L&#39;American Cancer Society (MRSG-08-108-01), Vincent J. Sgro / L&#39;American Association tumore al cervello, e la famiglia Khan Foundation per I Nakano.

1. Preparazione dei terreni <ol><li> Il supporto è stato preparato utilizzando il 10% FBS (16140-071 - GIBCO) in DMEM/F-12 (1X), liquido 1:1 (10565-042 - Invitrogen) con la soluzione Agar 0,6% depurata, granulato (1.01614.1000-EMD ). Condizioni sterili sono stati mantenuti tutto l&#39;esperimento. </li><li> Per la preparazione di 5 ml media di FBS (16140-071 - GIBCO) è stato aggiunto a 45ml di DMEM/F-12 (1X), liquido 1:1 (10565-042 - Invitrogen) rendendo volume finale di 50 mL. I media preparato è stato tenuto a bagnomaria a 37 ° C di temperatura. </li><li> La soluzione di agar è stato redatto utilizzando il metodo di calore a microonde. 0,3 grammi di agar granulato è stato dissolto in 50mL di acqua distillata usando microonde. La soluzione è stata raffreddare agar a 37 ° C di temperatura, mantenendo in bagno d&#39;acqua. </li><li> Abbiamo usato uguale volume di mezzi di comunicazione a partire dal punto 1.2 e 1.3 e la soluzione madre preparata. Il rapporto del 0,6% agar (0,5 ml) e 10% FBS-D-MEM/F-12 media (0,5 ml) è stato 1:1, rendendo il volume totale di 1 ml in ciascun pozzetto di 6 piastre. </li></ol> 2. Lavorazione dei tessuti <ol><li> Glioblastoma Multiforme (GBM) tessuti sono stati ricevuti immediatamente dopo l&#39;intervento del Dipartimento di Patologia. Il tessuto è stato classificato come GBM dal Dipartimento di Patologia. </li><li> Il tessuto è stato trasferito al patri-plate con pinze con cura e lavati con ghiacciata 1XPBS 5 ml per 3 volte. </li><li> Sezioni seriali dei campioni sono stati tagliati dai campioni sezionato per creare blocchi di tumore (circa 10 mm di diametro) con una lama chirurgica (Feather-2976 # 10) e pinza (Fisher Scientific). </li><li> I blocchi sono stati trasferiti in un piatto ben 6. Ogni pozzo è stato contenente 1 ml di media menzione al punto 1.4. Il tessuto era abbastanza esposizione all&#39;aria per mantenere i tessuti vitali. </li><li> Sezioni tumorali sono state iniettate sia con DMSO (5%) o TMZ (2,5 nM) e incubate per 16 ore a 37 ° C in aria umidificata contenente il 5% di CO2. 0,1 ml di DMSO (5%) o TMZ è stato iniettato 3 volte in blocchi di tumore in diversi luoghi per il trattamento coerente. Il farmaco è stato iniettato con siringa per insulina da 1 ml 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Comfort punto-26027). </li><li> Dopo 16 ore i blocchi sono stati lavati con 5 1XPBS ml per 3 volte. Dopo aver lavato i blocchi sono stati fissati con 10 ml di 10% v / v formalina per 24 ore (Ricca azienda chimica) in 50 mL (Basix-5539802) e trattati per paraffina 4 _m sezioni. </li><li> La sezione formalina fisso è stato posto in coppa sul piatto mescolate con &quot;NO HEAT&quot; ed elaborate attraverso le seguenti soluzioni per 30 minuti in ogni soluzione. 30% etanolo, 50% etanolo, 75% etanolo, 80% etanolo, 95% etanolo, 100% etanolo e xilene. </li><li> Il tessuto è stato cancellato su carta assorbente e posto in paraffina fusa (58 a 60 ° C, Fisher paraffina Paraplast) per 30 minuti. </li><li> Il tessuto è stato incorporato in stampi usando Surgipath paraffina Blue Ribbon, il tessuto incapsulato è stato raffreddato a temperatura ambiente. </li><li> Paraffina sezioni di tessuto incluso 4 _m sono stati prelevati e posti su Fisher diapositive Plus. </li></ol> 3. Immunoistochimica L&#39;immunoistochimica è stata effettuata come descritto in precedenza 1. <ol><li> Deparaffinizzazione e Place reidratazione i vetrini in un rack ed eseguire i seguenti passaggi. Xilene per 3x5 minuti (3 volte per 5 minuti), 100% di etanolo per i minuti 3x5, etanolo al 95% per