Gli autori desiderano ringraziare Lirui Du per la costruzione del vettore pCAGAdDU e Oliver Gorka per disposizione del protocollo di fissazione.

1. La clonazione di un gene di interesse in un vettore di ingresso <ol><li> Clonare il gene di interesse in un vettore di ingresso. Amplificazione PCR del gene seguita da ligazione smussato-end in un vettore topoisomerasi-coupled (es pENTR / D-TOPO) o di restrizione enzimatica clonazione può essere utilizzato per questa procedura. </li></ol> 2. Trasferimento del gene di interesse nel pCAGAdDu destinazione Vector <ol><li> Trasferire il gene di interesse da parte del vettore di ingresso nel vettore di destinazione dalla LR ricombinazione (es. Gateway LR Clonase II Enzyme Mix). Questo creerà il vettore di espressione adenovirale (Figura 1). </li><li> Linearizzare 10 pg del vettore di espressione adenovirale in una raccolta di limitazione PacI, precipitare il DNA e risospendere in acqua ad una concentrazione di 3 mg per 100 microlitri. Linearizzazione libera le ripetizioni invertite virali (ITR), che sono necessari per la replicazione e incapsidazione del vDNA Iral in particelle virali. </li></ol> 3. Generazione del Virus lisato Primaria <ol><li> Seme 1 x 10 5 cellule HEK293A in 2 ml RPMI (DMEM, 10% FBS, 5% PenStrep) in un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti e incubare le cellule per 6-14 ore a 37 ° C in un 10% CO 2 incubatore per consentire loro di aderire. Le cellule devono quindi essere di circa il 50% di confluenza. </li><li> Lipofezione: Trasferimento 6 ml di reagente jetPEI in 94 ml di 50 mM NaCl, brevemente vortice. Aggiungere la soluzione mista di 100 pl linearizzato vettore adenovirus mentre vortex e incubare questa miscela di trasfezione per 15 - 30 min a temperatura ambiente. </li></ol> Eseguire tutti i passaggi seguenti, alle opportune condizioni di biosicurezza per l&#39;infezione da adenovirus! <ol start="3"><li> Erogare la soluzione a gocce sulla cella contenente ben HEK293A e incubare le cellule a 37 ° C e 10% di CO 2. Quando si utilizza un indicatore di fluorescenza, valutare il transfeefficienza ction visivamente dopo 12-36 ore utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito. Aggiungere 0,5 ml di mezzo fresco ogni 3 giorni. </li><li> Controllare ogni 2 - 3 giorni con un microscopio ottico a fluorescenza o per effetto citopatico (CPE), che sono le zone con le cellule allargata e arrotondata che iniziano a staccarsi. Ciò è indicativo di generazione virus efficiente. Al verificarsi di zone più ampie di CPE (Figura 3), ci vorranno 24-72 ore prima di tutte le cellule sono infettate. </li><li> Quando tutte le cellule mostrano segni di CPE, ma prima di un distacco totale di cellule avviene, staccano le cellule pipettando delicatamente e trasferire le cellule con supernatante (SN, 3-5 ml) in una provetta di polistirene da 15 ml. </li><li> Congelare le cellule nella SN in ghiaccio secco per 15 - 20 min e scongelare rapidamente a 37 ° C dopo la rottura delle cellule. Ripetere questo gelo-disgelo e-ciclo (F / TC) altre due volte. Tenere il lisato virus primario sul ghiaccio per l&#39;uso all&#39;interno di un giorno o congelarlo a -80 ° C per la conservazione a lungo termine. Qualsiasi ulteriore F/ TC ridurrà il titolo del virus del 30 - 50%. </li></ol> 4. Virus Amplificazione <ol><li> Seed e far crescere le cellule HEK293A al 90% di confluenza in un piatto di coltura 14 cm tessuto. </li><li> Infettare le cellule con la metà del lisato virus primario (1,5 - 2,5 ml) e incubare le cellule per almeno 36 ore. Quasi tutte le celle devono essere infettate poi, che può essere determinata mediante microscopia a fluorescenza. Per la ri-amplificazione di un già amplificato (cioè più concentrata) stock virus, infettare HEK293A ad una molteplicità di infezione (MOI) di 50 (vedere 6.3). </li><li> Le cellule devono essere raccolte quando tutti loro mostrano CPE, ma prima di distacco. Con la produzione di virus efficiente questo stato viene raggiunto entro 48 ore dopo l&#39;infezione. (Se ci vogliono fino a una settimana, prendere in considerazione un altro giro di amplificazione, aumentando la quantità di magazzino adenovirus usati per l&#39;infezione descritto al punto 4.2.) </li><li> Staccare le cellule pipettando dolce e cellule di trasferimento e SN in una provetta di polistirene da 50 ml. Spin celle in basso a 300 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il SN e risospendere il pellet in un opportuno volume di media o SN (ca. 1 ml). </li><li> Eseguire 3 F / TC per disturbare le cellule e centrifugare a 800 xg per 15 min a 4 ° C. Togliere il SN che contiene le particelle del virus (cioè il lisato virus concentrato), e un&#39;aliquota del lisato virus per conservarlo a -80 ° C. </li></ol> 5. Virus Titer Determinazione <ol><li> Seed 10 A549 5 cellule per pozzetto in 5 pozzetti di una 12-pozzetti in 1 ml di mezzo e lasciare che le cellule aderiscono per 6 ore. </li><li> Usare 1 ml di adenovirus concentrato (scongelati in ghiaccio) per eseguire una diluizione