata nel bosco

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...