i minuti 1x5, etanolo al 70% per i minuti 1x5, sciacquare in acqua corrente per 3 minuti. </li><li> Recupero dell&#39;antigene con calore indotto epitopo recupero Immergere i vetrini in tampone citrato 1X (Thermo scientifico-AP9003-500) diluita in acqua distillata in un bicchiere di vetro. Fate bollire per 15 minuti su una piastra riscaldante (assicurarsi sezioni don &quot;t cadere la diapositiva). Raffreddare la soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare i vetrini con PBS 1X per 3x5 minuti. </li><li> L&#39;inibizione di perossido interno Immergere i vetrini in metanolo (Fisher Scientific-A-452-4) con perossido di idrogeno 0,3% (Fisher Scientific-BP2633-500-diluito in acqua distillata) in un bicchiere di vetro per 15 minuti. Sciacquare in PBS 1X per 3x5 minuti. </li><li> Blocco Coprire i tessuti con il 10% di siero normale di capra. Trasferire i vetrini in una scatola umida per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare i vetrini con PBS 1X per 3x5 minuti. </li><li> Sezioni anticorpo primario sono state incubate overnight a 4 ° C con l&#39;anticorpo primario a concentrazioni seguenti: umane specifiche caspasi-3 (1:1000, sistemi di R &amp; S, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15626) diluito con PBS 1X. Sciacquare i vetrini in PBS 1X minuti 3x10 il giorno successivo. </li><li> Reazione anticorpo secondario Coprire i tessuti con 2-3 gocce di anticorpo secondario marcato con HRP (immaginare sistemi). Mettere le diapositive di una scatola umida per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare con PBS 1X per 3x10 minuti. </li><li> Sviluppare il rilevamento per il cromogeno DAB kit (Vector laboratori-SK-4100) per l&#39;individuazione di anticorpi primario in seguito al protocollo del produttore. </li><li> Colorazione contatore Immergere i vetrini con ematossilina (10-15 s<html> econdi, assicurarsi don &quot;t superamento del segnale DAB). Risciacquare con acqua corrente per 3 minuti. </li><li> Immergere disidratazione le diapositive nel seguente ordine, etanolo al 70% per 5 minuti, etanolo al 95% per 5 minuti, 100% di etanolo per i minuti 3x5, xilene per 3x5 minuti. </li><li> Coprire scivolare i vetrini con permount reagente di montaggio (Fisher Scientific-SP-15-100). </li><li> Le immagini sono state scattate con microscopio a fluorescenza Olympus (DP-72) .3.11). In tutti gli esperimenti, specifiche di etichettatura è stata confermata dal controllo negativo senza anticorpo primario. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Abbiamo raccolto campioni chirurgici di glioblastoma multiforme (GBM). I pazienti sono stati sottoposti il ​​primo intervento senza precedenti chemioterapie compresi temozolomide (TMZ). Il T1 pesate immagine di risonanza magnetica con gadolinio miglioramento nella figura-1a ha dimostrato un tumore rafforzata nel lobo frontale destro prima dell&#39;intervento chirurgico. L&#39;immagine postoperatoria (figura 1b) ha confermato la rimozione subtotale della lesione dopo l&#39;intervento. I tessuti chirurgici sono stati inviati al Dipartimento di Patologia a scopo diagnosi clinica, e gli esemplari rimasti sono stati elaborati per il prelievo del tessuto sotto il Consiglio ha approvato Institutional Review (IRB) protocollo presso la Ohio State University Medical Center. Ematossilina ed eosina (H &amp; E) colorazione dimostrato la presenza di necrosi, le cellule pseudopallisading, e la proliferazione microvascolare (Figura 1-c). Così, questi tumori sono stati diagnosticati come istopatologicamente GBM. Di nota, gli espianti tumorali dopo l&#39;incubazione senza TMZ fino a 48 ore mantenuto la citoarchitettura di GBM. Al contrario, con incubazione per 72 ore o più, abbiamo notato