del siero in media (1:5.000, 1:10.000, 1:50.000, 1:100.000) e aggiungere 10 microlitri per pozzetto. Lascia un bene non infetto per regolare il gating in citometria a flusso. </li><li> Dopo 36 ore, togliere il SN, lavare con PBS e staccare le cellule (per esempio mediante tripsinizzazione). Per le precauzioni di sicurezza, si consiglia di fissare cells in 100 microlitri 4% paraformaldeide in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente e lavata con PBS contemporaneamente. </li><li> Effettuare una analisi FACS di espressione marcatore dell&#39;infezione. Plot &#39;lisato virale microlitri applicato&#39; contro il numero assoluto di cellule infette (Figura 4). Determinare il campo lineare di infezione e calcolare il titolo per ml di virus diluito dalla curva standard sopra la gamma lineare con x = 1,000 microlitri. </li></ol> 6. L&#39;infezione delle cellule T <ol><li> Isolate le cellule T CD4 naive / riposo da DO11.10 tg; topi Tg CARΔ1 utilizzando MACS (CD4 + T Naive cellulare Isolamento Kit II) o FACS ordinamento (CD4 + CD25-CD62L + CD44-). </li><li> Per gli esperimenti su piccola scala, pipettare un volume appropriato di lisato virale per ottenere una MOI di 50 in un pozzetto di una piastra 96 ​​pozzetti a fondo tondo. </li><li> Aggiungere fino a 4 x 10 5 cellule T in un volume finale di infezione di 50 microlitri in terreno cellule T (RPMI1640, 10% FBS, 5% PenStrep, 5% NaPyruvate, NEAA 1x, 1x MEM Essentialvitamina, 1x L-glutammina, 1:250.000 Mercaptoetanolo, 10 HEPES mm). Esempio: Un MOI di 50 deve essere utilizzato per infettare 3 x 10 5 cellule T; il titolo virale è 3 x 10 9 ml -1 Volume di Virus = MOI x T numero di cellule / titolo virale = 50 x (3 x 10 5) / (3 x 10 9 ml -1) = 0.005 ml </li></ol> Nota: per l&#39;infezione del numero di cellule più grandi, Scale Up utilizzando un MOI di 50 in un volume infezione di 165 microlitri per 10 6 cellule T naive in una provetta di polistirene con tazza sciolto (fino tp 3 ml per provetta). <ol start="4"><li> Incubare le cellule per 90 min a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore. </li><li> Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente, togliere SN, risospendere in 200 l di PBS. Centrifugare nuovamente e togliere SN. </li></ol> (Opzionale: le cellule possono essere nuovamente lavati per rimuovere il virus in modo più efficiente) <ol start="6"><li> Risospendere le cellulein 200 microlitri di medie cellule T senza anticorpi stimolanti e senza IL-2 o di altre citochine e riposarsi per 40 ore a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore per consentire l&#39;espressione del gene di interesse prima dell&#39;attivazione. </li></ol> 7. T cellule attivazione e polarizzazione <ol><li> Pipetta un volume di anti-CD3 e anti-CD28 perline accoppiati che è uguale al numero delle cellule (ad esempio 4 x 10 5) in una piccola tazza reagente, aggiungere il volume di 10 volte di PBS e metterle su una calamita per 2 min . Rimuovere il surnatante e risospendere le sfere in 200 microlitri di polarizzazione media (per Treg: T medie delle cellule + 1 ng / ml TGFβ, 100 U / ml di IL-2). </li></ol> Nota: Le cellule possono anche essere attivati ​​utilizzando piatti di coltura tissutale sensibilizzate con anticorpi anti-CD28 e anti-CD3, o in una forma specifica del recettore DO11.10 cellule T usando irradiati BALB / c splenociti pulsate con ovalbumina 323-339 antigene peptidico. <ol start="2"><li> Centrifuge il riposato celle di prima, togliere il SN e risospendere le cellule in 200 microlitri polarizzante terreno contenente anti-CD3 e anti-CD28-anticorpi accoppiati perline. Incubare per 72 ore a 37 ° C in 5% CO 2 incubatore senza cambiare mezzo. </li></ol> 8. T cellulare fissazione e la colorazione per Citometria a Flusso <ol><li> Lavare le cellule: Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente, togliere SN, risospendere in 200 l di PBS. Centrifugare nuovamente e togliere SN. Eseguire tutte le seguenti fasi di lavaggio di conseguenza. </li><li> Risospendere le cellule in 100 microlitri soluzione colorante cellulare morto risolvibile e incubare per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule, risospendere in 100 l di PBS, aggiungere 100 microlitri paraformaldeide al 4% in PBS, incubare 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare le cellule, li risospendere in 200 ml ghiacciata 70% di metanolo in PBS e incubare per 30 minuti in ghiaccio. </li></ol> Nota: Le celle possono essere trattati da ora in poi, senza precauzione rischio biologico!<ol start="5"><li> Preparare 60 ml master-mix di 60 microlitri di PBS + 10 mcg / ml Fc-block (anti-FCR3 per bloccare legame non specifico). Lavare le cellule, li risospendere in 40 ml di PBS + anti-FCR3 e incubare 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 20 ml di PBS + anti-FCR3 contenente 1 mg PE-accoppiato anticorpo anti-Foxp3, mescolare bene e incubare a 4 ° C durante la notte. </li><li> Lavare le cellule due volte in PBS e analizzare le cellule su un citofluorimetro. </li></ol>