l&#39;aumento del numero di nuclei condensato nei campioni, suggerendo alcune delle cellule tumorali iniziano a apoptosi. Come risultato, i tessuti tumorali dopo incubazione più contenute le regioni macchia di leopardo che ha perso le cellule tumorali, che sono stati osservati e preferenzialmente in prossimità delle aree necrotiche (dati non riportati). Al fine di indagare se questi campioni espianto tumore può attendibilmente essere utilizzati a scopo di test di droga efficacia, abbiamo testato l&#39;effetto del trattamento TMZ. Figura-2 rappresenta il flusso degli esperimenti in questo studio. Uno studio recente ha indicato che l&#39;iniezione intratumorale di TMZ ha un effetto più potente sul controllo della crescita del glioma maligno di quella della somministrazione sistemica di questo farmaco 2. Dopo l&#39;incubazione per 16 ore, questi espianti sono stati integrati con paraffina e le sezioni di serie sono state preparate per la colorazione. Immunoistochimica di TMZ trattati con tessuti GBM dimostrato una riduzione sostanziale di Ki-67-positive cellule tumorali rispetto ai campioni di controllo. A sua volta, immunoistochimica con un marker apoptosi, caspasi-3, non ha dato alcuna differenza significativa tra i campioni trattati con TMZ glioma e campioni di controllo (figura-3). Effetti del trattamento con TMZ è stata ulteriormente caratterizzata dalla combinazione di questo saggio espianto insieme sia in coltura in vitro o di citometria a flusso. In particolare, abbiamo cercato di determinare l&#39;effetto sulla cellule staminali come le cellule tumorali (SCLTC). Pertanto, a seguito del trattamento intratumorale con TMZ, abbiamo effettuato test sfera formazione e citometria a flusso di questi espianti tumorali. Il TMZ campioni sono stati trattati con dissociate in singole celle singole e le singole cellule sono state seminate a bassa densità (1 cellule per microlitro o inferiore) in piastre da 96 pozzetti in mezzo privo di siero integrato con bFGF e FEG. Nel gruppo di controllo, la formazione di sfere tumore dal espianti tumore è stata osservata dopo 7 giorni di incubazione. Dato che la formazione sfera è una proprietà di SCLTC 3 4, alterazioni nel numero di sfere del tumore da un trattamento farmacologico indica l&#39;effetto sulla SCLTC. Allo stesso modo, citometria a flusso degli espianti tumore dissociato con un pennarello superficie cellulare, CD133, è stato effettuato per verificare l&#39;effetto sulla SCLTC. Se SCLTC nelle cellule tumorali eterogenei in GBM sono selettivamente sradicato da un trattamento farmacologico, si potrebbe prevedere che la citometria a flusso dovrebbe rilevare diminuzione della CD133-positivi frazione di trattamento (dati non riportati). <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figure.1 immagini di risonanza magnetica (MRI) di un paziente GBM. Personaggi rappresentante di pre-operazione Figura-1a e post-operazione Figura-1b. Figura 1c è colorazione H &amp; E di nuovo campione del tessuto GBM. Ingrandimento originale, 40X. <img src="/files/ftp_upload/2846/2846fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura. 2 Il flusso sperimentale dell&#39;esperimento blocco della cultura. Figura-2a. Immagine di fresco GBM chirurgico ricevuto dal dipartimento di patologia. Figura 2b mostra Dissezione del blocco del tumore in 10 millimetri piccoli pezzi con la lama aiuto chirurgico. Figura-2c è la (TMZ) il trattamento farmacologico di sezioni tumorali con siringa da insulina. e 3 &quot;/&gt; Figura. 3 Immunoistochimica. Immunoistochimica di blocchi di tessuto GBM iniettato con DMSO o TMZ con attivato Caspasi-3 e Ki67. Ematossilina è stato utilizzato per la colorazione nucleare. Ingrandimento originale, 40X.

<ol>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

C&#39;è un divario tra l&#39;efficacia della droga nelle attuali modelli sperimentali pre-clinici e l&#39;efficacia nei pazienti. Più in particolare, nel campo della ricerca tumore cerebrale, nuovi metodi e affidabili, sono necessari aiuterebbe colmare il divario esistente tra la valutazione della droga con i metodi attuali e l&#39;efficacia nei pazienti. Il dosaggio descritti in questo studio è un ulteriore vantaggio, se non una soluzione, per facilitare il riempimento della discrepanza dei dati sperimentali e l&#39;esito dei pazienti affetti. Colture cellulari in vitro preferenzialmente espandere alcuni tipi di cellule tumorali indipendentemente dalle condizioni di coltura, e rappresentano solo una sottopopolazione di l&#39;intero tumore. 5 Inoltre, la trasformazione genetica e fenotipica della cellula artificiale espansione si verifica ed è inevitabile, con il lungo termine colture cellulari . Uno degli ostacoli principali per il trattamento di glioma maligno è l&#39;eterogeneità delle cellule tumorali, sia all&#39;interno di un singolo tumore e tra i campioni tumorali 6, 7. Pertanto, l&#39;arricchimento selettivo di una certa popolazione di cellule tumorali, a prescindere di un tipo o un altro, non può essere un mezzo appropriato per determinare l&#39;efficacia di eventuali agenti chemioterapici sulle cellule tumorali eterogenei. 8 9 Tutti i modelli animali di tumori al cervello derivato da una sottopopolazione di cellule tumorali capannone luci efficacia del farmaco su una sottopopolazione, ma non l&#39;intero tumore. Diverse limitazioni, d&#39;altra parte, restano ancora in questo metodo dell&#39;espianto tumore. Una tale limitazione è il periodo relativamente breve di trattamento. Dal momento che le cellule tumorali maligne sono considerati di acquisire resistenza alla maggior parte, se non tutte, le terapie nel tempo, controllo iniziale di breve termine la crescita delle cellule del tumore non può essere riflessa dalla prognosi a lungo termine dei pazienti, come è stato recentemente segnalato con un anti- antiangiogenico, bevacizumab 10. Così, il miglioramento del protocollo per questo dosaggio espianto di conservare i tessuti per un periodo più lungo è richiesto con ulteriori indagini. Un&#39;altra questione è uno specifico effetto di un farmaco testato su SCLTC nel tumore. Dato che SCLTC sono relativamente resistenti alle terapie correnti per glioma maligno, identificazione di nuovi farmaci anti-cancro che potentemente sradicare SCLTC è garantito. A questo proposito, che attualmente cerca di combinare questo test con la conseguente espianto in esperimenti in vitro, come neurosfere test di formatura (dati non riportati). Ci aspettiamo di saperne di più circa gli effetti, se del caso, di un candidato farmaco su SCLTC attraverso questi test combinato. Infine, con piccoli blocchi di campioni tumorali potrebbero non riflettere l&#39;intera popolazione delle cellule tumorali, come è il caso con le linee cellulari tumorali convenzionali o colture primarie da campioni chirurgici. Questi problemi a parte, conservando stroma del tumore, tra cui la nicchia vascolari, è utile per caratterizzare i fattori ambientali per le cellule tumorali. Pertanto, questo test potrebbe avere un potenziale per valutare eventuali strategie terapeutiche in una condizione più fisiologicamente rilevanti. Qui, abbiamo istituito un test per testare l&#39;efficacia dei farmaci con espianti di campioni chirurgici di GBM. Infatti, con i campioni testati chirurgico, abbiamo trovato che l&#39;iniezione diretta di TMZ riduce la proliferazione nei campioni GBM. Questo metodo espianto tessuto è teoricamente applicabile ad altri tumori solidi e fornisce asset per determinare l&#39;efficacia della droga sul tumore di un paziente, che si spera ci aiutano a evitare un altro fallimento negli studi clinici per i tumori.