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Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interessi.

Generazione Virus e titolazione Per risultati ottimali trasfezione, la qualità e la quantità di vettore linearizzato appaiono più importante. Non abbiamo osservato effetti negativi sulla produzione di lisato primaria da una crescita eccessiva iniziale della cultura in quanto l&#39;infezione procede rapidamente una volta che la produzione di virus efficiente verifica. Tuttavia, la produzione di virus dalle cellule HEK293A può essere influenzata da lunghi inserti che diminuiscono l&#39;effici...

Tregs sono cruciali per mantenere la tolleranza immunitaria e per smorzare le risposte immunitarie superamenti. Treg sopprimere l&#39;attivazione delle cellule T astanti. Di conseguenza, l&#39;ablazione del Tregs porta ad autoimmunità fatale e autodistruzione guidato da cellule T attivate 1. Treg sviluppano nel timo durante la selezione negativa dei CD4 precursori single-positive, ma possono anche differenziarsi in periferia da CD4 naive cellule T dopo stimolazione antigene a basso dosaggio con subottimale di co-stimolazione 1,2. Timica Treg sembra sopprimere l&#39;autoimmunità tessuto contro auto-antigeni, mentre periferica Treg sono stati implicati nel fornire tolleranza nell&#39;intestino o polmonari. Questi indotta Treg potentemente prevenire l&#39;attivazione delle cellule T dopo il riconoscimento di antigeni estranei nella mucosa, tra antigeni ambientali da cibo e aria, batteri commensali, e allergeni 3,4. Inoltre, Tregs sono cruciali per stabilire la tolleranza materna al peptidi fetali 5 e quello di prevent malattia del trapianto contro l&#39;ospite 6. Allo stesso tempo, Tregs anche mediare effetti indesiderati attenuando sorveglianza immunitaria delle cellule tumorali 7,8. L&#39;elemento caratterizzante Tregs è l&#39;espressione del sottoinsieme specificando-fattore di trascrizione Foxp3, un fattore di trascrizione dominio contenente forcella-testa che è necessario e sufficiente per conferire funzione 9,10 Treg. Alcune vie di segnalazione che possono indurre l&#39;espressione Foxp3 sono noti. Tuttavia, i processi molecolari che controllano, regolano o modulano Treg differenziazione in risposta al recettore delle cellule T innescando sono meno conosciuti. Tregs molto efficace può essere indotta in vitro mediante la stimolazione delle cellule T CD4 naive con anticorpi anti-CD3 e anti-CD28 in presenza di TGFβ e IL-2 11. Come l&#39;emergente Treg sono funzionali in vivo, la manipolazione di molecole che promuovono la differenziazione Treg porta un enorme potenziale per il futuro therapies, per esempio, il trattamento di asma, malattia di Crohn, e trapianto 11,12. Viceversa, la modulazione terapeutica di molecole per bloccare differenziazione Treg può fornire beneficio in futuro approcci di trattamento combinato dei pazienti con tumori. Saggi in vitro hanno differenziazione state fondamentali per la descrizione delle modifiche molecolari che sono associati con T sottoinsieme differenziazione cellulare. Al momento, i tentativi sperimentali per cercare o schermo per prodotti genici che la differenziazione delle cellule T sono controllo ostacolata dal fatto che i metodi più comuni di espressione genica ectopica falliscono nelle cellule T naive. Per esempio, elettroporazione e trasduzione retrovirale sono efficaci solo in cellule T attivate. Contrariamente alle aspettative iniziali, trasduzione lentivirali, che è in genere efficace in cellule quiescenti, necessita di pre-attivazione delle cellule T naive dalle citochine 13. Inoltre, il trasferimento di cDNA o mRNA durante elettroporazionecomporta depolarizzazione della membrana plasmatica, che si conferisce caratteristiche di attivazione delle cellule T e può anche mobilizzare Ca2 + segnalazione e attivare le proteine ​​NFAT (osservazione inedito e rif. 14). Analogamente, per la trasduzione retrovirale, le cellule T naive devono essere attivati ​​per 18 - 40 hr. Durante questo tempo, la rottura della membrana nucleare nel corso della divisione cellulare si verifica e consente la successiva integrazione genomica del vettore retrovirale 15. Questi metodi non sono quindi in grado di affrontare la regolazione molecolare precoce di cellule T incontro iniziale con l&#39;antigene, che è la fase determinante di differenziazione delle cellule T helper. Trasduzione adenovirale è noto per conferire espressione genica transiente ectopica in un certo numero di tipi di cellule umane che esprimono il recettore umano Coxsackie adenovirus (CAR). Procede senza necessità di attivazione delle cellule o la progressione del ciclo cellulare. L&#39;espressione superficiale di CAR è essenziale per l&#39;attacco del virus efficiente e interiorizzazione, e l&#39;espressione transgenica della versione troncata CARΔ1 sotto una T promotore specifico delle cellule è stato trovato per rendere timociti topo e cellule T suscettibili alle infezioni adenovirale 16. È importante sottolineare che il transgene non altera sviluppo timociti o differenziazione in vitro di cellule CD4 T naive in diversi sottoinsiemi (dati non mostrati; rif 17.). Adenovirus-mediata trasduzione di cellule T è stato precedentemente utilizzato per la sovraespressione 17,18 e knock-down approcci 19,20. Le cellule T transgeniche possono essere purificati da disponibile in commercio DO11.10 tg; CARΔ1 tg (Taconic, Inc. e ref 17.). Importante, trasduzione adenovirale permette un&#39;elevata espressione di un gene di interesse in cellule T naive senza indurre segni evidenti di attivazione. Le cellule T rimangono ingenui (basso CD44, CD62L alto) e di riposo (CD25 -, CD69 -) dopo infection e può essere attivato e differenziate in Treg simili alle cellule non infette. Produzione di adenovirus ricombinanti può essere raggiunto dopo la trasfezione di cellule con plasmidi HEK293A adenovirali (Figura 1). Questi plasmidi contengono in genere il tipo di adenovirus 5 genoma umano con i geni E1 ed E3 eliminati per rendere adenovirus ricombinanti replicazione-incompetenti 21. Cellule HEK293A completano carenza di replica in quanto sono stati immortalati attraverso l&#39;integrazione stabile di adenovirus tosato 22. Dal momento che i vettori adenovirus sono di grandi dimensioni (~ 40 kb) e di conseguenza non è adatto per la tradizionale restrizione enzimatica clonazione, abbiamo impiegato il sistema Gateway. Il gene di interesse viene inizialmente clonato in un vettore voce più piccola, dal quale può essere facilmente trasferito nel vettore adenovirale destinazione tramite reazione di ricombinazione lambda (LR) 23. Abbiamo costruito la pCAGAdDu vettorecombinando il promotore CAG (pollo promotore actina e CMV enhancer), con una cassetta di espressione contenente siti di LR che fiancheggiano il procariotica CCDB selezione marcatore 24. Questa cassetta di espressione è fuso ad un sito interno ingresso ribosoma (IRES) elemento che permette coexpression dell&#39;infezione marcatore proteina fluorescente verde rafforzata eucariotica (eGFP), che è fuso ad una sequenza contenente l&#39;ormone della crescita bovina poly (A)-segnale. Abbiamo scelto le sequenze cis-regolatori CAG, poiché il prototipo promotore CMV è risultato essere altamente attivazione-dipendente e pertanto sfavorevole per l&#39;espressione genica in cellule T naive. Qui, forniamo un protocollo per efficiente in vitro Treg differenziazione e un metodo per trasdurre CD4 naive cellule T senza attivazione (Figura 2). Il metodo consente di espressione genica ectopica o abbattere CD4 precedenti differenziazione delle cellule T allo stato ingenuo. Esso consente di testare l&#39;effetto di un overexpressed gene di interesse durante le prime manifestazioni di segnalazione alla stimolazione TCR iniziale fino T impegno sottoinsieme delle cellule. Nostri esperimenti di validazione forniscono anche la base per stabilire simile all&#39;applicazione adenovirus nella differenziazione di altri sottoinsiemi T cellule quali Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, o cellule tfh.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K240020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11791020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R057S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>jetPEI</td>
			<td>Polyplus-transfection</td>
			<td>101-10N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293A Cell Line</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R705-07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A549</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-185</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353046</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 cm tissue culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>168381</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CAR&Delta;1)1Jdgr</td>
			<td>Taconic Farms</td>
			<td>Model Nr. 4285</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-094-131</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41966-052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>1502-P110704</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PenStrep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-167F</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaPyruvate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-115E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA 100x</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE13-114E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15630-056</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-7522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Essential vitamin mixture (100x)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>13-607C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 for Cell Expansion and Activation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>114-56D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-beta 1</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>240B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin S (18 x 106IE)</td>
			<td>Novartis</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L-23105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse BD Fc BlockT</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553141</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5773-82</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4427975</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480 Probes Master</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>04902343001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Roche Applied Biosystems</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adenoviral transduction of naive cd4 t cells to study treg differentiation