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino, qualificato, inattivato per calore </td><td> GIBCO </td><td> 16140-071 </td></tr><tr><td> D-MEM/F-12 (1X) Liquid 01:01 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-042 </td></tr><tr><td> Agar-Agar purificata, granulato </td><td> EMD </td><td> 1.01614.1000 </td></tr><tr><td> DPBS per la colorazione </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td></tr><tr><td> Hematoxyllin </td><td> Richalrd allan sci </td><td> 7211 </td></tr><tr><td> 10% w / v formalina Caspasi-3 </td><td> Ricca azienda chimica </td><td> 3810 </td></tr><tr><td> Caspasi-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> AF835 </td></tr><tr><td> Ki67 </td><td> Dako </td><td> 15626 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td></tr><tr><td> Immaginate di sistema anti-topo </td><td> Dako </td><td> 2012-07 </td></tr><tr><td> Immaginate di sistema anti-coniglio </td><td> Dako </td><td> 2011-12 </td></tr><tr><td> DAB-kit </td><td> Vector Lab. </td><td> SK-4100 </td></tr></table> Tabella 1. Materiali. <table border="1"><tr><td> Nome del materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 6 pozzetti </td><td> Greiner-bio uno </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Scatola di Petri </td><td> VWR </td><td> 25384-302 </td></tr><tr><td> Sierologici pipetta </td><td> Axygen </td><td></td></tr><tr><td> Puntali con filtro </td><td> USA scientifica </td><td></td></tr><tr><td> 500 micron in poliestere Netwell inserire </td><td> Co-star </td><td> 3480 </td></tr><tr><td> Matrigel Matrix </td><td> BD Biosciences </td><td> 354230 </td></tr><tr><td> BD siringa da 10 ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Aghi ipodermici mozzo in alluminio. </td><td> Tyco Health Care </td><td> 2000029 </td></tr><tr><td> Tessuto cultura fiasco </td><td> Corning </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga tubi </td><td> Basix </td><td> 5539800 </td></tr><tr><td> Tubi a parete sottile </td><td> Eton </td><td> 1107A </td></tr><tr><td> Chirurgico lama in acciaio inox </td><td> Piuma </td><td> 2976 # 10 </td></tr><tr><td> Siringa di insulina </td><td> Comfort punto </td><td> 26027 </td></tr><tr><td> 50mL piatto tappo a vite tappo del tubo </td><td> Basix </td><td> 5539802 </td></tr><tr><td> Dissezione microscopio </td><td> Tritech </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Olimpo </td><td> DP-72 </td></tr><tr><td> Pinza </td><td> Sci Fisher </td><td></td></tr></table> Tabella 2. Apparecchiature.

method for novel anti-cancer drug development using tumor explants of surgical specimens

Le terapie attuali per glioma maligno hanno solo effetto palliativo. Per lo sviluppo terapeutico, un ostacolo è la discrepanza di efficacia determinate con prove correnti dell&#39;efficacia dei farmaci e l&#39;efficacia sui pazienti. Così, nuovi metodi e affidabile per valutare l&#39;efficacia dei farmaci sono garantiti in fase pre-clinica. Coltura in vitro di tessuti tumorali, tra cui le linee cellulari, ha notevoli alterazioni fenotipiche, genetiche ed epigenetiche delle cellule di cancro causata da ambiente artificiale delle colture cellulari, che potrebbero non corrispondere la biologia dei tumori in situ originale. Modelli di xenotrapianto con i topi immunodeficienti inoltre hanno dei limiti, cioè, la mancanza del sistema immunitario e interspecie discrepanze genetiche ed epigenetiche nel microambiente. Qui, dimostrare un nuovo metodo utilizzando i campioni chirurgici di glioma maligno come blocchi del tumore non dissociato per valutare gli effetti del trattamento. Per convalidare questo metodo, i dati con l&#39;attuale prima linea agente chemioterapico, temozolomide (TMZ), sono descritti. Abbiamo usato il fresco campione chirurgico di rimozione glioma maligno per i nostri esperimenti. Abbiamo eseguito l&#39;iniezione intratumorale di TMZ o candidati di altre droghe, seguita da incubazione e analisi su campioni chirurgici. Qui, abbiamo cercato di stabilire un tumore metodo espianto di tessuto come una piattaforma per determinare l&#39;efficacia di nuovi agenti anti-cancro della terapia allo scopo che noi possiamo essere in grado di superare, almeno, alcuni dei limiti attuali e colmare il divario esistente tra la sperimentazione current dati e l&#39;efficacia sul tumore di un paziente effettivo. Questo metodo può avere il potenziale per accelerare identificare nuovi agenti chemioterapici per la cura dei tumori solidi.