Cellule T regolatorie (Treg) sono essenziali per fornire la tolleranza immune da auto così come a certi antigeni estranei. Tregs può essere generato da CD4 naive cellule T in vitro con TCR-e co-stimolazione in presenza di TGFβ e IL-2. Questo porta il potenziale enorme per terapie future, tuttavia, le molecole e vie di segnalazione che la differenziazione di controllo sono in gran parte sconosciuti. Cellule T primarie possono essere manipolati attraverso l&#39;espressione genica ectopica, ma non riescono metodi comuni di indirizzare il più importante stato naif della cellula T prima del riconoscimento dell&#39;antigene primaria. Qui, forniamo un protocollo di esprimere geni ectopiche nelle cellule T CD4 naive in vitro prima di indurre la differenziazione Treg. Si applica la trasduzione con l&#39;adenovirus replica-carente e spiega la sua generazione e la produzione. L&#39;adenovirus può occupare una grande inserti (fino a 7 kb) e può essere dotato di promotori per realizzare alta e transitori Sovraespression nelle cellule T. E trasduce efficacemente le cellule T naive topo se esprimono un recettore adenovirus Coxsackie transgenico (CAR). Importante, dopo l&#39;infezione le cellule T naive rimangono (CD44 bassa, alta CD62L) e di riposo (CD25 -, CD69 -) e possono essere attivate e differenziate in Tregs simili alle cellule non infette. Così, questo metodo consente la manipolazione di cellule CD4 T differenziamento cellulare dal suo inizio. Essa assicura che l&#39;espressione genica ectopica è già in atto quando i primi eventi di segnalazione della stimolazione iniziale TCR induce cambiamenti cellulari che alla fine portano a Treg differenziazione.

Virus Produzione Per la generazione di viremia elevata, i tempi di raccolta delle cellule HEK293A nella produzione di virus primaria o amplificazione del virus è di fondamentale importanza. Rappresentativi immagini a contrasto di fase e fluorescenza con segni visivi di produzione di virus sono mostrati in Figura 3. Il CPE è stata osservata 10 giorni dopo la transfezione di cellule HEK293A con pCAGAdDu controllo vettoriale senza inserto. CPE sono caratterizzate dalla comparsa ...

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Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Adenovirale trasferimento genico nelle cellule T CD4 naive con transgenici espressione del recettore adenovirus Coxsackie permette l&#39;analisi molecolare della differenziazione delle cellule T regolatorie<em&gt; In vitro</em&gt;.

Trasduzione Adenoviral di CD4 T naive Cells allo Studio Differenziazione Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.8K Views.  Helmholtz Zentrum München. Adenovirale trasferimento genico nelle cellule T CD4 naive con transgenici espressione del recettore adenovirus Coxsackie permette l'analisi molecolare della differenziazione delle cellule T regolatorie In vitro.

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Trasduzione retrovirale di recettori delle cellule T nel topo le cellule T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Differenziazione Regia di cellule staminali pluripotenti indotte verso Linfociti T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Accelerated diabete di tipo 1 nei topi induzione trasferimento adottivo di cellule CD4 + T Cells diabetogenici

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Il trapianto di coda della pelle per studiare allogenico di cellule T CD4 risposte in topi

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Trasduzione retrovirale di cellule progenitrici del midollo osseo per generare cellule T del recettore Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis allow the spatial localization and visualization of gangliosides involved in CD4+ T cell activation, that complement expression profiling experiments such as flow cytometry, western blotting or real-time PCR. The quantification of ganglioside expression through flow cytometry and their cellular localization through microscopy can be obtained by the use of anti-ganglioside antibodies with high affinity and specificity. Nonetheless, an adequate handling of cells in suspension involves the treatment of culture plates to promote the necessary adherence required for fluorescence or confocal microscopy acquisition. In this work, we describe a protocol for determining GD3 and GD2 ganglioside expression and colocalization with the TCR during na&#239;ve CD4+ T cell activation. Also, real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells are described for the determination of the GD3 and GM2/GD2 synthase genes, demonstrating that gene analysis experiments can be performed with a low number of cells and without the need of additional low input RNA kits.

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

We describe a standard antibody staining protocol for use in microscopy to determine the membrane expression and localization of gangliosides in resting and activated human na&#239;ve CD4+ T cells. Also described are real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells that do not require additional low input RNA kits.

Preparazione di CD4<sup&gt; +</sup&gt; Le cellule T per l&#39;analisi di GD3 e GD2 Gangliosidi membrana Expression al microscopio

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Trasduzione retrovirale di cellule T helper come un approccio genetico per studiare meccanismi che controllano la loro differenziazione e funzione

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...