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Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Qui, abbiamo stabilito un metodo per verificare l&#39;efficacia della droga con campioni chirurgici di tumori al cervello, chiamata &quot;metodo dell&#39;espianto del tumore&quot;. Con questo metodo, siamo in grado di valutare l&#39;efficacia del farmaco senza rompere il microambiente dei tumori solidi. Per convalidare l&#39;affidabilità di questo metodo, si descrivono i dati rappresentativi con i nostri campioni di glioma trattati con l&#39;attuale prima linea agente chemioterapico, temozolomide.

Metodo per Novel Anti-Cancer Drug Development utilizzando Espianti Tumore di campioni chirurgici


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

method-for-novel-anti-cancer-drug-development-using-tumor-explants

Research

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16.5K Views.  The Ohio State University Medical Center. Qui, abbiamo stabilito un metodo per verificare l'efficacia della droga con campioni chirurgici di tumori al cervello, chiamata "metodo dell'espianto del tumore". Con questo metodo, siamo in grado di valutare l'efficacia del farmaco senza rompere il microambiente dei tumori solidi. Per convalidare l'affidabilità di questo metodo, si descrivono i dati rappresentativi con i nostri campioni di glioma trattati con l'attuale prima linea agente ch...

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Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocollo migliorato per microdissezione laser di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

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Medicina

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Un romanzo ad alta risoluzione<em&gt; In vivo</em&gt; Tecnica di imaging per studiare la risposta dinamica di strutture intracraniche alla crescita del tumore e Terapeutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Transcriptomic Analysis of Human Retinal Surgical Specimens Using jouRNAl

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal function of the light sensitive neurons, the photoreceptors. Detachment of the retina from the RPE creates a physical gap that is filled with extracellular fluid. RD initiates cellular and molecular adverse events that affect both the neurosensory retina and the RPE since the physiological exchange of ions and metabolites is severely perturbed. The consequence for vision is related to the duration of the detachment since a rapid reapposition of the two tissues results in the restoration of vision 1. The treatment of RD is exclusively surgical. Removal of vitreous gel (vitrectomy) is followed by the removal non essential part of the retina around the detached area to favor retinal detachment. The removed retinal specimens are res nullius (nothing) and consequently normally discarded. To recover RNA from these surgical specimens, we developed the procedure jouRNAl that allows RNA conservation during the transfer from the surgical block to the laboratory. We also standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for global gene expression analysis. The quality of the RNA was validated both by RT-PCR and microarray analysis. Analysis of the data shows a simultaneous involvement of inflammation and photoreceptor degeneration during RD.

We used retinal samples from retinectomy for a transcriptomic analysis of retinal detachment. We developed a procedure that allows RNA conservation between the surgical blocks and the laboratory. We standardized a protocol to purify RNA by cesium chloride ultracentrifugation to assure that the purified RNAs are suitable for microarray analysis.

Analisi trascrittomica di campioni chirurgici retiniche umane Utilizzo ufficiale

Retinal detachment (RD) describes a separation of the neurosensory retina  from the retinal pigmented epithelium (RPE). The RPE is essential for normal  ...

An Affordable HIV-1 Drug Resistance Monitoring Method for Resource Limited Settings

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in sub-Saharan Africa continue to expand, individuals on ART should be closely monitored for the emergence of drug resistance. Surveillance of transmitted drug resistance to track transmission of viral strains already resistant to ART is also critical. Unfortunately, drug resistance testing is still not readily accessible in resource limited settings, because genotyping is expensive and requires sophisticated laboratory and data management infrastructure. An open access genotypic drug resistance monitoring method to manage individuals and assess transmitted drug resistance is described. The method uses free open source software for the interpretation of drug resistance patterns and the generation of individual patient reports. The genotyping protocol has an amplification rate of greater than 95% for plasma samples with a viral load &#62;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The sensitivity decreases significantly for viral loads &#60;1,000 HIV-1 RNA copies/ml. The method described here was validated against a method of HIV-1 drug resistance testing approved by the United States Food and Drug Administration (FDA), the Viroseq genotyping method. Limitations of the method described here include the fact that it is not automated and that it also failed to amplify the circulating recombinant form CRF02_AG from a validation panel of samples, although it amplified subtypes A and B from the same panel.

Drug resistance testing for HIV-1 infected individuals failing antiretroviral therapy (ART) can guide future therapies and improve treatment outcomes. Optimizing individual and population health outcomes in high HIV prevalence but resource-limited settings will ultimately require affordable and accessible drug resistance genotyping and interpretation methods.

Un metodo di monitoraggio Affordable HIV-1 resistenza ai farmaci per le impostazioni limitate risorse

HIV-1 drug resistance has the potential to seriously compromise the effectiveness and impact of antiretroviral therapy (ART). As ART programs in ...

A Mouse Tumor Model of Surgical Stress to Explore the Mechanisms of Postoperative Immunosuppression and Evaluate Novel Perioperative Immunotherapies

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to the development of metastatic disease in animal models and in cancer patients. Preclinical work from our group and others has demonstrated a profound suppression of innate immune function, specifically NK cells in the postoperative period and this plays a major role in the enhanced development of metastases following surgery. Relatively few animal studies and clinical trials have focused on characterizing and reversing the detrimental effects of cancer surgery. Using a rigorous animal model of spontaneously metastasizing tumors and surgical stress, the enhancement of cancer surgery on the development of lung metastases was demonstrated. In this model, 4T1 breast cancer cells are implanted in the mouse mammary fat pad. At day 14 post tumor implantation, a complete resection of the primary mammary tumor is performed in all animals. A subset of animals receives additional surgical stress in the form of an abdominal nephrectomy. At day 28, lung tumor nodules are quantified. When immunotherapy was given immediately preoperatively, a profound activation of immune cells which prevented the development of metastases following surgery was detected. While the 4T1 breast tumor surgery model allows for the simulation of the effects of abdominal surgical stress on tumor metastases, its applicability to other tumor types needs to be tested. The current challenge is to identify safe and promising immunotherapies in preclinical mouse models and to translate them into viable perioperative therapies to be given to cancer surgery patients to prevent the recurrence of metastatic disease.

A mouse tumor model of surgical stress is used to explore how postoperative immune suppression promotes metastatic disease and to evaluate immunostimulatory perioperative therapies.

Un tumore modello murino di stress chirurgico per esplorare i meccanismi di immunosoppressione post-operatorio e valutare Novel perioperatoria Immunoterapie

Surgical resection is an essential treatment for most cancer patients, but surgery induces dysfunction in the immune system and this has been linked to ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Metodo per ottenere primarie cellule tumorali ovariche da campioni solidi

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United States. Tacrolimus is a narrow therapeutic index drug and as such requires therapeutic drug monitoring and dose adjustment based on its whole blood trough concentrations. To facilitate home therapeutic drug and adherence monitoring, the collection of dried blood spots is an attractive concept. After a finger stick, the patient collects a blood drop on filter paper at home. After the blood is dried, it is mailed to the analytical laboratory where tacrolimus is quantified using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) in combination with a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
For tacrolimus analysis, a 6-mm disc is punched from the saturated center of the blood spot. The blood spot is homogenized using a bullet blender and then proteins are precipitated with methanol/0.2 M ZnSO4 containing the internal standard D2,13C-tacrolimus. After vortexing and centrifugation, 100 &#181;l of supernatant is injected into an online extraction column and washed with 5 ml/min of 0.1 formic acid/acetonitrile (7:3, v:v) for 1 min. Hereafter, the switching valve is activated and the analytes are back-flushed onto the analytical column (and separated using a 0.1% formic acid/acetonitrile gradient). Tacrolimus is quantified in the positive multi reaction mode (MRM) using a tandem mass spectrometer.
The assay is linear from 1 to 50 ng/ml. Inter-assay variability (3.6%-6.1%) and accuracy (91.7%-101.6%) as assessed over 20 days meet acceptance criteria. Average extraction recovery is 95.5%. There are no relevant carry-over, matrix interferences and matrix effects. Tacrolimus is stable in dried blood spots at RT and at +4 &#176;C for 1 week. Extracted samples in the autosampler are stable at +4 &#176;C for at least 72 hr.

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

Quantificazione del immunosoppressore Tacrolimus su macchie di sangue secco Uso LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

A Novel Murine Model of Arteriovenous Fistula Failure: The Surgical Procedure in Detail

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the exact pathophysiology remains unknown. In order to unravel the pathophysiology a murine model of AVF-failure was developed in which the configuration of the anastomosis resembles the preferred situation in the clinical setting. A model was described in which an AVF is created by connecting the venous end of the branch of the external jugular vein to the side of the common carotid artery using interrupted sutures. At a histological level, we observed progressive stenotic intimal lesions in the venous outflow tract that is also seen in failed human AVFs. Although this procedure can be technically challenging due to the small dimensions of the animal, we were able to achieve a surgical success rate of 97% after sufficient training. The key advantage of a murine model is the availability of transgenic animals. In view of the different proposed mechanisms that are responsible for AVF failure, disabling genes that might play a role in vascular remodeling can help us to unravel the complex pathophysiology of AVF failure.

Here we present a murine model of arteriovenous fistula (AVF) failure in which a clinically relevant anastomotic configuration is incorporated. This model can be used to study the pathophysiology and to test possible therapeutic interventions.

A Novel Modello murino di fistola artero-venosa Fallimento: la procedura chirurgica in dettaglio

The arteriovenous fistula (AVF) still suffers from a high number of failures caused by insufficient remodeling and intimal hyperplasia from which the ...

A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these tumors are not easily grown in standard culture conditions. Neurosphere cultures under serum-free conditions and orthotopic xenografts have expanded the range of tumors that can be maintained. However, many types of brain tumors remain difficult to propagate or study. This is particularly true for pediatric brain tumors such as pilocytic astrocytomas and medulloblastomas. This protocol describes a system that allows primary human brain tumors to be grown in culture. This quantitative assay can be used to investigate the effect of microenvironment on tumor growth, and to test new drug therapies. This protocol describes a system where fluorescently labeled brain tumor cells are grown on an organotypic brain slice from a juvenile mouse. The response of tumor cells to drug treatments can be studied in this assay, by analyzing changes in the number of cells on the slice over time. In addition, this system can address the nature of the microenvironment that normally fosters growth of brain tumors. This brain tumor organotypic slice co-culture assay provides a propitious system for testing new drugs on human tumor cells within a brain microenvironment.

Many types of human brain tumors are localized to specific regions within the brain and are difficult to grow in culture. This protocol addresses the role of tumor microenvironment and investigates new drug treatments by analyzing fluorescent primary brain tumor cells growing in an organotypic mouse brain slice. &#160;

Un tumore cerebrale / organotipica fetta sistema di co-coltura per lo Studio microambiente tumorale e mirata terapie farmacologiche

Brain tumors are a major cause of cancer-related morbidity and mortality. Developing new therapeutics for these cancers is difficult, as many of these ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

Videomicroscopia microscopia del sistema vascolare del tumore-associati utilizzando avanzate dorsale dello Skinfold finestra Chambers su topi transgenici fluorescenti